close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

bd000102972

код для вставкиСкачать
На правах рукописи
Нечаева Ольга Викторовна
Поиск и использование синтетических соединений
гетероциклического ряда для сохранения стабильности
популяционного состава коллекционных культур
микроорганизмов
03.00.07 - микробиология
03.00.16 - экология
Автореферат
диссертации на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
Саратов 2004
Работа выполнена в государственном образовательном учреждении выс­
шего профессионального образования Саратовский государственный универси­
тет им. Н.Г. Чернышевского
Научные руководители: доктор медицинских наук, старший научный
сотрудник Плотников Олег Петрович
кандидат биологических наук, доцент
Тихомирова Елена Ивановна
Официальные оппоненты: доктор биологических наук,
профессор Васильев Дмитрий Аркадьевич
доктор биологических наук,
Корженевич Вячеслав Исаевич
Ведущая организация: Институт биохимии и физиологии растений и
микроорганизмов Р А Н
Защита диссертации состоится « < ? / » СЖУПлЛЬи
/^ "2004 года на засе­
дании диссертационного совета Д 220.061.04 в Федеральном государственном
образовательном учреждении высшего профессионального образования «Сара­
товский государственный аграрный университет им. Н.И. Вавилова» по адресу
410005, г. Саратов, ул. Соколовая, 335
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Ф Г О У В П О «Саратовский
государственный аграрный университет им. Н.И. Вавилова» по адресу 410005,
г. Саратов, ул. Соколовая, 335
Автореферат разослан
« Jti^ »
tCft^Hfu^fh^
2004 г.
Ученый секретарь диссертационного совета
доктор биологических наук
7
п .^^"^
Л.В. Карпунина
^J77^
2ЛЯ9
^^£3^/3
3
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность т е м ы . Микроорганизмы являются одним из наиболее суще­
ственных компонентов биосферы. Создание и поддержание коллекций микро­
организмов как способы сохранения биоразнообразия является актуальной эко­
логической проблемой. В настоящее время хранение микроорганизмов в жиз­
неспособном состоянии осуществляется в коллекциях культур, которые созда­
ются в большинстве микробиологических лабораторий и на биотехнологиче­
ских производствах и используются как в промышленных, так и в исследова­
тельских целях. Главной задачей консервации микроорганизмов является обес­
печение их долгосрочного хранения с подержанием высокой жизнеспособ1юсти
и предупреждением мутационных изменений, то есть в состоянии максимально
близком к естественному (Литвин, Гинцбург, 1998).
В основе всех методов консервации, предлагаемых на сегодняшний день,
лежит перевод клеток в состояние анабиоза, что ведет к снижению или прекра­
щению всех метаболических процессов (Сидякина, 1985). Основными метода­
ми длительного хранения микроорганизмов являются высушивание, лиофилизация, L-высушивание, хранение при низких температурах, криоконсервация,
хранение на носителях органической и неорганической природы. При консер­
вации вышеизложенными методами клетки подвергаются действию экологиче­
ских факторов абиотической природы. Так высушивание приводит к потере
биологически активной воды, при криоконсервации и низкотемпературном за­
мораживании клетки претерпевают действие замораживания - оттаивания. В
процессе лиофилизации микроорганизмы подвергаются воздействию отрица­
тельных температур и вакуума. В результате перечисленных процессов проис­
ходит гибель части клеточной популяции. Еще одной из причин гибели микро­
организмов является окислительный стресс, в результате которого образуются
активные формы кислорода, которые оказывают губительное действие на клет­
ки (Фатеева, 1983). Поэтому совершенствование методов консервации является
.- ' > ' - -i'^Ц/lWH^v^в•t;,|| \
\
I
'>*'Ь,^»М)Тй(|(л
^^'■щ*п*
fKltPVL.
4
актуальной проблемой в прикладной микробиологии (Осадчая, Кудрявцев,
Сафронова, 2002).
Инактивация микроорганизмами активных форм кислорода достигается с
помощью собственных антиокислительных систем, в результате чего содержа­
ние продуктов свободнорадикального окисления находится на крайне низком
уровне (Куликов и др., 1995). Результаты исследований показали, что фермен­
ты, обеспечивающие защиту клеток от окислительного стресса, локализуются
преимущественно на наружной мембране, в цитоплаз.ме микроорганизмов, а
также обнаруживаются во фракции периплазмы (Дробков, Погорельский, Дармов, 1997; Брюханов, Тауэр, Нетрусов, 2002).
В последнее время появилось большое количество синтетических антиоксидантов - веществ различной химической природы, обладающих антиокисли­
тельными свойствами. Одним из перспективных направлений использования
этих соединений является применение их в составе сред стабилизации при кон­
сервации микроорганизмов, так как некоторые высокоэффективные синтетиче­
ские антиоксиданты оказывают выраженное защитное действие и стабилизи­
руют состав популяции (Плотников, Шведун, Гусева, 1995; Липатова, Сотни­
ков, Федотова, 1995).
Однако на настоящий момент механизмы взаимодействия антиоксидантов
с бактериальной клеткой изучены недостаточно, в частности, нами не обнару­
жены в литературе данные о локализации синтетических a^^тиoкcидaнтoв в бак­
териальных клетках. Практически отсутствуют сведения о компенсации синте­
тическими антиоксидантами собственных антиокислительных ферментов при
стрессовом воздействии на микробные популяции абиотических экологических
факторов.
Цель и задачи исследования. Цель работы заключалась в поиске и отборе
синтезированных гетероциклических соединений и их предшественников с антиоксидантной активностью и применении их для поддержания стабильности
популяционного состава коллекционных культур микроорганизмов на фоне
действия абиотических экологических факторов.
5
Для реализации указанной цели были поставлены и решены следующие
задачи:
1 Изучить биологическую активность новых синтетических веществ группы
гетероциклических соединений и их предшественников с целью отбора пер­
спективных антиоксидантов.
2. Определить влияние отобранных синтетических антиоксидантов на стабили­
зацию свойств исследуемых популяций бактерий на фоне действия экологи­
ческих факторов абиотической природы.
.3. Выявить взаимоотношение синтетических антиоксидантов нового ряда с
собственными аитиокислительными ферментами бактериальных клеток.
4. Установить морфологические изменения в бактериальных клетках при дей­
ствии различных экологических факторов абиотической природы в сравни­
тельном аспекте с при.менением отобранных синтетических антиоксидантов.
5. Изучить влияние синтетических антиоксидантов нового ряда на электропо­
верхностные свойства бактерий и определить их локализацию.
Научная новизна. Впервые была изучена биологическая активность новых
синтетических веществ группы гетероциклических соединений и их предшест­
венников и отобраны перспективные ант иоксиданты для практического приме­
нения. Показана высокая эффективность применения синтетических антиокси­
дантов нового класса для стабилизации свойств популяции и увеличения сро­
ков хранения бактерий в процессе консервации (лиофилизации), а также повы­
шение жизнеспособности грамположительных и грамотрицатсльных бактерий
на фоне действия других абиотических факторов (замораживание-оттаивание,
ультрафиолетовое излучение). Установлены морфологические изменения в
бактериальных клетках при действии различных экологических факторов абио­
тической природы и сохранение структуры бактерий при использовании ото­
бранных синтетических антиоксидантов.
Впервые установлено влияние синтетических антиоксидантов на электропо­
верхностные свойства бактерий и отдельные структуры бактериальных клеюк
6
и
показана локализация синтетических веществ на примере таллийорганиче-
ских соединений, обладающих антиоксидантной активностью.
Полученные нами данные об изменениях, происходящих в процессе перево­
да микроорганизмов в состояние анабиоза, позволяют углубить знания о меха­
низмах выживания бактериальных клеток в экстремальных условиях.
Практическая значимость. Изученные и отобранные нами синтетические
антиоксиданты предложены как дополнительные компоненты сред заишты, и в
дальнейшем могут быгь использованы для поддержания стабильности популяционного состава бактерий и повышения их выживаемости в условиях стресса,
вызванного действием различных абиотических факторов. Применение разра­
ботанного нами методического подхода позволит оптимизировать процедуру
поддержания специализированных национальных коллекций, повысить эффек­
тивность, безопасность и экономичность их функционирования.
На основании полученных данных разработаны методические рекоменда­
ции для студентов, аспирантов и сотрудников микробиологических лаборато­
рий «Методы отбора синтетических антиоксидантов для поддержания коллек­
ционных культур микроорганизмов», утвержденные Ученым советом биологи­
ческого факультета С Г У (протокол № 9 от 12.04.04 г.).
Полученные нами данные о влиянии синтетических антиоксидантов на
собственные антиокислительные системы бактерий и электроповерхностные
свойства клеток используются в учебном процессе при чтении общих курсов
микробиологии и биотехнологии, а также в специальных курсах при подютовке
специалистов-микробиологов
в Саратовском государственном университете
им. Н.Г. Чернышевского.
Основные положения, выносимые на защиту:
1 Синтезированные соединения нового ряда группы гетероциклических со­
единений и их предшественников, обладающие низкой антифаговой и высо­
кой антиоксидантной активностью, могут быть успешно использованы для
повышения жизнеспособности и стабилизации свойств популяций коллек-
7
ционных культур микроорганизмов на фоне стрессовых воздействий раз­
личных абиотических факторов.
2. Взаимодействие новых синтетических антиоксидантов циклического ряда с
бактериальными клетками ведет к изменению уровня собственных анти­
окислительных ферментов, отражающих стабильность состава популяции.
.3. Синтетические антиоксиданты нового ряда из группы гетероциклических
соединений и их предшественников, локализуясь на поверхности бактери­
альных клеток, влияют на их электроповерхностные свойства и повышают
целостность мембранных и внутриклеточных структур при стрессовом дей­
ствии различных абиотических факторов.
Апробация работы. Материалы диссертации доложены и представлены на
региональной научной конференции «Молодежь и наука на пороге X X I века»
(Саратов, 1998 г), X X V I межвузовской научно-практической конференции по
проблемам биологии и медицинской паразитологии, посвященная памяти ака­
демика Е.Н. Павловского (Санкт-Петербург, 1999), научной конференции у ч ­
реждений по борьбе и изучению природно-очаговых инфекций Министерства
Здоровья и Социальной Защиты (Улан-Батор, Монголия, 1999) и симпозиуме
«Свободные радикалы в биологии и медицине» (Лодзь, Польша, 2000).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 12 работ.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзо­
ра литературы, экспериментальной части, состоящей из 4 глав, заключения, вы­
водов и списка 174 использованных литературных источников. Работа изложе­
на на 143 страницах, включает 22 рисунка и 8 таблиц.
СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
Материалы и методы
В качестве экспериментальных моделей были использованы грамположительные и грамотрицательные микроорганизмы: представители семейства Епterobacteriaceae - Yersinia pestis E V Н И И Э Г , Escherichia coli В, Escherichia coli
8
58, семейства Micrococcaceae - Staphylococcus aureus 209-P, a также бактериофаг
кишечной палочки Т4. Штаммы Ypestis EV Н И И Э Г , Е соИ В и бактериофаг ки­
шечной палочки Т4 получены из Г К П Б «Микроб», г.Саратов, штаммы Е соП 58 и
S aureus 209-Р - из коллекции кафедры микробиологии и физиологии растений
С Г У им. Н.Г. Чернышевского.
Исследуемые соединения, представленные кислородсодержащими гетероциклами, конденсированными дигидропиридинами и пиридинами, цикличе­
скими конденсированными пиранами и тиопиранами, кетонами, селенорганическими и таллийорганическими соединения, конденсированными замещенны­
ми диазобицикло-нондиенами и комплексом меди с органическими лигандами,
были синтезированы на кафедре органической и биоорганической химии и
Н И И химии Саратовского государственного Университета, а также в Техноло­
гическом институте Саратовского Государственного Технического Универси­
тета (г. Энгельс).
Перед изложением материалов и методов по изучению влияния синтетиче­
ских антиоксидантов (АО) на бактериальные клетки в работе представлены
краткие и полные названия исследованных соединений.
Изучение биологической активности соединений проводили в два этапа:
определение антифаговой и антиоксидантной активности.
Исследование антифаговой активности веществ проводили в системе бак­
териофага Т4 - штамм Escherichia co/i В (Фонштейн, Сурайкина, Таль, 1975).
Антиоксидантную активность синтезированных соединений определяли на хемилюминометре в системе свободнорадикального окисления, инициированного
перекисью водорода в растворе нормальной лошадиной сыворотки (Архипова,
1988).
Консервацию бактерий проводили методом лиофильного высушивания на
коллекторном аппарате системы К.Е. Долинова (Инструкция по лиофильному
высушиванию..., 1979). Определение продолжительности хранения лиофилизированных препаратов бактерий проводили по методике ускоренного опреде-
9
ления сроков хранения вакцинного штамма чумного микроба (Методика опре­
деления термостабильности..., 1985).
Влияние синтетических антиоксидантов на выживаемость фамотрицательных и грамположительных микроорганизмов оценивали по % выживаемо­
сти клеток, подвергшихся воздействию стрессовых факторов.
Действие синтетических антиоксидантов на собственные антиокислитель­
ные ферменты бактериальных клеток исследовали в несколько этапов: а) белок
в клетках определяли по методу Лоури (Lowry et al., 1951) в модификации
Markwell et al. (1978); б) активность супероксиддисмутазы (СОД) определяли в
тесте изменения интенсивности окрашивания исследуемых образцов (Beyer,
Fridovich, 1987); в) определение продуктов окисления липидов (гидропереки­
сей) проводили при помощи цветной реакции с тиоционатом аммония (Summer,
1943).
Подготовку материала для электронно-микроскопического исследования
морфологических изменений бактериальных клеток в условиях стресса прово­
дили по методике (Spurr, 1965; Reynolds, 1963) Ультратонкие срезы просмат­
ривали на электронных микроскопах
JEM-7A (Япония) при ускоряющем на­
пряжении 80 kV и Hitachi HU-12A (Япония) при 75 kV.
Действие синтетических А О на клеточную поверхность бактериальных
клеток оценивали по изменению электроповерхностных свойств методом элек­
трофореза в свободном потоке ( Э Ф С П ) (Малайцев, Богзакова, 1977).
Для определения локализации антиоксидантов на бактериальной клетке
использовали таллийорганические соединения, обладающие антиоксидантной
активностью. Просмотр негативно окрашенных препаратов осуществляли на
электронном микроскопе J E M - 7А (Япония) при ускоряющем напряжении 80
kV.
Результаты и обсуждение
На первом этапе работы нами Оыпа изучена биологическая активность 40
гетероциклических соединений и их предшественников, которая включала в
себя изучение их антифаговой и АО-активности (табл. | ) . Полученные резуль-
10
таты позволили нам разделить тестированные вещества по действию на бакте­
риофаг Т4 на несколько групп: 1. оказывающие токсическое действие - выжи­
ваемость бактериофага ниже 0,1 % ; 2. оказывающие ипактивирующее действие
- выживаемость от 0,1 до 10 % ; 3. оказывающие ингибирующее действие в раз­
личной степени - умеренное: выживаемость от 10% до 30%, слабоингибирующее - от 30 до 90%; 4. индифферентные соединения - выживаемость от 90 до
100%. Перечисленные группы характеризовали уровень биологической агрес­
сии ( Б А ) различных соединений, который можно рассматривать как БА* (вы­
живаемость фага стремится к нулю) и БА' (выживаемость фага стремится к
100%).
Установлено, что наименьшей антифаговой активностью обладали диоксикумарин, ацетамидокумарин, 6,7-диоксикумарин, тетрагидротио-хромен, метоксифенил-гексогидрохинолин, циклог ександион, диметилцикло-гександион,
дифенил-тетрагидрохромен, оксотетрагидротиохромен, 13Г, а максимальной
антиоксидантной активностью - ацетамидокумарин, окси-тиохромен, тетрагидротиохромен, ме гоксифенил-гексогидрохинолин, диметил-фенил-гексагидрохинолин,
диметилциклогександион,
дифенил-гексагидрохинолин, диметил-
дифенил-тетрагидрохинолин, 2Г, 13Г.
Нами была проанализирована взаимосвязь между биологической активно­
стью исследуемых соединений и особенностями их химической структуры.
Анализ полученных данных показал, что антифаговая и антиоксидантная
активность соединений определяется структурой не только основного кольца
гетероцикла, но и боковых радикалов. Среди исследованных кислород-, азот- и
серусодержащих гетероциклов большинство соединений относились к группам
со слабоингибирующим или индифферентным действием на бактериофаг.
При введении в структуру основного кольца гетероцикла кислорода проис­
ходило усиление антифаговой активности синтезированных веществ: 7 5 % ки­
слородсодержащих и все исследованные азот- и серу- кислородсодержащие со­
единения проявили высокую антифаговую активность.
II
Таблица
Биологическая активность исследуемых соединений
N п/п
1
1.
' Код вещества
,
;
2
1Г
2.
1
2Г
5.
1
5Г
3.
4.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
18.
19.
20.
21.
22.
23.
24.
25.
26.
27.
28.
'
ЗГ
4Г
6Г
7Г
8Г
9Г
ЮГ
ИГ
12Г
13Г
14Г
Метил кумарин
Диоксикумарин
Карбоксикумарин
А цетам и докумарин
7-Оксикумарин
7,8-Диоксикумарин
6,7-Диоксикумарин
6-Оксикумарин
Дифенил-тетрагидрохромен
Тетрагидрохромен
Окситиохромен
Триметилтетрагидротиохромен
Тетрагидротиохромен
Оксотетрагидротиохромен
Выживание бакте­
риофага, %
(М±т)
3
37,0 ±0,5*
3,0 ± 0,7*
0,04 ± 0,006*
0,2 ±0,05*
0,4 ± 0,03*
8,0 ± 0,6*
44,0 ± 0,5*
0,6 ± 0,05*
<0,006
<0,005
0,02 ± 0,005
0,05 ± 0,004*
76,0 ± 1,5*
0,7 ± 0 , 1 *
66,0 ± 3,4*
82,0 ±3,8*
0
Антиоксидантная
активность, у.е.
(М±т)
4
1,75 ±0,5*
2,2 ± 0,7*
1,74 ±0,2*
1,69 ± 0 , 1 *
1,32 ± 0 , 1 *
2,00 ± 0,2*
1,27 ± 0,2*
1,40 ±0,05*
1,50 ±0,15*
1,60 ±0,2*
1,58 ±0,3*
1,64 ±0,2*
2,81 ±0,4*
1,35 ± 0 , 1 *
0,86 ± 0,03*
0,26 ± 0,04*
НО
55,0 ±1,2*
1,90 ±0,06*
41,0± 1,9*
59,0 ±3,9*
НО
НО
108,0 ±5,04*
1,34 ±0,04*
62,0 ± 2,5*
81,0 ±2,7*
НО
1,95 ±0,05*
0,5 ±0,04*
НО
61,0±3,1*
63,0 ±1,05*
2,03 ±0,13*
2,15 ±0,08*
72,0 ±1,9*
2,30 ±0,25*
78,0 + 2,1*
1,76 ±0,17*
12
1
29.
30.
31.
2
Гексагидрохинолин
Нитрофенилгексагидрохинолин
Метоксифенилгексагидрохинолин
3
71,0 ±1,7*
4
1,20 ±0,05*
37,0 ±0,5*
0,20 ± 0,03*
77,0 ±2,3*
2,90 ± 0 , 1 *
32.
2,41 ± 0,03*
Диметил-фенил33,0 ±1,2*
гексагидроХинолин
33.
2,83 ± 0,09*
3,06 ±0,15*
Дифенил-гексагидрохинолин
34.
4,30 ±0,05*
Диметил-дифе59± 1,3*
н ил-тетрагидрохинолин
35.
2,77 ± 0,08*
Диметилцикло104,0 ±2,9*
гександион
36.
Циклогексан97 ± 2,4*
1,71 ±0,03*
дион
37.
Хлорцинкат се0
НО
ленопириллия
Диметил38.
61 ±1,03*
но
нондиен
39.
1,64 ± 0 , 1 *
Диметил-нитро58 ± 1,5*
фенил-нондиен
40.
Комплекс меди
0
0,85 ± 0,04*
Примечание: НО - не определяли, * - наличие достоверности при уровне
значимости р < 0,05 по отношению к контролю.
Антиоксидантная активность этих соединений также зависела от их струк­
туры. Токсичными для бактериофага Т4 явились селен- и медьсодержащие со­
единения. Слабыми А О оказались изученные классы талийорганических соеди­
нений.
При изучении влияния синтетических А О на собственные антиокислитель­
ные ферменты бактериальных клеток были исследованы основной фермент ан­
тиокислительной защиты - СОД, а также продукты окисления - гидроперекиси.
13
Были испытаны диметилциклогександиои, дифенил-гексагидрохинолин и диметил-дифенил-тетрагидрохинолин - вещества, которые, характеризуясь раз­
личным действием на бактериофаг Т4, обладали высокой А О активностью.
При внесении синтетических А О в образец уровень основного фермента
защиты бактериальных клеток от активных форм кислорода ( А Ф К ) - СОД- сни­
жался в 1,5 ± 0,1 раза и не зависел от типа АО. Это свидетельствовало о ком­
пенсации синтетическими А О функции собственной системы защиты бактери­
альной клетки. Высокой оказалась разница в количестве гидроперекисей, опре­
деляющих уровень окисления липидов, которые являются основной мишенью
бактериальной
клетки
при
действии
АФК.
При
внесении
дифенил-
гексагидрохинолина и диметилциклогександиона уровень гидроперекисей со­
ставил 1,0 ± 0,05, а для диметил-дифенил-тетрагидрохинолина 2,0 ± 0,1. Очеви­
ден факт большой разницы уровня опытных образцов по сравнению с контро­
лем (7,5 ± 0,3): в 3,7 - 7 раз.
Полученные экспериментальные данные показали, что влияние синтетиче­
ских А О заключается в их компенсаторном действии наряду с собственными
антиокислительными системами, направленном на нейтрализацию А Ф К раз­
личного типа, которые присутствуют при стрессовой ситуации, вызванной дей­
ствием абиотических факторов в процессе лиофилизации.
Для изучения роли синтетических антиоксидантов в защите грамположительных и фамотрицательных бактериальных клеток при различных стрессо­
вых воздействиях абиотических факторов использовали диметилциклогексан­
диои.
В
качестве
стрессовых
факторов
были
выбраны
замораживание-
оттаивание (действие температуры -18 "С в течение 1 часа и 1 суток) и дейст­
вие У Ф излучения (режимы облучения 1 и 5 минут).
Анализ полученных данных свидетельствует о том, что циклогександион
повышает жизнеспособность микроорганизмов в условиях стресса. Так в усло­
виях действия У Ф излучения обработка клеток АО приводила к
повышению
выживаемости Е соП 58 в 1,4 - 2,9 раз (в зависимости от длительности действия
стрессового фактора), а 5 aureus 209 Р в 1,9 раз по сравнению с контролем. При
14
воздействии низких температур выживаемость Е. соИ возрастала в 4,1 - 8,5 раз,
а 5 aureus - в 4,4-6,8 раз (соответственно длительности действия) по сравне­
нию с контролем (рис 1).
Следующим этапом выявления положительного влияния исследхемых ве­
ществ на сохранение стабильности популяционного состава коллекционных
культур бактерий, находящихся в условиях стресса, вызванного абиотическими
факторами, проводилось лиофильное высушивание вакцинного штамма Y pestis E V НИИЭГ. Нами было отобрано 3 соединения, относящихся к различным
химическим классам: ацетамидокумарин, тетрагидротиохромен и метоксифенил-гексогидрохинолин, в которых сочетались низкая биологическая агрессия и
высокая антиоксидантная активность. Результаты по влиянию сред стабилиза­
ции, содержащих новые классы АО, на сроки хранения вакцинного штамма Y
pestis RV Н И И Э Г в лиофилизированном состоянии показали, что сроки хране­
ния бактериальных клеток увеличивались в 1,1 - 3,9 раза по сравнению с кон­
тролем.
При
изучении
изменения
ультраструктуры
бактериальных
клеток
Y. pestis E V Н И И Э Г были изготовлены ультратонкие срезы контрольных и
опытных образцов на каждом этапе лиофилизации.
Изучение исходной культуры Y pestis E V Н И И Э Г показагю, что большин­
ство клеток имело характерные для чумного микроба какморфологические
(длина клетки 1,5-2,0 мкм, ширина 0,5 мкм), так и ультраструктурные образо­
вания: трехконтурную внешнюю мембрану толщиной 9 нм (два электронноплотных слоя, а между ними электроннопрозрачный). Содержимое цитоплазмы
было представлено электронноплотным материалом с включенными рибосома­
ми диаметром 20 нм и фибриллярными структурами, между которыми диффузно расположена электроннопрозрачная зона нуклеоида. В клетках, подвергших­
ся действию вакуума в условиях низкой температуры (-70 °С) в течение 2 часов,
нуклеоид занимал центральную часть клетки, и в нем просматривалась сетка,
состоящая из фибриллярных структур с электронноплотными включениями не­
правильной формы В некоторых клетках цитоплазма, окружающая нуклеоид.
15
имела высокую электронную плотность. Здесь же обнаруживались разрушен­
ные клетки, у которых наблюдался выход цитоплазмы (рис. 2).
20
е
в) 3S
„ 18
о
S
d14
о
I 16
S 25
i 12
г
I 10
Экспериментальные модели
I Контроль
а S aureus + ДМСО а S aureus* АО
Экспериментальные модели
I Контроль а Е coll *ДМСО а Е coll + АО
Рис. 1. Влияние Д М С О и диметилциклогександиона ( А О ) на выживаемость
клеток Е coli 58 и 5 aureus 209 Р при стрессовом воздействии «замораживания
- оттаивания»
При
исследовании
препаратов
с
добавлением
метоксифенил-
гексагидрохинолина было выявлено, что в опытных образцах, по сравнению с
контролем, после лиофилизации наблюдалось большее число неповрежденных
клеток, сохранение тонких структур (нуклеоида, рибосом и мембранного аппа­
рата) (рис 3). Это свидетельствовало о преимуществе использования новых ти­
пов А О в составе сред защиты в процессе лиофилизации коллекционных штам­
мов микроорганизмов.
Воздействие веществ на клеточную поверхность бактерий определяли по
изменению электроповерхностных свойств опытных клеток относительно электрофоретической подвижности ( Э Ф П ) клеток, инкубированных с диметилсульфоксидом ( Д М С О ) , с использованием Э Ф С П .
16
.Ji
Рис. 2 Электронная микрофотогра­
фия клеток вакцинного штамма
Y pestis EV Н И И Э Г (ультратонкий
срез) после 2 часов высушивания в
углекислоте (X 70000)
Рис З Электронная микрофото­
графия клеток вакцинного штамма
) peslis E V Н И И Э Г (\льтратонкий
cpei)- лиофилизированных с до­
бавлением метоксифенилгексагидрохинолина (X 70000). Р - рибосо.мальный аппарат. Ц М - цитопла!матическая мембрана. Н - т к л с о ид. В М - внешняя мембрана
На рис. 4 представлено электрофоретическое распределение чистой куль­
туры Ypestis E V Н И И Э Г и клеток, обработанных ДМСО. Пик выхода клеток
чистой культуры наблюдался в 42 фракции, а клеток, обработанных Д М С О - в
39 фракции, то есть они характеризовались более высокой Э Ф П по сравнению с
интактными. Следовательно, обработка клеток Д М С О приводила к уменьше­
нию абсолютной величины суммарного отрицательного заряда клеточной по­
верхности, что свидетельствовало о локализации Д М С О на наружной мембране
чумного микроба Возможно, что изменение Э Ф П происходило за счет экрани­
рования ионогенных групп клеточной поверхности или внесения собственного
заряда молекулами ДМСО.
На рис. 5 представлено электрофоретическое распределение клеток Ypestis
E V Н И И Э Г , обработанных Д М С О (контроль), а в качестве опытных образцов обработанных тетрагидротиохроменом (АО 32) и диметил-нондиеном (АО 26).
Пик выхода клеток, обработанных Д М С О , наблюдался в 39 фракции, клеток,
обработанных тетрагидротиохроменом - в 41 фракции, а клеток, обработанных
диметил-нондиеном - в 40 фракции. Следовательно, обработка этими вещест-
17
вами приводила к уменьшению Э Ф П клеток относительно контроля, что свиде­
тельствовало о локализации данных АО на клеточной поверхности бактерий.
—♦— ev
N(HOMeD фоакиии!
— EV+ДМСО
Рис. 4. Распределение по Э Ф П чис­
той культуры клеток )' pe^iis E V
Н И И Э Г и клеток Ypeslis E V НИИЭ Г , обработанных Д М С О
40 41 42 43 44 45
N f номео сЬоакиии!
-EV+ДМСО - -■- -EV+26 — » . - EV+32
Рис. 5. Распределение по Э Ф П кле­
ток Y pestis E V НИИЭГ, обработан­
ных ДМСО,
диметил-нондиеном
(АО 26) и тетра-гидротиохроменом
(АО 32)
Для определения локализации А О в бактериальных клетках использовали
культуру вакцинного штамма Yersinia pestis E V Н И И Э Г , выращенную на твер­
дой питательной среде без А О (контроль) и с А О (опыт), в качес1ве которого
использовали ди-(ацегил)-таллий трифторацетат. Изучение опытных образцов
методами электронной микроскопии показало наличие в них таллийорганического соединения в виде полиморфных гранул округлой или вытянутой формы
размером 1000-5000 нм (рис 6).
Гранулы
адсорбировались на клетке, равномерно покрывая всю ее по­
верхность. В окружающем клетку пространстве наблюдалась обильная зерни­
стость из аналогичных гранул. В контрольных образцах подобных изменений
клеточной поверхности бактерий и в окружающем их пространстве не наблю­
далось (рис.7).
Рис. 7. Клетки
вакцинного
штамма У pestis E V Н И И Э Г (х 7000),
выращенные на агаре Хотгингера
(рН 7,2)
Рис. 6. Клетки вакцинного
штамма
)' pestis E V
НИИЭГ
(X 7000), выращенные на агаре Хоттингера (рН 7,2) с добавлением ТОС.
1 - гранулы ТОС, локализованные
на поверхности бактериальной клет­
ки 2 - гранулы ТОС в окружающем
клетку пространстве
Таким образом, полученные нами результаты позволяют считать перспек­
тивным использование синтетических антиоксидантов для консервации широ­
кого профиля биологических объектов; для сохранения морфологических и
биохимических характеристик вакцинных штаммов и штаммов-продуцентов
биологически активных веществ. Применение синтетических А О позволит по­
высить эффективность, безопасность и зкономичность функционирования спе­
циализированных коллекций, т.к. эти соединения увеличивают продолжитель­
ность
хранения лиофилизированных
бактерий
с
сохранением
исходных
свойств, положительно влияют на стабильность популяционного состава мик­
роорганизмов при стрессовых воздействиях. Локализуясь на клеточной поверх­
ности бактерий, синтетические А О защищают их от различных воздействий
абиотических факторов и компенсируют действие собственных антиокисли­
тельных систем клетки, инактивируя А Ф К .
19
Выводы
1. Впервые изучена биологическая активность 40 синтезированных веществ
нового ряда фуппы гетероциклических соединений и их предшественни­
ков' кислородсодержащих гетероциклов, циклических конденсированных
пиранов и тиопиранов, конденсированных дигидропиридинов и пиридинов, кетонов, конденсированных замещенных диазобииикло-нондиенов и
комплекса меди с органическим лигандом; а также селенорганического и
таллийорганических соединений. Исследованные соединения классифи­
цированы по уровню биологической агрессии и антиоксидантной актив­
ности.
2
Отобраны соединения с низким уровнем биологической агрессии и высо­
кой антиоксидантной активностью: ацетамидокумарин, тетрагидротиохромен и метоксифенил-гексагидрохинолин, введение которых в состав
стандартных сред стабилизации увеличивает сроки хранения лиофилизированных образцов бактерий по сравнению с контролем в 1,1 - 3,9 раза
при сохранении исходных свойств исследуемых популяций.
3. Показано влияние диметилциклогександиона на стабилизацию популяционного состава бактерий при экологически неблагоприятных условиях.
Выживаемость Е соП возрастала в 1,4 - 8,5 раз, а S aureus - в 1,9 - 6,8 раз
в зависимости от времени стрессового воздействия по сравнению с кон­
тролем.
4 Впервые установлена корреляция между уровнем собственных антиокис­
лительных ферментов клетки, отражающих стабильность состава популя­
ции, и синтетическими антиоксидантами: введение последних в бактери­
альную клетку приводит к снижению уровня собственных ферментов, что
свидетельствует о компенсаторной роли синтетических антиоксидантов
при защите бактериальной клетки от повреждающего действия активных
форм кислорода.
20
5. Установлено, что обработка клеток вакцинного штамма Ypestis RV НИИЭ Г синтетическими антиоксидантами различных классов и групп приво­
дит к изменению электрофоретической подвижности бактерий, что сви­
детельствует об изменении электрического заряда клеточной поверхно­
сти.
6. Выявлены морфологические изменения в популяционном составе бакте­
рий при действии различных абиотических факторов. Впервые методами
электронной микроскопии показано, что синтетические антиоксиданты в
составе сред стабилизации при лиофилизации бактерий значительно по­
вышают число клеток с сохраненными поверхностными и внутренними
структурами. Использование электронноконтрастных синтетических антиоксидантов на основе теллурита калия доказало их локализацию на по­
верхностных структурах бактериальной клетки.
СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО Т Е М Е ДИССЕРТАЦИИ
1. Новикова С В . , Плотников С П . Изучение антиоксидантных свойств цик­
лических соединений и использование их в составе сред стабилизации
при хранении бактерий в лиофилизированном состоянии / Проблемы об­
щей биологии и прикладной экологии- Сб трудов молодых ученых. С Г У
- Саратов, 1997.- Вып. 2/3. - С. 12-15.
2 Новикова С В . , Корсуков В.И., Виноградова Н.А., Попов Ю.А., Плотни­
ков С П . Определение локализации синтетических антиоксидантов в
клетках чумного микроба с использованием электрофореза в свободном
потоке / Тез. докл. регион, науч. конф. «Молодежь и наука на пороге X X I
века». С Г У - Саратов, 1998. - С. 90-91.
3. Корсуков В.Н., Гунькин И.Ф., Плотников С П . , Новикова С В . Влияние
таллийорганических соединений на электрофоретическую подвижность
бактериальной клетки / Химия для медицины и ветеринарии: Сб. науч.
трудов С Г У - Саратов, 1998. - С. 96-98.
21
4. Новикова О.В. Исследование ультраструктуры коллекционных штаммов
рода Yersinia и I ibrio в процессе лиофилизации с применением новых антиоксидантов / Матер. X X V I межвуз. науч.-нрзкт. конф. по проблемам
биологии и медицинской паразитологии, поев, памяти акаде.мика Е.Н.
Павловского: - СПб, 1999. - С. 82-83.
5. Новикова О.В., Виноградова Н.А., Плотников О.П. Биоло1Ическая актив­
ность гетероциклических соединений /Матер. X X V I межвуз. науч.-практ.
конф. по проблемам биологии и медицинской паразитологии, поев, памя­
ти академика Е.Н. Павловского: - СПб, 1999. - С. 83-84.
6. Новикова О.В., Волков Ю.П., Плотников О.П., Коннов Н.П. Изучение
ультраструктуры чумною микроба в процессе лиофилизации с примене­
нием новых типов антиоксидантов / Тез. науч. конф. учреждений по
борьбе и изучению природно-очаговых инфекций Министерства
Здоро­
вья и Социальной Защиты, Улан-Батор, Монголия, 1999. - С.265-267.
7. Плотников О П.. Новикова О.В. Роль синтетических антиоксидантов в
защите бактериальной клетки в условиях стресса в процессе лиофилиза­
ции / Тез. науч. конф. учреждений по борьбе и изучению природноочаговых инфекций Министерства
Здоровья и Социальной Зашиты,
Улан-Батор. Монюлия, 1999. - С. 269-270.
8. Plotnikov О.Р., Konnov N.P., Korsukov V.N., Gunrin I.E., Novikova O.V.,
Volkov U.P. Electron microscopy study of antioxidants interaction with bacte­
rial cells // Proc. SPIE, 2000. - V. 4224 - P. 219-222.
9. Novikova O.V , Tichomirova E.I., Plotnikov O.P., Konnov N.P., Vinogradova
N.A., Guseva I.V., Korsukov V.N. Study of interrelationship between synthetic
antioxidants and the bacterial cells //Free radicals in Biology and Medicine /
Releases of Symposium State Lodz, Poland, 2000. P. 236-241.
Ю.Новикова O B . Григорьев A.В., Виноградова H.A., Плотников О.П., Ти­
хомирова Е.И., Коннов Н.П. Применение синтетических антиоксидантов
циклического ряда при консервации бактериальных штаммов методом
22
лиофилизации. Известия С Г У . Сер. биологическая. С Г У - Саратов, 2001.
-С.148-154.
11. Korsukov V.N., Novikova O.V., Konnov N.P.. Plotnikov О.P., Popov Y u A ,
Gunrin I.F., Volkov Y P. The combination of tiie electrophoretic and electronic
microscopy methods for determination of localization of the thalliumcontaining synthetic antioxidants on the surfase of the plague microbe cells //
Saratov, Russia, October, 2001, S P E l Proc. V. 4707, P. 333-336.
12.Нечаева O.B., Тихомирова Е.И., Плотников О.П. Методы отбора синтети­
ческих антиоксидантов для поддержания коллекцио1П1ых культур микро­
организмов (методические рекомендации). - Саратов: Изд-во Сарат. ун-та,
2004. - 24 с.
Выражаю глубокую благодарность доктору биологических наук, профессору
Н.П. Коннову и кандидату технических наук Ю.П. Волкову за предоставлен­
ную возможность освоения методик и проведения электронномикроскопических исследованик!.
Подписано в печать 14.09.2004г.
Формат 60x84 1/16. Объем 1,5 печ. п. Тираж 100 экз. Заказ № ^б 7
Типография Издательства Саратовского университета
410012, г. Саратов, ул. Астраханская, 83.
РНБ Русский фонд
2006-4
23389
2 7СЕ*,ГП{
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
0
Размер файла
824 Кб
Теги
bd000102972
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа