close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

bd000103049

код для вставкиСкачать
На правах рукописи
ГРЕМЯКОВА
Татьяна Андреевна
СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ВАРИАБЕЛЬНОСТЬ
АНТИГЕНОВ Yersinia pestis и
МЕТОДОЛОГИЯ
КОНСТРУИРОВАНИЯ П Р О Т И В О Ч У М Н Ы Х
ИММУНОПРОФИЛАКТНЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ
03.00 07 - микробиология
03 00 23 - биотехнология
Автореферат ряосадгпщш
на соискание ученой степени
доктора медицинских наук
Москва - 2004
Работа вьшолнена в Федеральном государственном предприятии Государственном научном
пентре прикладной микробиологии
Научный ковсульташ^
профессор, дм н , Константин Иванович Волковой]
Официальные оппоненты:
Г Б.Смирнов, член-корреспондент РАМН, профессор, д.6 н.
Б.Н. Мишанькин, профессор, дм.н., заел деятель науки РФ
И К Мазурова, д.м я
Ведушая организация
Ставропольский противочумный научноисследовательский институт МЗ России
Защита состоится
2004 г в 10 00 на заседании диссертационного совега
Д 208 046 01 при Московском Научно-исследовательском институте эпидемиологии и микро­
биологии им Г. Н Габричевского по адресу 125212, г Москва, ул адм Макарова, д 10.
С
диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Московского Научно-
исследовательского института эпидемиологии и микробиологии им Г. Н. Габричевского
Автореферат разослан "
" января 2004 г.
Ученый секретарь дисс^пацнонного
Совета, к.бн.
^/j
""^^
_
С Ю Комбарова
^'цЯ.Ч'ЮЪ
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
АКТУАЛЬНОСТЬ
Чума является актуальной проблемой инфекционной патологии человека, реальность
угрозы которой резко возросла в связи с возможностью использования возбудителя в качестве
потенциального агента биотерроризма После событий И сентября 2001 года в Нью-Йорке
составлен список наиболее вероятных и опасных патогенов В одном ряду с возбудителями
оспы, сибирской язвы, вирусами Эбола и Марбурга отмечен чумной мшфоб Именно поэтому
вопросам защиты от биотеррроризма, в том числе разработке специфических и неспецифиче­
ских средств зашиты и профилактики особо опасных инфекций, уделяется столь пристальное
внимание За рубежом ведутся крупномасштабные разработки вакцинных препаратов нового
поколения против чумы, сибирской язвы, сапа, мелиоидоза [Anderson etal., 1996; Forsberg
et al, 1998].
Возбудитель чумы {Yersinia pesiis) - один из наиболее патогенных для человека микро­
организмов Значительная вспьпшса бубонной чумы, охватившая, по данным В О З ( W H O
Medical Bulletin, 1994), жителей 15 деревоа индийского штата Махарашта, зарегистрирована в
августе-сентябре 1994 года В (федствах массовой информации сообщается о вспышке чумы на
Мадагаскаре в марте-апреле 1998 года Спорадические случаи болезни регистрируются ежегод­
но во многих странах мира.
Применяемые в настоящее время противочумные вакцины были разработаны в 30-40-е
годы прошлого столетия В Англии, С Ш А и Дфугих западных странах используют претп>1ущественно убитые вакцины из высоковирулентного штамма Y.pestis 195Р [Butler, 1983] В России
для вакцинопрофилактики чумы в течение многих десятилетий применяется живая вакцина на
основе аттенуированного штамма Y. pestis E V Н И И Э Г [Коробкова, 1956]
Важньпи аспостом, требующим серьезной концептуальной проработки при определении
стратегии конструирования чумных вакцинных препаратов нового поколения, является опре­
деление целевого вакцинируемого коятинг«!та, так как подходы и препараты для плановой
вакцинации населения по эпидемиологическим показателям, очевидно, разнятся от тех, кото­
рые понадобятся при применешш Y pestis в качестве биологического оружия.
ЦЕЛЬ НАСТОЯЩЕГО ИССЛЕДОВАНИЯ
Получить структурно-функциональные характеристики белковьш ( И , рНб) и липоолигосахаридных компонентов Y. pestis, а также выявить особенности формирования протективного
иммунитета, создаваемого антигенами при различных способах их доставки и презентации.
ЗАДАЧИ ИССЛБ^ОВАНИЯ:
1,Создать колласции R специфических фагов, авирулентных и природных штаммов
Y. pestis, R вариантов энтеробактерин, R и S штаммов У pseudotubrerculosis, разработать мето­
дические приемы фагового и электрофоретического скрининга и на их основе предложить сис­
тему для изучения липоолигосахаридов (ЛОС) возбудителя чумы
2.Установить химическую структуру кора и липида А липо5глигосахаридов Y. pestis, оп­
ределить молекулярную природу их изменчивости.
3 Разработать новые и усовершенствовать имеющиеся методы иммунохимического ана­
лиза липоолигосахаридов, приемов их химической модификации и презентации, способов ист о щ а ш я и конкурентного торможения с целью изучения антигенной специфичности препара­
тов, синтезируемых клетками возбудителя чумы при различной температуре
РОС MAHH0H/Ui*u5r
вим»отекА
Ш»6Р^
4 Изучить иммунохимические и иммунобиологические свойства липоолигосахаридов
Y pestis, синтезированных в определенных условиях культивирования штаммами, которые вы­
делены из различных природных очагов
5 Создать рекомбивантные штаммы-продупенты капсульного антигена, в том числе и
штаммы аттенуированных сальмонелл, стабильно экспрессирующих И антиген in vitro и
in vivo Сконструировать молекулярные и рекомбинантяые вакцинные препараты, обладающие
способностью индуцировать защиту от чумы в ранние сроки после иммунизации
6 Изучить иммуногенность и протективность F I и рНб антигенов при использовании
различных систем доставки и презентации иммунокомпетентным клеткам.
7 Выбрать антигены чумного микроба, перспективные для последующего конструиро­
вания иммуяопрофилактических препаратов, и определить формы ях презентации
НАУЧНАЯ НОВИЗНА
Впервые выявлена взаимосвязь между чувствительностью клеток Y. pestis с разной подвидовой и географической принадлежностью к липополвсахарид (ЛПС)-специфическому фагу
FP1.
Приоритетно определение последовательности моносахаридов в коре ЛОС Y. pestis, ко­
торый по своей структуре относится к несальмонепьному типу. Показано, что в коре имеется
структурно-консервативный участок, общий для большинства изученных препаратов, и вариа­
бельный участок, структура которого меняется от штамма к штамму и зависят от температуры
культивирования бактерий ЛОС (25 ° С ) ' является гетерогенным в отношении строения олнгосахарида кора и представлен четырьмя основными гликоформами, которые отличаются при­
сутствием различных терминальных моносахаридов Установлены отличия в молекулярной
организации кора Л О С штамма Y. pestis subsp. caucasica 1146 от штаммов основного подвида
Впервые показано, что олигосахзридный участок Л О С возбудителя чумы имеет отчет­
ливо выраженную температуро- и штаммозависимую иммунохнмическую вариабельность Для
препаратов ЛОС, синтезированных при температуре 37 ° С , показана более узкая штаммовая
иммуяохимическая специфичность
Установлена таипературоопосредованная вариабельность липидаЛ возбудителя чумы,
результатом чего является измеяаше биологических свойств липоолигосахаридов Выявлена
связь между химической структурой липоолигосахаридов Y. pestis subsp pestis и subsp
caucasica и иммунобиологической активностью данных препаратов
Сформулирована концепция противодействоваяия возбудителя чумы запуску и функ­
ционированию механизмов ранней неспецифической резистентности млекопитающих путем
модификации липоолигосахаридов, что позволяет патогену минимизировать развитие захцитных реакций.
Впервые определена возможность конструирования мол^сулярных и рекомбинантных
вакцинных препаратов, обладающих способностью индуцировать защиту от чумы в ранние
сроки после иммунизации.
Создана коллекция аттенуированных штаммов сальмонелл, которые экспрессируют капсульный антигаг чумного микроба Установлено, что рекомбинантяые клетки аттенуирован­
ных сальмонелл, синтезирующих вативвый иммуногеняый капсульный антиген, при паренте­
ральной и оральной иммунизации способны ршдуцировать у мьппей протективный иммунитет
в отношении чумы различной степени напряженности Получены штаммы, обеспечивающие
' ЛОС (25 °С) и ЛОС (37 "С) - препараты, синтезированные в условиях [ультивирования при
TeMnqiaiype 25 °С или 37 ° С
4
защиту от высоких заражающих доз с первого дня после иммунизации (Патент Xs2046145,
приоритет от 29 07 1992)
Показано, что рНб антиген при выраженной антигенности (авторское свидетельство
№1797351, М К И G01N33/53 приоритет от 5 11 90) и важной роли в патогенезе, не обладает
протективносгью для лабораторных животных Путем термической и химической модифика­
ций антигена, сопровождавшихся изменением степени агрегации, антигенных и биологических
свойств рНб антигена, получен ряд препаратов с различным спектром иммунобиологической
активности Высокомолекулярные агрегированные нативные формы рНб антигена не обладали
протективносгью, а при совместном введении с капсульным антигеном снижали протекгивные
свойства последнего Иммунизация деполимеризованными препаратами рНб антигена индуци­
ровала у животных иммуносупрессию
ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ
Основные теоретические итоги проделанной работы заключаются в расшифровке моле­
кулярной организации липоолигосахаридов возбудителя чумы, идентификации молекулярных
основ вариабельности их углеводного и жирнокислотного состава, определении роли выяв­
ленных особенностей организации липоолигосахаридов в патогенезе заболевания и адаптации
возбудителя к существованию в различных условиях окружающей среды Вскрыт первый пласт
в изучении изменчивости липоолигосахаридов возбудителя чумы, как явления уникального,
позволяющего по-иному взглянуть на процесс взаимодействия патогена и хозяина, меняющего
общетринятую точку зрения на механизмы реализации вирулентности микроорганизмов
Определена методология конструирования иммунопрофила1сгических противочумных
препаратов, которая учитывает вариабельность основных протективяых антигетов чумного
микроба, обладающих способностью защиты от чумы в самые ранние сроки после вакцинации.
Полученные результаты способствуют более глубокому пониманию тонких молекулярных ме­
ханизмов, лежащих в основе взаимодействия возбудителя чумы с организмом хозяина, что, в
свою очередь, открывает перспективы разработки новых стратегий противодействия патогену
П Р А Ш И Ч Е С К А Я ЗНАЧИМОСТЬ
Создана КОЛЛЙЩИЯ препаратов Л О С , выделенных из различных штаммов Y.pestis,
Y. pseudotuberculosis, Y. enterocolitica, E. coli, S. Minnesota, a также их детоксифицированных
производных Полученные препараты были использованы дня изучения химической структуры
ЛОС возбудителя чумы (Институт органической химии им Н. Д. Зелинского Р А Н , Москва),
молекулярных механизмов воздействия Л О С на альвеолярные макрофаги (Институт инженер­
ной иммунологии, п Любучаны Московской обл), молекулярной организации Л О С Y. pestis и
их иммунобиологических свойств ( Г Н Ц прикладной микробиологии, п Оболенск).
Получен набор аятисывороток и создана коллекция моноклональных антител к капсульному антигену и ЛОС, используемых в Г Н Ц П М для тестирования соответствующих препаратов.
Создана коллекция штаммов-продуцентов капсульного антигжа чумного микроба. На штамм
S. minnesota R595pFSl, депонированный в РосНИПЧИ "\biKpo6" (Саратов), получен Россий­
ский патент на изобретение № 2046145. Этот штамм используется для получения высокоиммуногенных препаратов капсульного антигена
Сконструирован штамм S. typhimurium
SL3261pFSl, стабильно наследующий рекомбинантную плазмиду in vitro и in vivo Штамм ис­
пользуется для определения эффективности различных систем доставки капсульного антигена
при формировании протективного противочумного иммунитета
Изучена чувствительность к бактериофагам вирулентных и авирулентных штаммов
Y. pestis из коллекций живых культур Г Н Ц П М РосНИПЧИ «Микроб», Н И П Ч И Сибири и Даль-
него Востока, что выявило их популяционнуго гетерогенность в отношении ЛОС На основании
данных о варьировании чувствительности штаммов возбудителя чумы, изолированных в раз­
личных природных очагах, к бактериофагам, предложены дополнительные методы для внутри­
видовой дифференциации патогена
Результаты проведенных исследований послужили основой или были учтены при со­
ставлении ниже перечисленных документов
1
Методика лабораторная способа использования стандартного инокулята для проверки
ростовых качеств плотных питательных сред Утверждена 27 04 1990 зам директора В Н И И П М
проф Волковым В Я (учрежденческий уровень внедрения).
2
Методика лабораторная по усовертеясгвованию питательной среды для периодическо­
го глубинного культивирования с аэрацией в колбах вакцинного штамма чумного микроба E V
Н И И Э Г при температуре 27 ° С Утверждена 30 07 1990 зам директора В Н И И П М проф Боро­
виком Р. В
3
Методика лабораторная оценки качества жидких питательных сред с помощью референс-инокулята. Утверждена 21.05 1990 зам директора В Н И И П М проф ВолковьплВЯ
Методические приемы, разработанные в ходе работы над диссертацией, штаммыпродуценты, очищенные препараты антигенов, антисыворотки и моноклональные антитела, а
также диагностические системы в настоящее время применякггся в микробиологических, гене­
тических, молекулярно-биологических, иммунологических и других исследованиях ряда лабо­
раторий Г Н Ц П М (Оболенск), РосНИПЧИ "Микроб" (Саратов), Н Р Ш Ч И Сибири и Дальнего
Востока (Иркутск), И О Х им Н Д Зелинского Р А Н (Москва), И Б Х им М М Ш е м я к и н а и
Ю А Овчинникова Р А Н (Москва)
АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ
Материалы диссертации доложены и представлены на итоговых научных конференциях
Г о с Н И И П М (Оболенск, 1986, 1987, 1989, 1990); межведомственной научной конференции
"Актуальные вопросы профилактики опасных инфекционных заболеваний" (Киров, 1991), X I V
научно-практической конференции Г о с Н И И П М "Новые технологии и биосистемы Достиже­
ния и перспективы" (Оболенск, 1991); I V Всероссийском съезде микробиологов, эпидемиоло­
гов и паразитологов (Нижний Новгород, 1991), Российской научной конференции "Генетика и
биохимия вирулентности возбудителей особо опасных инфекций" (Волгоград, 1992), Россий­
ской научной конференции "Иммунология и специфическая профилактика особо опасных ин­
фекций" (Саратов, 1993), межгосударственной научной конференции, посвященной 100-летию
открытия возбудителя чумы "Профилактика и меры борьбы с чумой" (Алматы, 1994), I съезде
Вавиловского общества генетиков и селекционеров (Саратов, 1994), межгосударственной на­
учно-практической конференции, посвященной 100-летию открытия возбудителя чумы "Акту­
альные вопросы профилактики чумы и других инфекционных заболеваний" (Ставрополь,
1994), международной конференции "Гомеостаз и инфекционный процесс" (Саратов, 1996), 3"*
John Himiphrey Advanced Smnmer School "Cell and molecular biological aspects of immunology"
(Пущине, 1996); V I I съезде Всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и пара­
зитологов (Москва, 1997), научно-практической конференции, посвященной 100-летию обра­
зования противочумной службы России (Саратов, 1997); 4'°* конференции по бактериальной
защите (Munich), Germany, 1997), совместном Американо-Российском семинаре в U S A M R I I D
(Fort Detrick, U S A , 1997), International Workshop in the Institute for Experimental Medicine and Biosciences (Borstel, Germany, 1998); 7* International Congress on Yersinia (Nijmegcn, the Netherlands,
1998), 4* John Humphrey Advanced Summer Programme in Immunology (Пущино, 1998), 8* Interna­
tional Congress on Yersinia (Turicu, Fmland, 2002); Carbohydrate Workshop (Gustrow-Rostock,
Germany, 2003); X I I * European Carbohydrate Synqjosium (Grenoble, France, 2003); 2-ом Москов­
ском международном Конгрессе "Биотехнология' состояние и перспективы развития" (Москва,
2003),
Диссертация обсуждена и одобрена на межлабораторной научной конференции
Г Н Ц П М 5 мая 2003 г (протокол № 1)
ПУБЛИКАЦИИ
Основное содержание работы отражено в 55 научных публикациях (из которых 11 в
центральной печати и 14 в материалах международных конференций и симпозиумов), в том
числе в авторском свидетельстве на изобретение и патенте Список публикаций приводится в
конце автореферата.
О Б Ъ Е М И СТРУКТУРА Р А Б О Т Ы
Работа состоит из введения, обзора литературы в трех главах, описания собственных ис­
следований в пяти главах, включающих результаты и их обсуждение, экспериментальную часть
и заключение; выводов; списка литературы из 501 цитируемых работ Общий объем диссерта­
ции составляет 320q страниц машинописного текста Текст иллюстрирован 38 таблицами и 77
рисунками
ПОЛОЖЕНИЯ, ВЬШОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ
1 Разработанная схема типирования штаммов чумного микроба по их чувствительности к
липополисахарид-специфическому фагу FP1 дополняет внутривидовую характеристику и явля­
ется диффершцирующим критерием изолятов У. pestis
2 Температуроопосредованные композиционные и структурные различия кора и липида Л
ляпоолигосахаридов штаммов чумного микроба, изолируемых в отдельных природных очагах
России, определяют изменения их иммунобиологических свойств и вирулентности для грызу­
нов и человека
3 Предложена концепция реализации патогенности возбудителем чумы путем уклонения
микроба от неспецифических и специфических механизмов защиты хозяина, в том числе и с
помощью модификации коровой и липидной части липоолигосахаридов Y pestis
4 Разработаны новые принципы методологии и биотехнологии получения нативных и мо­
дифицированных белковых и липоолигосахаридных антигенов, плазмид, векторных штаммов
аттенуированных сальмонелл, штаммов-продуцентов, а также их презентации, которые учиты­
вают вариабельность основных протективных антигенов Y. pestis и перспективны для конст­
руирования противочумных иммуяопрофилактических препаратов нового поколения
СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
М А Т Е Р И А Л Ы И МЕТОДЫ
Ш т а м м ы бактерий. В работе использовали 105 штаммов Y pestis из коллекций живых
культур Г Н Ц П М и РосНИПЧИ «Микроб» (Саратов), Н И П Ч И Сибири и Дальнего Востока (Ир­
кутск), один штамм Y enterocolitica, четыре штамма Y. pseudotuberculosis, шесть штаммов
5 minnesota (любезно предоставлены Dr О Hoist, Германия), один штамм S. typhi, шесть
штаммов S typhimurium (любезно предоставлены Dr В Stocker, США), четьфе штамма Е. соИ
(любезно предоставлены Dr G Schmidt, Германия) R-специфические бактериофаги - FP3, F P 1 ,
С21 (любезно предоставлены Dr О Hoist, Германия)
Методы. В разделе содержится описание микробиологических методов, использован­
ных при выделении, культивировании и изучении свойств возбудителя чумы, молекулярно-
биологических методов конструирования плазмид и рекомбинантяых штаммов, биохимиче­
ских методов выделения и характеристики F I , рНб, ЛОС антигенов, химических и физичесстгх
(ядерньш магнитный резонанс (ЯМР), масс-спектрометрия) методов анализа кора и липида А
Л О С возбудителя чумы, иммунохимических и иммунобиологических методов анализа изучае­
мых соединений, а также методов определения протективности разрабатываемых вакцинных
композиций и штаммов Статистическую обработку результатов, вычисление величин ImDso
(доза вакцинного штамма, предохраняющая от гибели 50 % экспериментальных животных) и
доверительного интервала проводили по методу Kq)6epa в модификации И П Ашмарина и
А.А. Воробьева [1962] Доверительный интервал вычисляли для вероятности 95 %
Фаговый скрининг природных изолятов Y. pestis проведен совместно с О В Горшко­
вым, Ю А Поповым, О П Плотниковым, Н А Виноградовой, Е П Савостииой (РосНИПЧИ
"Микроб", Саратов), С В Балахоновым, С А Бельковой ( Н И П Ч И Сибири и Дальнего
Востока, Иркутск) Электрофоретический анализ Л О С выполняли с Р 3 Шайхутдиновой и
Т Б Кравчетко, изучение иммунобиологических свойств ЛОС - при содействии
Г М. Титаревой,
И В Бахтеевой,
Р 3 Шайхутдиновой,
С В Дентовской
(ГНЦПМ,
Оболенск) Данные по электронной микроскопии получены совместно с Е Л Жиленковым и
В М Фомченковьпи ( Г Н Ц П М , Оболенск) Анализ структурных особенностей кора и липида А
ЛОС осуществляли совместно с лабораторией углеводов И О Х им Н Д Зелинского Р А Н под
руководством
Ю А Книреля
Генно-инженерные
работы
по
конструированию
рекомбинантных штаммов проводили с А П Анисимовым, Н К Фурсовой, А П Алимовым,
В ЬЛ. Красильниковой, Л В Ремневой, плазмиды любезно предоставлены Л В Карлышевым,
П А Черепановым, А П Анисимовым ( Г Н Ц П М , Оболенск) Моноклональные антитела
получены совместно с С С Ветчининым ( Г Н Ц П М , Оболенск) Молекулярно-биологические,
иммунобиологические в протективные свойства рНб антигена, а также нативного и
серологически атипичного F I антигена и изучали совместно с В Н Степаншиной,
А П Анисимовым, О. В Коробовой, В В Амельченко, В Д Потаповым, Ю И Ковалевым,
Л В Михиной ( Г Н Ц П М , Оболенск)
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Детальные исследования факторов патогенности и иммуногенности чумного микроба
позволили установить их молекулярную организацию и начать изучение роли отдельных анти­
генов в патогенезе и иммуногенезе чумной инфекции Особую роль в реализации вирулентно­
сти Y. pestis играют секретируемые белковые компоненты К ним, в первую очередь, следует
отнести капсульный антиген, обладающий антифагонитарным действием [Burrows, 1963, Ш а ­
нина, 1967, Brubaker, 1972; Meyer, 1974, Дальвадянц, 1991а, Бывалов и др , 1994, 1997, Репу,
1997, Черепанов и д р , 1990, 1991а, Galyov й а / , 1990, 1991, Karlyshev е<а/., 1992, 1994идр],
рНб антиген - цитотоксический антяфагоцитарный белок [Ben-Efraim et al, 1961, Menigh,
Brubaker, 1993, Lindler etal, 1990, Панферцев и др , 1991, Черепанов и др , 1991], секретируе­
мые белки (Yops) и V антиген - ретулятор синтеза Yops и мощный иммуносупрессивпый анти­
ген [Вшто\У8, Bacon, 1956; Lawtone^a/, 1963, Perry е?а/, 1986, 1987; Mulder ef л / , 1989, Price
etal, 1989, Bergman eta I, 1991, Motin etal, 1992, Nakajima etal, 1995, Cornells, Walf-Watz,
1997; Cornells Йa/., 1998, Holmstrom, 1998, Brubaker, 2003 и др] Именно эти компоненты об­
разуют первую линию реагирования чумного микроба с клетками макроорганизма, результатом
чего может быть полное подавление иммунных механизмов последнего Другой компонент,
привлекающий пристальное внимание исследователей, - поверхностный липополисахаридный
или, точнее, липоолигосахаридный комплекс, играющий важную роль в температуроопосредованных изменениях клеточной стенки чумного микроба и обладающий широким спектром
8
биологических свойств, включая с одаой стороны токсичность и пирогенность, а с другой сто­
роны - способность активировать иммунную систему макрорганизма ЛОС входит в состав
всех изученных мембранш,1х компонентов чумного микроба, протективных для морских сви­
нок (ОСА, Б антиген) [Дальвадянц, 1968, Боровикова, 1972, Hartley etal, 1974, Bordet et al,
1977; Тараненко, 1985, Darveau etal, 1986; Бахрах и др , 1972, Грибоедов, Барабаш, 1985, Тараненко и др , 1985; Бьгаалов и др, 1997]
Именно эти компоненты м ы выбрали для дальнейшего изучения их молекулярной орга­
низации, иммуногенности я перспективности использования при разработке иммунопрофилактических препаратов
В последнее десятилетие значительно активизировались работы по созданию иммунопрофилактических препаратов нового поколения против чумы, лишенных недостатков сущест­
вующих вакцин При этом основные усилия сосредоточены на следующих направлениях
• оптимизация схемы вакцинации и способов презентации антигенов (использование иммуномодуляторов, антигистаминных препаратов, "упаковка" антигенов в липосомы и т д )
fAIving, Richards, 1990; Alving, 1995, Schneerson etat, 1991, Harding etal, 1992; Snider, Segal,
1987; Golding, Scott, 1995],,
• прецизионная аттенуация штаммов иерсиний [Маракулин и д р , 1992, Валенцев и д р ,
1994, Wren etal, 1994а, 19946, Guselman etal, 1996, Oyston etal, 1996, Lindlcr etal, 1990,
Панферцев я др , 1991, Portnoy, FaDcow, 1981, Кокушкин, 1983, Кутырев и др, 1989, Кутырев,
1992];
• генно-инженерное повышение продукции иммунодоминантных антигенов в аттенуированных штаммах иерсиний [Анисимов и д р , 1995, Анисимов, 1999],
• использование бактериальных векторов, не относящихся к роду Yersinia [Павлов и д р ,
1991; Никифоров и др., 1993, Learye/a/, 1994, Oyston й в / , 1995;Titbal, е?а/, 1997],
• разработка молекулярных белковых вакцин ( F I , V ) [Burrows, Baker, 1958, Lawton et al,
1963, Brubaker etal, 1985, 1987, Motin et al, 1994, Nakajma etal, 1995, Anderson etal, 1996,
Голубинский и др , 1984, Simpson et al, 1990, Andrews et al, 1996 и др] и молекулярных гликопротеиновых вакцин (иммунодоминантные белки ( F I , V ) + адьювант полисахаридной природы
(ОСА, детоксифицированный (дефосфорилированный, дезацилированный) ЛОС из Y pestis и
Y pseudotuberculosis), монофосфорилированный липид А из штаммов с Re формой Л О С и д р )
[Дальвадянц и др, 1991, Тараненко и др, 1990, Гремякова и др, 1991-1998, Вывалов и др.,
1984, 1997];
• создание ДНК-вакцин [Noll et al, 1988],
• конструирование аытиидиотипических вакцин [Давдариани и др, 1993,1997]
Традиционно в России особое место уделяется изучению протективности полисахаридных антигенов возбудителя чумы Идентифицирован и охарактеризован полисахаридный протективный антиген микробной клетки патогенных иерсиний - Б антиген По сути, Б антиген во
многом схож с ОСА, охарактеризованным С М Дальвадянцем [Дальвадянц, Дробышева, 1977,
Дальвадянц и др , 1991] Его иммуногенность изучается, но существенным недостатком данно­
го препарата, также как и ОСА, является многокомпонеитность и отсутствие полной характе­
ристики всех компонентов комплекса
Одним из перспективных компонентов для разработки противочумной вакцины нового
поколения может быть Л О С К pestis, компонент Б антигена и ОСА, детоксифицированный
дефосфорилированием или дезацилировапием Для понимания взаимодействия факторов патогенносги возбудителя чумы важны данные, свидетельствующие о том, что LcrV, один из наи­
более перспективных протективных антигенов, осуществляет свое действие путем ингибирования T N F a (tumor necrosis factor a, фактор некроза опухолей) и IFNy (Interferon I , интерферон j )
и индукции синтеза IL10 Qntcrleukin 10,интерлейкин 10), инактивируя тем самым N F - K B (фак­
тор транскрипции) [Nakajima el al, 1995; NedyaBcov etal, 1997], a также взаимодействует с
T L R s (loll-like receptors - толл-подобные макрофагальные рецепторы) ЛПС, препятствуя за­
пуску механизмов повышения неспецифической резистентности макроорганизма [ S i i ^ et al,
2002] Проблема заключается в выборе препарата ЛПС для включения его в состав вакцинных
композиций и методе детоксификации, который позволяет сохранить все его положительные
свойства
С Т Р У К Т У Р Н А Я ОРГАНИЗАЦИЯ ЛИПООЛИГОСАХАРИДОВ Y.pestis
В ходе изучения ЛОС возбудителя чумы определился круг вопросов, требующих своего
решения
♦ изменяется ли ЛОС чумного микроба при варьировании температуры культивирова­
ния клеток;
♦ соответствуют ли эти изменения тому, что происходит in vivo,
♦ зависят ли эти изменения от природы штамма
Впервые зависимость состава ЛОС от температуры выращивания клеток Y. pestis и на­
личия в них плазмид исследовал R Р Darveau с соавторами в 1983г Авторы показали, что
Л О С синтезированный клетками при температуре 37 ° С , содержит меньшее количество Kdo (3Дезокси-0-л*анно-окт-2-улозоновая кислота), а также имеет меньшее молярное соотношение
фосфат/Kdo и более высокую подвижность в SDS-PAAG [Darveau й а/, 1983,1986] Изменение
степени фосфорилирования молекул ЛОС существенным образом влияет на их токсичность,
заряд и иммунохимические свойства [Portnoy, Martiner, 1985, Ovodov, Gorshkova, 1988, Книрель. Кочетков, 1993]
В ходе исследований был проведен электрофоретический скрининг ЛОС десятков при­
родных и лабораторных штаммов различных подвидов возбудителя чумы, что позволило вы­
явить однотипные электрофоретические различия ЛОС Y. pestis subsp pestis (рис 1, треки 1, 2)
из клеток чумного микроба, выращенных при различных температурах культивирования Они
визуализировались как увеличение подвижности ЛОС, синтезированных при более высоких
температурах
1
2
Р и с у н о к ! Электрофореграмма ЛОС Y pestts 1-КМ218 (25 °С), 2- Y pesns КМ218 (37 ° С ) , 3 Y pestis EV11М (25 °С), 4 - У pesns E V I Ш , 5 -У pestis 1146 (37 "С)
ЛОС штамма Y. pestis subsp caucasica 1146 не имел отчетливых температуропосредованяых электрофоретических различий, а подвижность Л О С E V 1 1 M при обеих температурах
синтеза имела одинаковые значения и была максимальной среди всех исследованных препара-
10
тов, что отидетельствует о различиях степени редуцированности молйсулы Л О С чумного мик­
роба
Элястрофоретические различия ЛОС нашли подтверждение при изучении лизиса при­
родных изолятов Y pestis ЛПС специфическим фагом FP1 [Горшков и др., 1999; Балахонов и
др, 2001] Из данных, представленных в табл 1, следует, «тто чувствительность к литическому
действию фага зависит от природы штамма, а отсутствие лизиса при температуре 37 ° С не свя­
зано с экранированием поверхности клеток капсулой Как показали исследования с варьирова­
нием температуры культивирования клеток штамма Y pestis E V от +8 " С до +28 ° С , температу­
ра 26 "С является критической для литического действия фага FP1 Увеличение температуры
выращивания клеток вьппе 26 ° С приводило к формированию у чумных бактерий устойчивости
к литическому действию фага, а уменьшение сопровождалось повышением чувствительности
клеток к действию фага и увеличению размеров пятен лизиса Становятся понятными результа­
т ы предыдущих исследований об отсутствии изменений ЛОС возбудителя чумы, вылеяе1гаых
из клеток, которые выращивали при температуре 28 ° С и 37 °С
Таблица 1 Лизис бактериальных клеток R-специфическими бактериофагами
Штаммы
ФагРР!
ФагРРЗ
мигдюорганизмов
2S T
37 T
2S T
Е co//F470(Ra)
+
H/O
H/O
H/O
H/O
Е со//F588 (Rd,)
H/O
R/O
Е соИ F583 (Rdb)
H/O
Е соИ F515 (Re)
в/о
H/O
H/O
5 m/n«eso(aSF1112(Ra)
H/O
H/O
S. immesota S F l 127(Rb)
+
H/O
H/O
S m/nnesoM SFl 119(Rc)
+
H/O
H/O
S mitmesota SF1121(Rdi)
+
H/O
H/O
S. mnnesota SF1118(R4 )
+
H/O
H/O
S mimesola SFl 167(Rc)
r pestis EV
+
Y pestis YMllS
+
.
Y pestis YM2l%
+
Y pestis¥M2m\X)
+
Y pestis Tjiwidei
+
Y pestis Java
+
.
Y pestis W^
+
+
Y. pestis ЪЬт2р~
+
H/O
Y pestis m
+
Y pseudotuberculosis 8412 R
+
.
У pseudotuberculosis 8412 S
.
.
Y pseudotuberculosis 9532 R
+
.
Y. pseudotuberculosis 9532 S
.
H/O
Y pestis C-527
+
+
H/O
Y pestis A-llOS
+
+
H/O
Y pestis A-436
+
+
H/O
Y pestis C-533
+
H/O
Y pestis C-534
+
П р и м е ч а н и е «+» наличие лизиса, «—»отсутствие лизиса, н/о - не определяли
11
37 r
-
+
+
+
-
+
+
+
-
H/O
.
-
H/O
H/O
H/O
H/O
H/O
Изученные R варианты Y pseudotuberculosis (табл I ) обладали аналогичной основному
подвиду возбудителя чумы чувствительностью к действию фага FP1 - клетки лизировались при
температуре культивирования 25 "С и были резистентными при более высокой температуре
выращивания, что указавает на наличие общего, по крайней мере, для двух видов йерсиний Y. pestis и Y. pseudotuberculosis, механизма блока синтеза полноценного кора
При тестировании чувствительности природных вирулентных штаммов Y pestis было
выявлено, что среди основной массы штаммов, чувствительных к фагу при 25 ° С ( К pestis
subsp pestis (9 штаммов), Y. pestis subsp aitaica (15 штаммов), Y pestis subsp hissarica (7 штам­
мов)), клетки некоторых штаммов лизировались как при температуре 25 ° С , так и при темпера­
туре 37 ° С (Y pestis 1146, С-527, А-1108, А-436), обладали обратной чувствительностью
(Y pestis 231, С-533, С-534), либо демонстрировали устойчивость при обеих температурах тес­
тирования (Y pestis subsp ulegeica (4 штамма)) Прослеживается взаимосвязь между чувстви­
тельностью клеток Y pestis к фагу F P 1 , подвидовой и географической принадлежностью возбу­
дителя чумы Полученные результаты позволили предложить дополнительные критерии типирования выделяемых из различных природных очагов штаммов возбудителя чумы и явились
базой для выбора штаммов (КМ218, E V 1 1 М , КМ260 (11), 1146), с целью последующего изуче­
ния молекулярной организации ЛОС Y. pestis
Впервые был определен состав и последовательность моносахаридов в коре Л О С
Y. pestis (рис 2, табл 2), который, как выяснилось, относится к несальмонеяьному типу [Вино­
градов и др , 2002, Knirel et al, 2003]
Установлено, что в коре ЛОС Y pestis имеется структурно-консервативный участок, об­
щий для трех из изученных штаммов {Y pestis КМ260 ( И ) , КМ218, KIMD1), и вариабельный
участок, структура которого меняется и зависит от температуры культивирования бактерий
Было показано, что ЛОС (25 "С) является гетерогенным в отношении строения олигосахарида
кора и представлен четырьмя основными гликоформами, которые отличаются присутствием
различных терминальных моносахаридов. Напротив, ЛОС (37 ° С ) представлен только одной из
этих гликоформ и, таким образом, структурно значительно более гомогенен Повышение тем­
пературы культивирования оказывало неблагоприятяьй эффект на включение в состав кора
галактозы и октулозоновой кислоты ( К о )
Таблица 2 Распределение структурных вариантов олигосахаридов в ЛОС различных штаммов
К pestis с полным кором
1
Варьируемые
Мол.
к о м п о н е н т ы кора
вес
KMZIg
25 »C 37-C
а
Н
Р-С5а1
p-GlcNAc
1341 43
+-(-
b
а-Ко
3-Gal
P-GkNAc
1577 48
++
Н
a-DDHep
p-GlcNAc
1371.44
а-Ко
p-GlcNAc
1607 49
++
ге-ооНф
Н
с
d
Н
p-GlcNAc
1179 38
Н
p-GIcNAc
1415 43
g
а-Ко
Н
P-Gal
H
1138.36
h
а-Ко
P-Gal
H
1374 40
f
i
Н
a-DDHq)
H
1168 35
a-DDHq)
H
+
а-Ко
1404 4 1
Н
H
976 30
H
1212 35
f
J
к
1
Н
о-Ко
Н
±
++
+
+
+
-b
+
+
±
-H-
е
1146
25 ° C 37-C
•H-
+
++
+
KIMDl
25 «C 37 " C
+
++
++
+
+
++
++
++
Ч
++
+
+
++
+
+
++
-H-
+
12
KM260
37 «C
25 " C
■H-
+
■H-
+h
+
Д О С (25 ° С ) У. pestis КМ218, К М 2 6 0 и КДУИ)!
^ - D - OlcpNAc - ( l - » 3 ) - L - a - D - H e p p - (1 -♦ 3)--t-- в - D 7
1
(!-»
4
4
т
t
р-Ь-ОЛр
Нер/> -(!-► 3 ) - K d o
Т
2
1
a - Kdo/)
^ - D - Olc^
7)-L-a-D-Hepp
^ - D - OlcpNAc - ( l - > 3 ) - L - o - D - H c | i ; > -- 0 ^ 3 ) ' L- - a - D - Hepp --d -» 5) - Kdo
4
4
7
t
T
D - o - D - H e p p - O - » 7)-t-a-D-H4>/>
0-D-
OlcpttM
-» 3)
- ( l - » 3 ) - L - i i - D - H 4 > p -0
7
L- e - D - Hep p -(1
4
1
1
^.D-Gdp-(l->7)-L-a-D-Hcpp
GlcpNAi! - ( l - > 3 ) - L - a - D - H q i p -- ( I
Kilo
4
t
or -Kop
-►3) -t-- a - D - Hep p -(!-» 3 ) - K 4 .
4
r
4
t
1
t
1
D -a-D-Hq>p-(I-» 7 ) . L - e - D - H e p p
2
/» - D - СЛср
ЛОС (37 " Q К ;)еяю KM218, KM260 н K I M D l
^ - D - OlcpNAc - ( l - » 3 ) - L - < l - D - H 4 ) p - ( l - * 3) - I. - о - D
t
ЛОС
->5)
2
^-D-Gkp
7
D
2
a - КЛор
t
t
/l-D-
T
1
/J - D - Clop
Hepp
a -Ко/J
(1
t
1
p - (1 -» 7) L - о ■ D - Hep p
or - D - Hep
1
Л - D - Olcp
-» s) -Kdo
t
2
a - Kdop
(гбоакрм/вхмб
^ - D - Olcj>NAi: - ( ) - » 3 ) - L - < z - D -Исрр- - ( l - > 3 ) - L- ' a - D - Hepp- ( 1 - . 3 ) - -Kdo
7
4
^-D-Od/<-{l-»7)-L-a
D
Д - D -Glcp
-0
7
~*3)-- L
t
^(i^
-(l->3)-L-o-D-Hepp7
Kdop
t
аЛр - (1 -» 7) - L • or . D - Hopp
Л О С (37 ° C ) к pestis 1146
2
a
. or _ D - Hepp- ( l - > 5 ) - K d o
4
4
1
fi-D-OlcpNAc
T
1
Hepp
^r ^ D - OtopNAi; - ( l - « 3 ) - L - a - D - H c p p
fl-D-
4
t
t
/I - D - Gfcp
3)-- L --a-
D - H e p p - (1
4
T
T
T
2
e -Ко/)
-»5 ) - K d o
4
t
2
L-e-D-H«pp
fl-D-
Glcp
or-Kdo/>
Рисунок 2 Структуры основных гликоформ кора в ЛОС (25 ° С ) и ЛОС (37 ° С ) штаммов
Y. pestis КМ218, КМ260 и KTMOl, 1146 Обе основные гликоформы кора ЛОС (25 "С) штамма
1146 содержат глицин в неизвестном положении.
13
Нам удалось установить молекулярную природу отличий кора ЛОС представителя под­
вида caucasira, У pestis 1146, от ЛОС подвида pes/ir Наиболее значимое отличие заключалось
в отсутствии О-глицеро-а-п-манно-гептозы (DDHep) в ЛОС У pcsus 1146 и замене ее при тем­
пературе 37 ° С на Gal (Galactose, галактоза) Дополнительная гетерогенность и отличительная
черта данного штамма связана с наличием глицина в ЛОС Y pestis 1146, выращенного при
температуре ° 25 ° С , но не 37 ° С , причем включение глицина зависит не только от температуры
культивирования, но и от состава питательной среды Дальнейшего выяснения требует вопрос
- является ли это общей закономерностью для «полевочьих» штаммов или эта уникальная
структура присуща только данному представителю подвида''
Как оказалось, клетки лабораторного штамма Y pestis EV11M продуцируют укорочен­
ный кор, ограниченный внутренним дисахаридом, который состоит из двух остатков Kdo (3дезокси-0-л<янно-окт-2-улозоновая кислота) или остатков Kdo и Ко Таким образом, этот
штамм является наиболее глубоким R-мутантом из всех исследованных штаммов возбудителя
чумы Другая характерная особенность этого штамма - обратная температурная зависимость
включения К.0
С повышением температуры культивирования происходят изменения не только кора, но
и липидного участка ЛОС (липида А) возбудителя чумы, выражающиеся в уменьшении содер­
жания жирных кислот и 4-амино-4-дезоксиарабинозы (Ara4N) (рис 3, табл 3) Эти данные бы­
ли нами получены одновременно с группой К Kawahara [2002] Степень температуроопосредованного дезацилирования липида А зависит также от состава культуральной среды, в результа­
те чего может происходить синтез не теграацильных производных липида А, а триацильных
вариантов Возвращаясь к результатам электрофоретических исследований, можно заключить,
что увеличение подвижности препаратов ЛОС (37 ° С ) по сравнению с ЛОС (25 "С) обусловле­
но не только увеличением степени редуцированности кора, но и уменьшением степени ацилирования липида А
Таблица 3 Отличия структуры липида А в штаммах У pestis. выращенных при различных температурах
КМ218
KIMD1
КМ260
1146
E V 1М
Тип липида А
25 "С 1 37 "С 25 'С 1 37 °С 25 "С 1 37 °С 25 °С 1 37 °С 25 "С 37 "С
Относительное содрзкание О-ацилщрованных вариантов { % )
Тетраациоьные варианты
70
100
85
100
93
88
81
81
95
52
(4хЗ-ОНС14 0)
следы
Пснтаацильные варианты
15
7
11
19
5
42
12
19
(теграацильные +С12 0
ИЛИ+С16 0)
Гексаацильныс варианты
следы
15
6
4
(тетраацильные +С12 0
+С16 1)
Относительное содерзкание Ara4N ( % )
ди-Ага4М BapudHTbi
27
76
94
92
72
16
43
93
42
61
40H0-Ara4N варианты
8
35
45
45
28
24
7
6
42
27
Варианты, не содержащие
38
39
12
16
12
Ara4N
П р и м е ч а н и я С12 0
jt^cKaHOBdw (лауринивам) киаюта, CI6 0 - гсксадск»!новая (пальмрггинпнля) кислота,
С1Й 1
г-сксалеценовяя (па-шмитачеиновая) кислота, '^-ОНСИ О
3-ги;фокситстрадскановая (3-ги;11К)ксичиристшювая) киикгга
14
25 °С
Рисунок 3 Структура липида А ЛОС К peshi КМ218 при различных температурах синтеза.
Пунктирные линии на рис 37 "С обозначают нестехиометрическое замещение Ara4N
№ результатов, представленных на рис. 3, можно заключить, что штаммы Y pestis
КМ218, КМ260 и K I M D 1 (subsp pestis) образуют одну группу «типичных» представителей ви­
да, которые обладают четкой системой контроля структуры Л О С в зависимости от температу­
ры и состава окружающей среды Вероятнее всего, вариабельность ЛОС, продемонстрирован­
ная в данном исследовании, находится под контролем двухкомпонентной PhoQP-системы пе­
редачи сигналов [Hitchen et al, 2002], которая участвует в контроле условий внешней среды и
экспрессии целого ряда белков, в том числе и ферментов биосинтеза ЛОС Штамм Y pestis
1146 не способен продуцировать один из компонентов кора (DDHep) и контролировать вклю­
чение Ara4N в состав липида А, тогда как механизм регуляции содержания Gal, Ко и Kdo в ко­
ре, а также степени ацилирования липида А у него такой же, как у штаммов subsp pestis Наи15
большие потери отмечены для штамма Y pestis E V 1 1 М он лишен большей части кора, имеет
измененный жирнокислотный состав липида А и не способен контролировать температурозависимые изменения в структуре Л О С Вероятно, мутация в этом штамме в значительной степе­
ни затрагивает PhoQP-систему передачи сигналов
И М М У Н О Б И О Л О Г И Ч Е С К А Я Х А Р А К Т Е Р И С Т И К А Л О С К pestis
Результаты изучения структурной организаш1и Л О С возбудителя чумы были дополнены
данными об их иммунохимической вариабельности (рис 4, табл 4) Следует подчеркнуть, что
только применение комплекса иммунохимическях методов ( Р Д П (реакция диффузионной пре­
ципитации), Р Н Г А (реакция непрямой гемагглютинацяи), Р Т Н Г А (реакция торможения не­
прямой гемагглютииации), И Ф А (иммунофермеятный анализ)), различных приемов презента­
ции Л О С для получения антительных препаратов, химической модификации ЛОС (дезацилирование, дефосфорилирование), прим^ение методов истощения и конкурентого торможения
позволило получить действительно объективную информацию об иммунохимических особен­
ностях ЛОС К pestis
Так, М К А Т , полученные иммунизацией Л О С Y. pestis E V (25 "С), очень слабо реагиро­
вали с деацилироваяными препаратами ЛОС из клеток штамма Y.pestis K I M D 1 (25 ° С ) и не
реагировали в Р Н Г А с эритроцитами, сенсибилизированными деацилированными препаратами
ЛОС, что позволяет сделать вывод о том, что тестируемые антитела направлены против конформационных эпитопов липида А, важную роль в формировании которых имеют эфирносвязаниые жирные кислоты.
Результаты теста конкурентного иягибирования Р Н Г А (рис 4) эритроцитов, сенсибили­
зированных ЛОС Y pestis (25 ° С ) , подтвердили гетерогенность антигенных детерминант ЛОС,
выдепенньпс из клеток различных штаммов чувлюго микроба, выращенных при указанной тем­
пературе.
лпс
Рисунок 4 Конкурентное ингибирование Р Н Г А с использоваш1ем эритроцитов, сенсибилизи­
рованных ЛОС, Y. pestis (25 ° С ) , с гомологичными антисыворотками Светлые столбцы - гомо­
логичная E V Н И И Э Г (25 ° С ) система, темные столбцы - гомологичная К pestis 231 (25 ° С ) сис­
тема 9532 - Y.pseudotuberculosis 9532 (R), Y е- Y. enterocolitica ОЗ (37 ° С ) , Ra - Е. соН F470,
S minnesota SF1112, Rb - 5. minnesota SF1127,- Re - S typhi Ty21A, S. minnesota SF1119,- Rdi E coli F588, 5. minnesota SF1121, Rd2 - E. colt F583, S. minnesota S F I I 1 8 ; 23Г - Y.pestis 231
(pCad), 231 - Y. pestis 231, E V t - К pestis E V НИИЭГ(37 ° C ) , E V - Y pestis E V НИИЭГ(25 "С),
358/12 - К pestis 358/12, 1146 - Y. pestis 1146. T W J -Y pestis Tjiwidej, Java - К pestis Java
16
При исследовании взаимодействия антисыворотки к клеткам штамма Y.pestis E V
Н И И Э Г (37 ° С ) с эритроцитами, сенсибилизированными гомологвчньш Л О С (37 °С), были
получены результаты, свидетельствующие об их большей специфичности (табл 4) Н и один из
исследованных ЛОС Y.pestis Tjiwidej, Java, 1146, 260(11), КМ218, Y.pseudotuberculosis 8412R,
9532R (25 " С и 37 °C), кроме гомологичного Л О С У pestis E V (37 "С), не тормозил РИГА
Препараты Л О С R мутантов 5 minnesota и Е. coli также не обладали ингибирующей активно­
стью (данные не приводятся)
В соответствии с обнаруженными структурными особенностями Л О С Y.pestis 1146
(37 ° С ) в этом же тесте была выявлена его высокая иммунохимическая специфичность
(табл 4) Критичным для формирования столь узкой специфичности является сочетание двух
факторов - отсутствие DDHep и включение в кор Gal при обеих температурах культивирования.
Поскольку штамм Y. pestis 1146 относится к subsp caucasica, эта особенность может быть при­
суща и другим представителям данного подвида Е щ е одним выявленным примером уникаль­
ной специфичности является Л О С К pseudotuberculosis 9532 R (37 ° С ) (табл 4)
Таблица 4. Специфичность Р Т Н Г А с использованием эритроцитов, сенсибилизирован­
ных различными препаратами Л О С иерсиний (37 "С), с антисывороткой к инзктивированным
гомологичным клеткам Y. pestis (37 ° С ) .
Штамм-продуцент Л О С
дня конкурентного ивгибирования
Y
Y
У
Y
Y
У
Y
Y
Y
Y
Y
Y
Y
Y.pestis
EV
pseudotuberculosis 9532 R (25 °С)
pseudotuberculosis 9532 R (37 °С)
pestis Java (25 °С)
pestts Java (37 "С)
pestis П46 (25'С)
pestis 1146 (ЗТС)
pestis Tjiwidq (37 "С)
pestis EVQTX)
pestis EV (25'С)
pestis KM21S (25 "Q
pestis KM218 (37 °C)
pestis E V (260(11» (25 "C)
pestis E V (260(11)) (37 °C)
Специфичность РТНГА эритроцитов,
сенсибилизированных ЛОС (37 ° С )
Y.pestis
Y.pestis
У. pseudotuber­
¥. pestis П46
260(11)
КМ218
culosis 9S32R
+
+
+
+
-+
+
■(•
4-
,+
't.
,*'
'+
+
+ ■
+
+
+
+
Примечание Вьшеленыположтельяыерезультатыконкуренгаогоингнбиронания
Таким образом, впервые показано, что олигосахаридный и липидный участки ЛОС
У pestis имеют отчетливо выраженную температуро- и штаммозависимую вариабельность Для
препаратов Л О С изучаемой грухшы штаммов, синтезированных при температуре 37 " С , пока­
зана более узкая штаммовая иммунохимическая специфичность На основании полученных
результатов нами был сделан вывод о том, что иммунизация ЛОС чумного микроба индуциру­
ет синтез антител, по меньшей мере, четырех различных типов специфичности, расположен­
ных ниже в порядке уменьшения их доминирования
1 Антитела к липиду А, перекрестно реагирующие с Л О С энтеробактерий, в формировании
которых важную роль играют эфирносвязанные жирные кислоты липида А (транзиторные по­
лосы в Р Д П (реакция даффузионной преципитации), потеря активности моноклональных аяти17
тел после мягкого щелочного дезацилирования тестируемых ЛОС), определяя родоспецифическое узнавание
2 Антитела к дезацилированным вариантам липида А (видоспецифические, продуцируются
в ответ на иммунизацию препаратами Л О С Y pestis, синтезируемым при температуре 37 ° С )
3 Антитела к консервативным структурам кора (перекрестные реакции ЛОС, синтезирован­
ных при низких температурах культивирования, видоспецифические)
4 Антитела к вариабельньшл структурам кора (штаммовая специфичность, отсутствие пере­
крестных реакций в условиях синтеза Л О С при температуре 37 °С)
Отсутствие перекрестной протективности ЛОС различных штаммов Y pestis легко объ­
ясняется композиционньши различиями изучаемых препаратов, индикатром которьпс является
чувствительность к фагу FP1 Широко используемый в работах вирулентный штамм Y. pestis
231, обладает реверсивной фаговой чувствительностью, то есть лизис наблюдается при темпе­
ратуре 37 ° С , но не 25 ° С , тогда как Л О С вакцинного штамма Г pestis E V - типичной Очевид­
ны различия в Л О С применяемых штаммов Структуру Л П С штамма Y. pestis 231 предполага­
ется изучить в ближайшее время
Обнаруженный нами феномен вариабельности ЛОС Y pestis стимулировал проведение
блока исследований, охватывающих изучение влияния температуроопосредованных изменений
на биологические свойства ЛОС Располагая данными об уменьшении степени ацилирования
липида А возбудителя чумы при повышении температуры культивирования бактерий, можно
было ожидать изменений в биологической активности липида А (37 ° С ) в сторону уменьшения
его токсичности, резистентности к бактерицидному действию сыворотки и индукции синтеза
провоспалительных цитокинов.
Как показали результаты экспериментов, клетки штаммов Y. pestis КМ218, КМ260(11),
KINfDl, выращенные при температуре 25 ° С и 37 "С, обладали резистентностью к бактерицид­
ному действию 80 %-ной человеческой сыворотки (рис 5)
9
Рисунок 5 Резистентность клеток различных штаммов Y pestis к бактерицидному действию
человеческой сыворотки Темные столбцы - нормальная человеческая сьшоротка, светлые
столбцы - инактивированная прогреванием сыворотка
В противоположность этому, клетки штаммов 1146 и E V 1 1 M оказались высокочувстви­
тельными к действию комплемента сыворотки Более того, клетки штамма 1146, выращенные
при температуре 37 "С, погибали при инкубации с интактной сывороткой, то есть были еще
18
более чувствительны к действию комплемента, чем клетки того же штамма, культивируемые
при 25 " С .
Бактерии всех изученных штаммов возбудителя чумы вне зависимости от температуры
культивирования оказались резистентньгаи к бактерицидному действию нормальной мьплиной
сыворотки, разведенной до 80 % (рис 6) Таким образом, "полевочьи" штаммы, а представите­
лем их в данном исследовании являлся штамм 1146, ЛОС которого отличался от всех осталь­
ных электрофоретически, иммунохимически и структурно, устойчивы к д«5ствию комплгалента
мьшганых сывороток, но чувствительны к системам комплемента человаса
8
О?
а
g
Ю
т
i
s
i
^
Штамм Y.pests
Рисунок 6 Резистентность клеток различных
штаммов Y pestis к бактерицидному дейст­
вию мьплиной сьгеоротки Темные столбцы - нативная сыворотка, светлые столбцы - сыво­
ротка инактивированная прогреванием
По нашим и литературным [Ong, Mattes, 1989, Ong et al, 1992] данным, продемонстри­
рованная устойчивость объясняется тем, что уровень комплемента у лабораторных мьппей,
впрочем, также как и у диких, находится на очень низком уровне по сравнению с таковым у
людей, крыс, морских свинок и других млекопитающих (у лабораторных мьппей в 80-90 раз
меньше, чем у людей) Штамм 1146 Y pestis подвида caucasica, который циркулирует в попу­
ляциях полевок [Кокушкин, 1995], является высоко вирулентным для полевок и лабораторных
мышей, но авирулентен для морских свинок и людей Это дает возможность предположить,
что различные концентрации комплемента в крови хозяев могут быть одной из основных при­
чин избирательной вирулентности штаммов Y pestis данного подвида Вполне вероятно, что в
процессе эволюции низкий уровень комплемента в крови естественного хозяина (полевок) в ы ­
звал ряд адаптационных изменений ЛОС, а возможно и белковых компонентов, ответственных
за взаимодействие с системой комплемента, в связи с ненадобностью указанных биологических
функций Если предположить, что снижение резистентности клеток штамма Y. pestis 1146 к
бактерицидному действию сыворотки определяется только ЛОС, то ответственен за эти изме­
нения коровый участок ЛОС (уменьшение содержания Gal и отсутствие DDHep при 37 ° С ) , так
как липидный участок ЛОС данного штамма не имеет значимых отличий от липида А трех
«типичных» штаммов - Y pestis КМ218, КМ260 (11), K I M D 1 Сравнительный анализ химиче­
ской структуры ЛОС из штаммов, отличающихся по чувствительности к бактерицидному дей­
ствию человеческой сыворотки позволил локализовать в составе кора остатки гептозы, пред19
положительно обеспечивающие универсальную вирулентность штаммов основного подвида
возбудителя чумы
Из данных, представленных на рисунках 7, 8 прослеживается связь между разницей в
химической организации препаратов ЛОС различных подвидов Y pestis и в обусловливаемой
ими индукции синтеза провоспалительных цитокинов и вирулентностью клеток возбудителя
чумы для млекопитающих
KM2ia
114<
EV11M
□ЛОС Y p«shs (37-С)
КМ260(11)
F tularcnsis
fS/IO
KIM01
□nOCYp«tl.(25*C)
Н0«-0-ачнтрованный ЛОС Y pestis (2S*C) В К о т р о л ь Л О С
Рисунок 7 NO (nitric axide, окись азота) - индуцирующая активность ЛОС Y. pestis
(штаммы КМ218, 1146, KIMD1, EV11M) на модели мышиных макрофагоподобных клеток
J774 1А
КМ218
1146
EV11M
КМ2вО(11)
KIMQ1
в Л О С У pe.li>(37°C)
п л е с Y pcsti. (25 "С)
аие-О-ацнлировааный ЛОС Y ры» фХ:)
вКоы-фоль ЛОС
Е.со||
055 В 5
F.tularenste
1S/10
Рисунок8 Индукция TNF-a ЛОС кj3ajtoKM218, 1146, KIMD1, E V И М на модели мы­
шиных макрофагоподобных клеток J774 1А
Препараты ЛОС, синтезируемые бактериями чумы при температуре 25 °С, за исключе­
нием КМ260(11) для NO, КМ218 и КМ260(11) - для TNF-a, индуцировали синтез этих соеди­
нений в большей степени, чем ЛОС (37 °С) Наименьшей индуцирующей активностью облада­
ли более редуцированные формы ЛОС (37 °С) штаммов 1146 и EV11M Дезацилированный
20
мягким щелочным гидролизом ЛОС Y pestis K I M D 1 (25 °С) индуцировал включение механиз­
мов неспецифяческой резистентности в достоверно меньшей степени, чем исходный препарат
или Л О С (37 ° С )
Изучение токсичности ЛОС на модели мышей, сенсибилизированных актиномицином D, показало, что значения данного параметра для ЛОС (37 ° С ) всех изученных штаммов,
кроме Y. pestis EV11М, была достоверно ниже, чем у ЛОС (25 °С), минимальной активностью
при обеих температурах синтеза обладали препараты ЛОС Y. pestis 1146 и 11М
Взятый в качестве контроля ЛПС F. tularensis, который лишен гептоз кора, содержит в
составе липида А только четыре ацильных остатка вместо шести, не имеет фосфатных групп
[Репу et al, 2003], по индукщ1и синтеза TNF-a соответствовал ЛОС Y. pestis 1146 и 11М, пока­
затели продукции N 0 у него были достоверно ниже, чем у ЛОС возбудителя чумы, а уровень
токсичности соответствовал химически дезацилированному ЛОС штамма KTMDl
TNF-a относится к дитокином, играющим ключевую роль в формировании иммунного
и воспалительного ответа в ответ на инфекцию Секретируемый, в основном, макрофагами, он
воздействует на различные типы клеток, вовлеченные в защитные реакции хозяина Уровни
синтеза TNF-a у мышей, инфицированных вирулентными клетками Y. pestis гораздо ниже, что,
в основном, обусловлено имуносупрессориым действием белков LcrV, YopP/YopJ [Comelis
et. al, 1998] Однако, возбудитель чумы, как показано в данном исследоваянн, обладает также
механизмами регуляции синтеза ЛОС, способность которого индуцировать синтез TNF-a по­
нижена при температуре тела хозяина сообразно иммуносупрессорвой активности белков, ко­
дируемых плазмидой pCad.
Таким образом, наличие или отсутствие DoHep в коре и степень его редуцированности
(Y. pestis 1146 и И М ) , а также температуроопосредованное частичное дезацилирование липи­
да А оказывают влияние на синтез N 0 и TNF-a В дальнейшем мы планируем провести допол­
нительный цикл исследований in vivo для определения влияния изменений жврнокислотяого
состава липида А на иммунобиологические свойства ЛОС возбудителя чумы
РОЛЬ Л О С в РЕАЛИЗАЦИИ П А Т О Г Е Н Н О С Г И К pesta
Располагая представленной выше информацией по молекулярной организации, иммунохимической и биологической активности препаратов ЛОС Y. pestis, можно попытаться оценить
биологическую значимость его вариабельности. ЛОС возбудителя чумы, наряду с кодируеаи.1ми плазмидами температурозависимыми белками, оказывается прецизионньш инструментом
регулирования взаимодействия патогена с постоянно меняющимися факторами внешней сре­
ды, существованию в организмах различных хозяев и переносчиков, координируя присущую
им разноплановую биологическую активность с белковыми факторами патогеиности чумного
микроба:
1 .Взаимодействие с белковыми фаюпорами патогеиности чумного Muig>o6a Уменьше­
ние цитокининдуцирующей активности ЛОС, синтезированного при температуре тела тепло­
кровного хозяина согласуется с иммуносупрессорной активностью Yops [Comelis et al, 1998]
Отсутствие О-полисахаридных цепей в клетках возбудителя чумы усиливает свойства Р1а, свя­
занные с вирулентностью микроорганизма [Lang et al,
2002] В недавней работе
Е П Соколовой [2002] показано, что in vitro мьшпшый токсин и ЛОС возбудителя чумы могут
взаимодействовать между собой с образованием высокотоксичного комплекса При этом коли­
чества мышиного токсина и ЛОС, сублетальные для белых мышей и свинок по отдельности,
проявляют синергидную токсичность
2 Угнетение способности индуцировать механизмы вроясденного иящ/нитета хозяи­
на. Отсутствие О-специфических боковых цепей и синтез редуцированных R форм ЛОС возбу21
дителем чумы определяют устойчивость к комплементзависимому лизису бактерий [Porat et al,
1995], что является необходимым условием для выживания и роста в крови и важным в плане
трансмиссии пагмеиа между двумя хозяевами - млекопитающими и блохами [Brubaker, 2000,
Домарадский, 1993, Репу, Fetherston, 1997, Анисимов, 2002], а также устойчивость к катионным антимикробным пептидам, которые являются ключевыми компонентами врожденного
иммунитета [Bengoechea, 1998, Dimopoutos, 2003] "Равняя защита", возникающая обычно по­
сле введения ЛПС как период толерантности к гомологичному или гетерологичному ЛОС и
резистентности к бактериальным, вирусным и паразитарным инфекциям [Greisman, 1973,
Warren, Chedid, 1987], опосредуется щ1Токинами, важнейшими из которых являются TNF-a и
IL-1 [Greisman, 1973, Warren, Chedid, 1987] Результаты наших исследований свидетельствуют о
наличии температуроопосредованной штаммозависимой модификащ1и кора и липида А Л О С
Y pestis, результатом которой является подавление способности запускать механизмы врож­
денного иммунитета хозяина Стратегия борьбы с защитными силами макроорганизма путем
угнетения синтеза TNF-a присуща не только Yersinia, но также Brucella spp [Caron et al, 1994],
Listeria monocytogenes [Demuth etal, 1996], Bacillis anthracis [Hoover etal, 1994], Mycobacte­
rium avium [Sarmento, Appelberg, 1995], Leishmania donovani [Descoteaux, Matlasshewski, 1989],
вирусам, что свидетельствует о ее широком использовании патогенами.
3 Уход от механизмов специфического иммунного ответа При попадании чумного мик­
роба в организм млекопитающего посредством укуса блохи эпитопы кора Л О С экспонированы
на поверхности и не экранированы секретируемыми и мембранными белками, синтез которых
является температурозависимым. Происходит запуск иммунного ответа на конс^вативные и
вариабельные иммунодоминантвые антигенные детерминанты кора, специфичные для Л О С
(25 °С), тогда как эпитопы, специфичные для ЛОС (37 "С), по нашему мнению, или экраниро­
ваны стерически или еще отсутствуют - налицо направление иммунного ответа «по ложному
следу» Далее происходит синтез коровых структур, которые не опознаются антителами, инду­
цированными ЛОС (25 ° С ) , и уход от защитных иммунных механизмов хозяина Наличие зна­
чительной серовариабельности кора объясняет отсутствие протективности в опытах с исполь­
зованием гетерологичных Л О С возбудителя чумы или ЛОС-специфических антител Антитела
к иммунодоминантным участкам (эпитопам), локализованным в липиде А, не прелставлягот
угрозы для патогена in vivo, так как эти эпитопы расположены внутри бактериальной мембра­
ны и не экаюнированы для взаимодействия с иммуноглобулинами Кроме того, липид А в сы­
воротке крови может появиться на терминальных стадиях инфекционного процесса при распа­
де клеток, когда исход заболевания уже предрешен, но не ранее
4 Обеспечение адаптационной пластичности для персистенции мищюба в различных
природных ареалах, хозяевах и переносчиках, о чем свидетельствуют уникальные результаты,
полученные в ходе выполнения данной работы Биохимические особенности хозяина, такие как
низкий уровень комплемента в крови естественного хозяина (полевок), способны вызывать
адаптационные изменения структуры кора ЛОС в связи с ненадобностью указанных биологи­
ческих функций
Многие компоненты возбудителя чумы, экспрессируемые при температуре организма
млекопитающего, обладакут ярко выраженньпии имуиосупрессорными свойствами [Schesser
et al, 1998, Muller et al, 1998] и препятствуют запуску каскада защитных реакций организма, в
том числе и путем предотвращения индукции синтеза таких провоспалительных цитокинов,
как IL-8, TNF-a [Schesser et al, 1998] Эти данные проясняют стратегию вирулентности возбу­
дителя чумы - разноплановое подавление реакций иммунной системы хозяина в ответ на вне­
дрение чужеродного организма на самых ранних стадиях инфекции, смена иммунохимической
парадигмы и затем безудержный рост микроба Один из уникальных механизмов, работающих
22
для реализапии этой стратегии, - температуроопосредованная модификация ЛОС в направле­
нии смены иммунохимической специфичности, а также уменьшения их способности индуци­
ровать синтез провоспалительных цитокинов и вызывать повышение неспецифической рези­
стентности макрорганизма
Обнаруженный феномен изменчивости ЛОС возбудителя чумы по значимости превос­
ходит факт наличия вариабельности капсульного F I и V антигенов в силу его масштабности
Новые данные о ЛОС возбудителя чумы позволяют разработать методы дополнительной внут­
ривидовой дифференциации патогена, понять особенности молекулярной организации и меха­
низмов вирулентности различных подвидов возбудителя чумы, а также ставят новые вопросы о
масштабах и формах их изменчивости, роли вариабельности в персистенции патогена в приро­
де, адаптации к смене хозяев и переносчиков
И З У Ч Е Н И Е ПРОТЕЮГИВНОЙ АКТИВНОСТИ ПРЕПАРАТОВ F I И РНб А Н Т И Г Е Н О В ПРИ
Р А З Л И Ч Н Ы Х СПОСОБАХ И Х ПРЕЗЕНТАЦИИ
Поскольку к моменту начала исследований уже было установлено, что способ иммуни­
зации, степень агрегации, доза, способ презентации антигенов существенным образом меняют
их иммуногенность и тип индуцируемого иммунитета, то в данном исследовании все вышеука­
занные факторы были по возможности учтены М ы изучали иммуногенность капсульного и
рНб антигена в виде агрегатов и отдельных субъединиц, в комплексе с М Ф Л А (монофосфориллипид А ) , экспрессируемыми бактериальными векторами В качестве бактериальных векторов
для экспрессии капсульного антигена выбраны аттенуироваяные варианты сальмонелл, в част­
ности, S. typhimunum SL3261, S. minnesota R595, S typhi Ту21а
Показано, что М Ф Л А в комплексе с капсульным белком способен повысить его протектвввые свойства в ранние сроки после иммунизации (рис 9) Введение М Ф Л А накануне белко­
вой иммунизации приводит к достоверному снижению протективных свойств капсульного
белка. Аналогичным образом предварительное введение М Ф Л А влияет на протективность жи­
вой чумной вакцины, снижая ее приживляемость и способность к персистенция в организме
мышей и морских свинок (табл. S).
Наибольшее потевциирующее действие М Ф Л А реализуется в ранние (3-14 сутки) сроки
после иммунизации, когда протективность препаратов F I , комплексированных с М Ф Л А досто­
верно выше, чем у других исследованных образцов Отсутствие влияния М Ф Л А на пике имму­
нитета можно объяснить тем, что И сам по себе в высокополимеризованной форме является
сильным иммуногеном и интенсивность формируемого иммунитета в эти сроки находится на
пике возможностей иммунной системы.
Таблица 5 Протективность тестируемых препаратов для контрольных и праймированных
М Ф Л А мышей на 21 сутки после иммунизации
Средние сроки гибели (су­
Иммунизирующий агент
Индексы иммунизации
тки)
М Ф Л А за сутки, E V ( Ш ' К О Е )
10
8,5±0,6
EV(IO'KOE)
М Ф Л А за сутки, F I
1000
10
ИхМФЛА
850
FI
Контроль
700
16
23
8,4+1,0
8,4±0,9
9,3±1,3
9,4+1,6
5,5d-0,7
ШШШЕУ
^ ^ Контроль
-*-Р1хМФЛА
-n-FIS.m
Рисунок 9 Протекгввная активность различных препаратов капсульного антигена в
сравнении с живой чумной вакциной E V , представленная как Ig ED50 К - иеиммунная группа;
F1 Y р -капсульный антиген, выделенный из вакцинного штамма Y pestis E V ; E V - вакцина ж и ­
вая чумная коммерческая, FI S ш - капсульный антиген, выделенный из рекомбинантного
штамма S minnesota R595, ШхМФЛА - капсульный антиген, выделенный из рекомбинантного
штамма 5. minnesota R595, комплексированныи с М Ф Л А
Кроме того, комплексирование F I антигена с М Ф Л А приводило к повышению его иммуногенности, что выражалось в повышении титров F1 антител и регистрации их в более ран­
ние сроки М Ф Л А , комплексированныи с F I белком, становится, в свою очередь, более иммуногенным, индуцируя выработку специфических антител (рис 10) Препараты капсульного ан­
тигена, содержащие в своем составе Л О С или М Ф Л А , более активно стимулировали клеточ­
ный иммунитет при ревакцинации животных первично иммунизированных живой чумной вак­
циной, чем один F I антиген
^ Ш Э В коммерч
ШШмкцииаЕУ
- 4~ FI-S m
-в-Н-М»ЛА
14
21
Сроки иммунизации (сутки)
Рисунок 1 о Динамика титров антител к F I антигену К. pestis при иммунизации различными
антигенными препаратами Fl-Sra - рекомбияантный капсульный белок из штамма S. minnesota
R595 p F S l , F I - М Ф Л А - расомбинантный капсульный белок из штамма S minnesota R595 p F S l ,
комплексированныи с МФЛА, FI коммерч - капсульный белок чумной коммерческий, вакцина
E V - вакцина живая чумная на основе штамма У pestis E V линии Н И И Э Г
24
На основе полученных данных можно сделать вывод о том, что М Ф Л А в составе беяковолипидного липосомального комплекса с капсульным антигеном Y pestis способен сущест­
венно усиливать его протективные свойства в ранние арокп после иммунизации путем инициа­
ции неспецифической резистентности, более быстрой и интенсивной индукции синтеза специ­
фических И антител и формирования напряженного иммунитета в отдаленные сроки после
вакцинации
Аналогичный эффект был получен при иммунизации мышей убитыми клетками штамма
S. minnesota R595 pFSl (рис И , табл 6) Такая иммунизация индуцировала развитие ранней
резистентности к последующему заражению высокими дозами клеток вирулентных штаммов
возбудителя чумы Этот факт особенно важен с точки зрения разработки иммунопрофилактических препаратов для экстренной профилактики контингентов, находящихся под угрозой за­
ражения
14
12
10
а
в
4
2
S.tn p F S 1
Yр
Контроль
Иммунизирующие препараты
1
0
t'j""^\ П 50
—Суши
Рисунок 11 Протастивность ржомбинантного штамма S. minnesota R595 pFSl и живой чумной
вакцины E V на третьи сутки после иммунизации при экспериментальной чуме морских свинок.
Таблица 6 Протективносгь клеток расомбинантного штамма 5. minnesota R595 pFSl в
разные сроки после иммунизации при чуме мышей
Сроки после иммунизации (сутки)
Иммунизирующий агент
Y. pestis E V
5. minnesota R595 p F S l
1
2
3
21
15/5,8 *
35/5,9
81/7,0
8134/10,0
10541/8,8
4892/ 12,0
10541/ 14,0
5750/10,5
Примечание * - индексы иммунитета/ феоние сроки гибели животных Индекс иммунитета - соотношение
LD» иммунных животных к LD» контроля
Важный для конструирования иммунопрофилактических препаратов итог изучения мо­
лекулярной организации fra оперона, кодирующего синтез капсульного антигена, состоит в
том, что нарушения cafiM гена приводят к появлению серологически атипичного капсульного
антигена с измененньпш иммунохимическими и протективными свойствами [Анисимов и др,
1991-1997, Гремякова и др, 1993] Эти данные необходимо учитывать при выборе генетиче­
ской конструкции, предназначенной для создания штамма-продуцента Учитывая то обстоя­
тельство, что нар5^шения со/М области приводят к формированию атипичных вариантов F I , во
всех наших исследованиях, которые связаны с конструированием и изучением иммунопрофо25
лактических и диагностических препаратов, мы использовали структуры только с полньпч fra
опероном.
Изучали группу аго мутантов, любезно предоставленных проф В Stocker ( С Ш А ) ,
S. typhimurium SL3261, 5. typhimurium SL7207 Выбор штаммов определялся тем, что они явля­
ются общепринятой в мире моделью, с помощью которой проверяется экспрессия гетерологичных белков, стабильность наследования рекомбинаятных плазмид, иммуяогенность проду­
цируемых антигенов и особенности формирования иммунитета [Dougan, 1994, Oyston 1995]
Рекомбинантный клон аго мутанта - S. typhimurium SL3261 pFSl синтезировал И анти­
ген в секретируемой форме Практически весь белок (около 90 % ) тестировали в культуральной
среде, синтез его носил температурозависимый характер. Согласно результатам Р Д П , Р И Г А ,
Р Т Н Г А , И Ф А все проверенные нативные чумные и рекомбинантные препараты F I антигена
были иммунохимически идентичны. Синтез F I антигена в клетках S. typhifnurium SL3261 p F S l
штамма тестировали на уровне (20±5) MKr/Kf К О Е Плазмида pFSl стабильно сохранялась в
клетках штамма S. typhumurium SL3261 in vitro в течение трех пассажей без селективного дав­
ления антибиотиков Количество выросших колоний на чашках с ампициллином после перено­
са с чашек без ампициллина составляло 100 % Однако, после второго пассажа уровень синтеза
F I антигена уменьшался (рис 12 (В)).
На рис 12 ( В ) представлены данные, характеризующие уровень экспрессии капсульного антигена во время персистенции рекомбинантных клеток S typhimurium SL3261pFSl in vivo
На 1, 3, 7 сутки после иммунизации в супернатанте культур рекомбинантных клонов, выдеяо!ных из печени и селезенки, методом Р И Г А определяли содержание F I антигена Результаты
представлены как средние значения логарифмов титров Р И Г А по 3-5 клонам, суспендирован­
ным до концентрации, соответствующей ODeaf^l
В
12 X
- 10
гч
8" 8
6 -14
2
О
1 . 2
3
Номера пассажей
4
-Печень
-Селезенка
И
1
3
7
Cpofo* иммунизации (сутки)
Рисунок 12 Уровни экспрессии F I антигена в клетках рекомбияантного штамма
5'. typhimurium SL3261pFSl при пассажах in vitro ( А ) in vivo ( В ) и без селективного давления.
М ы не обнаружили уменьшения уровня синтеза F I антигена in vivo Более того, можно
полагать, что селекция в печени и селезенке идет различными путями и приводит к отбору в
селезенке клонов с более высоким уровнем синтеза F I антигена, тогда как в печени уровень
синтеза постоянен Для определения стабильности наследования плазмид in vivo мьпией инфи­
цировали внугрибрюшинно клетками рекомбинантного штамма, на 1, 3, 7, 14 дни осуществля­
ли высев бактерий из печени и селезенки, подсчитьгеали количество плазмидосодержащих бак-
26
териальных клеток (табл 7) Дополнительной обработки животных антибиотиками не прово­
дили
Результаты опыта, представленные в виде процента выживших животных, свидетельсгвуют о более высокой эффективности внутрибрюшинной иммунизации (50 % выживших жи­
вотных), по сравнению с группой, иммунизированной дважды орально (рис 13) Все мыши в
контрольной неиммунной группе пали Тем не менее, оральная вакцинация обеспе'швала за­
щиту 20 % иммунных мышей
Таблица 7 Динамика высева антибнотикорезистентных (арк) бактерий S typhimurium
SL3261pFSl из органов мышей, иммунизированных впутрибрюшинно
Сроки после им­
Уровень антибиотикорезисте[!тных клеток S typhimurium SL3261pFSl
мунизации (сутки)
Обсемененность селезенки
Обсемененность печени
всего
арк
всего
арк
(%)
(%)
1
5,3x10^
2,1x10^
40,0
3,1x10'
4,4x10^
14,0
3
1,5x10'
9,4x10^
54,5
9,4x10'
9,9x10^
10,5
7
1,6x10'
1,0x10'
63,4
4,3x10'
9,2x10'
21,4
5
20
per о*
Control
Рисунок 13 Эффективность защиты мышей, иммунизированных бактериями рекомбинантного штамма S. typhimurium SL3261pFSI при экспериментальной чуме i p -однократная
внутрибрюшинная иммунизация, per os - двукратная оральная иммунизация, Conlrol - кон­
трольная неиммунная группа животных.
В результате проведенной работы получен ряд молекулярных и рекомбинантных кле­
точных препаратов, обладающих высокими протективными свойствами при эксперименгальной чуме в ранние и отдаленные сроки после иммунизации, а также на пике иммунного ответа
Используя различные способы презентации капсульного антигена, такие как корпускулирование с М Ф Л А , экспрессия в аттенуированных сальмонеллах, можно конструировать иммунопрофилактические препараты для решения конкретных проблем практического здравоохране­
ния
В ходе выполнения следующего этапа работы охарактеризован рекомбинантный рНб
антиген, выделенный из штамма Е соИ GM83 pYG824, показана их идентичность рНб белку
штаммов Y pestis Выявлены различия в биологической активности внутри- и внеклеточных
форм рНб антигена Схожесть молекулярной организации оперонов, кодирующих оба "капсульных" антигена чумного микроба - рНб и F I , а также биологической организации белков
позволяют с достаточно высокой вероятностью прогнозировать необходимость использования
полноценного psa оперона, а не только структурного гена для экспрессии антигениоспецифического, функционально активного полимера рНб антигена Можно полагать, что экс­
прессия только гена, кодирующего синтез белковой субъединицы рНб антигена в составе ре27
комбинантных плазмид, слитных белков и т д. приведет к получению серологически атихшчных, функционально неактивных мономеров, как это показано для капсульного F I антигена
Путем химической (формалинизация) и термической обработки был получен ряд произ­
водных рНб антигена различной степени полимеризации с варьирующими биологическими
свойствами (цитотоксичность, способность вызывать воспаление при вяутрикожном введении
и агглютинировать эритроциты) В результате изучения протективности полнмеризованных и
деполимеризованных форм рНб антигена на морских свинках и мышах получены данные, сви­
детельствующие об отсутствии у данных препаратов протективных свойств для обеих лабора­
торных модели животных (рис 14) Полимеризованвые формы, (шособные презентироваться
по M H C I и М Н С П путям, индуцируя как клеточный, так и гуморальный ответ, способны защи­
тить морских свинок от 2 LDso, а мышей от 8 LDso вирулентных клеток чумного микроба Деполимеризованные препараты, презентирующиеся по MHCII пути (индукция гуморального
иммунитета), обладали иммуносупрессирующим действием и повьппали восприимчивость ж и ­
вотных к летальной инфекции.
Контроль
Препараты рНв антигена
Рисунок 14 Сравнительные данные по протективности препаратов рНб антигена для
мышей и морских свинок рНб - нативный рНб антиген, рНб (56) - рНб антиген, прогретый при
температуре 56 ° С , рНб (100) - рНб антиген, прогретый при температуре 100 ° С , рНб* - натив­
ный рНб антиген, введенный за сутки до иммунизации Иммунизирующая доза для мышей и
морских свинок - 20 мкг на животное
Таблица 8 Протективность капсульного и рНб антигенов при раздельной и совместной имму­
низации мышей с последующий заражением на 21 день иммунизации вирулентными клетками
штамма Ypestis 231 в дозе 200 DCL
Иммунизирующие
Иммунизирующий iштиген
дозы (мкг)
100
20
4
0,8
Контроль
(неиммуиные животные)
П р и м е ч а н и е Павшве/живые
рНб
8/10
8/10
8/10
7/10
FI
1/10
1/10
6/10
б/Ю
28
рНб+FI
5/10
7/10
5/10
7/10
9/10
рН6+ЛПС(10мкг)
9/10
10/10
10/10
10/10
Исследование иммуногенности капсульного F I и рНб антигенов для мышей при ях со­
вместной иммунизации (табл 8) показало, что введение рНб антигена в сосгав двухкомпонентной иммунизирующей смеси снижает протективность капсульного антигена Совместное вве­
дение рНб антигена с нативным ЛПС F iularensis приводило к большему падежу животных в
иммунной группе, нежели в контрольной
В результате анализа собственных экспериментальных и литературных данных, мы
пришли к выводу, что использование рНб антигена для разработки иммунопрофилактических
препаратов нового поколения неперспективно, так как в высокополимеризованном виде он
обладает низкой протективностью, в виде мономеров - иммуносупрессивен
Вариабельность ЛОС, капсульного FI и V антигенов, установленная как в ходе выпол­
нения данной работы, так и известная по литературным источникам, делает проблему конст­
руирования иммунопрофилактических препаратов против чумы более сложной, а возможно,
потребует создания нескольких вариантов вакцин, предназначенных для разных контингенту
Изменчивость структуры ЛОС чумного микроба свидетельствует о необходимости даль­
нейшего изучения данного явления и в случае экспериментального подтверждехшя однотипно­
сти структуры кора штаммов Y pestis подвида pestis (вирулентного для человека) дает возмож­
ность включения его монофосфорилированного варианта в составе вакцинного препарата в
комплексе с капсульным антигеном или дезацилированного препарата ЛОС (37 ° С ) в виде гликопротеинового конъюгата с V антигеном Преимущества такой формы презентации двух ан­
тигенов очгаидны ~ повышается иммуногенность обоих компонентов, уменьшается иммуносупрессивное действие V антигена, оба соединения являются охарактеризованными и стандартньши Недавно вьивленная антигенная вариабельность V антигена и отсутствие защиты жи­
вотных при заражении штаммами Y. pestis другого серовара [Worsham, 1998, Griffin, 1998, Roggenkamp, 1997] предполагает целесообразность включения в состав вакцинных препаратов,
всех антигетных вариантов V антигена, особенно если речь идет о предотвращении последст­
вий биотерроризма
вьюоды
1.Создана уникальная коллекция R специфических фагов (FP1, FP3, С21), R и S вариан­
тов энтеробакт^жй, включающая 4 штамма Е соИ, 7 штаммов S. minnesota, 4 штамма
Y. pseudotuberculosis, 105 природных изолятов, лабораторных штаммов и их производных, от­
носящихся к различным подвидам К pestis, разработан оригинальный комплекс методических
приемов для фагового и электрофоретического скрининга штаммов и липоолигосахаридов, что
стало основой детального изучения молекулярной организации липоолигосахаридов возбуди­
теля чумы, разработки методов дополнительной подвидовой и географической дифференциа­
ции штаммов, выявления новых молекулярных механизмов адаптационной изменчивости воз­
будителя чумы.
2 Впервые установлены полные структуры кора и липида А липоолигосахаридов штам­
мов Y pestis биоваров antiqua, medievalis и orientalis основного подвида (subsp pestis), а также
штамма, относящегося к подвиду caucasica, и определена природа их гетерогенности, объясне­
на иммунохимическая вариабельность и отсутствие перекрестною протективиого иммунитета
при иммунизации липоолигосахаридами или моноклональньти антителами к препаратам, син­
тезированным при температуре 25 ° С Найдены особенности молекулярной организации липо­
олигосахаридов штаммов Y. pestis subsp caucasica, которые опредеяякут их высокую вирулент­
ность для полевок и лабораторных мышей и низкую - для большинства грызунов и человека
3 Разработан оригинальный комплекс методических приемов для проведения иммунохимвческого анализа липоолигосахаридов Y pestis Методическая схема включает способы
29
тестирования - реакцию диффузионной преципитации, реакцию непрямой гемагглютинации и
конкурентого торможения, иммуноферментный анализ, различные приемы презентации липоолигосахаридов, истощение антисывороток, химическую модификацию липоолигосахаридов
(дезацилированис, дефосфорилировавве)
4 Впервые показано существование опосредованного липоолигосахаридами механизма
противодействия возбудителя чумы запуску и функционированию механизмов специфической
и неспецифической резистентности млекопитающих Липоолигосахариды, синтезированные
при температуре тела млекопитающих изменяет антигенную специфичность кора, в меньшей
степени индуцируют синтез провоспалительных цитокинов и развитие неспецифической рези­
стентности макрорганизма Этот механизм позволяет патогену минимизировать развитие вос­
палительных защитных реакций организмом хозяина и избежать опсонизации специфическими
антителами
5 Рекомбинантные штаммы аттенуированных сальмонелл, экспрессирующие иммуногенный нативный капсульный антиген чумного микроба, обеспечивают защиту лабораторных
животных от высоких заражающих доз с первых дней после парентеральной иммунизации
(штамм S minnesoio R595 p F S l , патент № 2046145 от 29 07 1992), протективны при оральных
способах иммунизации (штамм Styphimurium SL3261 pFSl)
6 Детоксифицированные производные липида А грамотрицательных бактерий оказыва­
ют выраженное иммуномодулирующее влияние на процесс вакцинации Образование комплек­
са монофосфорил липида А с капсульньп* FI антигеном повышает защитные свойства послед­
него в ранние сроки иммунизации
7 рНб антиген при выраженной антигенности (А С 1797351. (СССР) М К И G01N33/53),
митогенности и важной роли в патогенезе чумы не обладает- протективностью для лаборатор­
ных животных при использованных способах представления Химическая (формалинизацяя) и
термическая обработка рПб антигена сопровождается изменениями степени его полимериза­
ции, антигенных и биологических свойств, а также способа презентации, но это не придает ему
протективных свойств
8 Изменение способа презентации секретируемых белковых антигенов чумного
микроба,
использушсьпс
в
комбинациях
с детоксифицированными
производными
лвпополисахаридов, их экспрессия в аттенуированных сальмонеллах, позволяет получать
препараты, которые обладают протективностью в ранние и отдаленные сроки после
иммунизации Разработана биотехнология конструирования молекулярных и рекомбинантных
иммунопрофилактических препаратов и получены новые экспериментальные препараты для
экстренной и плановой профилактики чумы (патент 2046145 от29 07 1992).
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
1.
А-С 1797351 (СССР) М К И G01N33/53. Способ получения диагностикума для выявле­
ния I антигена чумного и псевдотуберкулезного микробов //Гремякова Т А , Степаншина В Н ,
Волковой К И. 3 д., приоритет от 5 11 90
2.
Гремякова Т. Л , Анисимов А. П , Степаншина В Н , Говорунов И Г Экспрессия капсульного антигена чумного микроба в микроорганизмах с S- и R- формами липополясахаридов
// Актуальные вопросы профилактики опасных инфекционных заболеваний Мат докл Межве­
дом науч конф 26-28марта 1991 г -Киров, 1991 -С 198-199
3
Гремякова Т А , Степаншина В Н , Мицевич Е В , Негрий В Ф Антигенная структура
и ростовые свойства клеток чумного микроба в средах различного состава при 37°-ном культи­
вировании // Актуальные вопросы профилактики опасных инфекционных заболеваний Мат
докл Межведом науч конф 26-28 марта 1991 г-Киров, 1991 - С 194-195.
30
4
Степаншина В Н , Гремякова Т А , Анисимов А П , Коробова О В , Кудрявцева Т Ю
Сравнительная характеристика препаратов капсульного антигена возбудителя чумы, выделенных
ич штаммов-продуцентов с R-формами липополисахаридов // Актуальные вопросы профилакти­
ки опасных инфекционных заболеваний'Мат докл Межведом иауч конф 26-28 марта 1991 гКиров, 1991 - С 197-198
5
Гремякова Т А , Анисимов А П , Степаншина В Н , Кудрявцева Т Ю , Коробова О В ,
Говорунов И Г. Новый штамм-продуцент капсульного антигена Yersinia pestis II Новые техноло­
гии и биосистоиы М а т . докл X I V науч.-практ конф 21-23 мая 1991 г - Оболенск, 1991. - С 7375,
6 Алимов А П , Гремякова Т А , Ковалев Ю Н , Анисимов А П Клонирование и экспрес­
сия капсульного
антигена чумного микроба в клетках Salmonella typhi Tu21a и
Salmonella minnesota R e 595 // Новые технологии и биосистемы Достижения и перспективы
Мат докл X r V науч -практ конф 21-23 мая 1991 г. - Оболенск, 1991. - С 6-8.
7
Гремякова Т А , Анисимов А П , Говорунов И Г Секреция капсульного антигена воз­
будителя чумы в энтеробактериях // Новые технологии и биосистемы Достижения и перспекти­
вы Мат докл X r V науч -практ конф 21-23 мая 1991 г, - Оболенск, 1991 - С 9-11
8
Гремякова Т А , Степаншина В Н , Шулюпин О К Поиск зависимости между антиген­
ной структурой, ростовыми свойствами н составом питательных сред для клеток вакцины чум­
ного микроба // Новые технологии и биоеистемы Мат докл X I V науч -практ конф 21-23 мая
1991 г - Оболенск, 1991 - С 68-70
9
Степаншина В Н , Гремякова Т А., Анисимов А П Биологическая активность нативного и модифицированного рНб антигена чумного микроба // Новые технологии и биосистемы
Мат докл X r V науч.-практ конф 21-23 мая 1991 г-Оболенск, 1991 - С 11-13
10 Стгатаншина В Н , Гремякова Т А., Анисимов А П , Потапов В Д Выделение и свой­
ства рНб антигена чумного микроба // Новые технологии и биосистемы Мат докл XTV науч практ конф. 21-23 мая 1991 г - Оболенск, 1991а - С 78-80
11 Гремякова Т. А., Стя1аншина В Н , Благо датских А. Я Влияние условий культивирова­
ния штамма Y pestis E V Н И И Э Г на антигенный состав и выход биомассы // Мат докл 6-ой
Всесоюзи науч конф Рос Общ Микробиол (Т 2) 1991г - Нижний Новгород, 1991 -С 78-80.
12 Гремякова Т Л , Шулюпин О К , Мвцевич Е В , Фролов Б. Ф Компоненты питатель­
ных сред, влияющие на конечный выход биомассы чумного микроба // Мат докл 6-ой Всесоюзн науч. конф Рос Общ Микробиол. (Т. 2) 1991 г Нижний Новгород, 1991 - С 61-62
13. Гремякова Т А., Степаншина В Н , Коробова О В , Анисимов Г А Изучение возмож­
ности создания молекулярной противочумной вакцины // Генетика и биохимия вирулентности
возбудителей О О Н / / М а т Рос науч. конф 1992 -Волгоград, 1992 - С 63
14 Гремякова Т А., Степаншина В Н., Коробова О. В , Анисимов Г. А. Протективная ак­
тивность рекомбинантного штамма Salmonella minnesota R595/GSA, синтезирующего капсульный антиген чумного микроба при эксп^иментальиой чуме мышей // Ж Мол Биол Ген Вирусол -1993 - N 1 - С. 23-30
15 Гремякова Т А., Степаншина В. Н., Шулюпин О К , Мицевич Б В., Негрий В Ф Экс­
прессия основных антигенов Yersinia pestis в питательных средах различного состава при темпе­
ратуре 37 °С IIЖМЭИ
- 1993 - N. 1. - С 16-20
16 Амельчевко В В , Грошпсова Т А , Ковалев Ю Н Изучение феномена гетерологичной
защиты, обусловливаемой R-мутантами грамотрицательных бактерий при чуме // Иммунология
и специфическая профилактика особо опасных инфекций Мат Рос науч конф 21-23 сентября
1993г -Саратов, 1993 - С 20-21.
31
17 Гремякова Т А., Орлов М Ф , Ковалев Ю Н , Анисимов А П Изучение гуморального
иммунитета при экспериментальной чуме у мышей // Иммунология и специфическая профилак­
тика особо опасных инфекций Мат Рос Научи Конф 21-23 сентября 1993 г -Саратов, 1993 С 20-21
18 Гремякова Т А , Степаншина В Н , Коробова О В , Анисимов Г А , Негрий В Ф Протективность продуцента капсульного антигена чумного микроба Salmonella minnesota R595 pFS 1
при экспериментальной чуме у мьппей // Иммунология и специфическая профилактика особо
опасных инфекций Мат Рос Научн Конф 21-23 сентября 1993 г -Саратов, 1993 -С 143-144
19 Грелякова Т А , Степаншина В Н , Михина Л В , Коробова О В , Анисимов Г А. Ди­
намика фагоцитарной активности перитонеальных макрофагов мышей, иммунизированных
экспериментальными чумными вакцинными препаратами // Иммунология и специфическая
профилактика особо опасных инфекций Мат Рос науч конф 21-23 сентября 1993 г -Саратов,
1993 -С 17-18
20 Гремякова Т А , Фурсова И К , Ковалев Ю Н , Анисимов Г А Экспрессия капсульного
антигена чумного микроба штаммами-продуцентами на средах различного состава // Иммуноло­
гия и специфическая профилактика особо опасных инфекций Мат Рос науч конф 21-23 сен­
тября 1993 г -Саратов, 1993 -С 167-168
21 Михина Л В , Гремякова Т А , Степаншина В Н , Коробова О В , Анисимов Г А Изу­
чение макрофагальных механизмов поствакцинального иммунитета при экспериментальной
чуме // Иммунология и специфическая профилактика особо опасных инфекций Мат Рос науч
конф 21-23 сентября 1993 г -Саратов, 1993 - С 30-31
22 Степаншина В Н , Гремякова Т А , Анисимов А ГГ, Потапов В Д Физико-химическая
и биологическая характеристика рНб-антигена Yersinia pestis, выделенного иммуносорбционным
методом//ЖМЭИ - 1993 - № 3 -С 12-17
23 Анисимов А П , Гремякова Т А , Амельченко В В Изучение протективности "химиче­
ской" и убитой эксперимбнтальных вакцин серовара FI-3 в отношении гомологичного штамма
К pestis II Профилактика и методы борьбы с чумой Мат межгосударственной науч конф поев
100-летию открытия возбудителя чумы 6-7 сентября 1994 г. - Алма-Ата,- С 59-60.
24 Гремякова Т А , Степаншина В Н , Негрий В Ф , Коробова О В , Анисимов Г А ,
Аполлонии А В , Лиходед В Г Сравнительная характеристика препаратов капсульного антиге­
на F1 Yersinia pestis, полученных из штаммов-продуцентов с различной структурой липополисахаридов//ЖМЭИ -1994 - № 3 -С. 10-14
25 Анисимов А П , Гремякова Т А , Андрющенко Б Н , Амельченко В В Протективная
активность препаратов серологически атипичных вариантов капсульного антигена в отношении
возбудителя чумы с атипичной капсулой // Проблемы особо опасных инфекций - 1994 - Вьш 4
(74) -С. 210-218,
26. Фурсова Н К Алимов А. П , Гремякова Т А Особетности экспрессии и наследования
плазмид, кодирующих синтез протективных атнигенов Yersinia pestis в клетках гетерологичных
реципиентов//Генетика - 1994 -Т 30 (Приложение) - С 168
27 Гремякова Т А , Амельченко В В , Анисимов Г А Ранняя защита при эксперимен­
тальной чуме животных, иммунизированных рекомбинантной чумной вакциной // Бюлл эксп
биол имел. - 1995 - № 1 -С 54-57
28 Гремякова Т А , Анисимов А П , Захарова И М Взаимосвязь способности к экспрес­
сии различных серовариаитов капсульного антигена Yersinia pestis со степенью редуцированно­
сти липополисахарида бактериальных клеток//ЖМЭИ -1995 - № 1 - С 3-6
32
29 Степаншина В Н , Гремякова Т Л , Коробова О В , Анисимов Г А Взаимосвязь между
составом капсульного антигена Yersinia pestis и его протективной активностью // Ж М Э И 1995 X^2 - С 124.
30 Патент на изобретение №2046145 Р Ф , МКИC12N15/31,1/2I//C12RI 42 (C12N1/21)
Заявка №5057015/13 Приоритет изобретения 20 10 95 Рекомбинантный штамм Salmonella
minnesota R595 pFSI - продуцент капсульного антигена чумного микроба / Степаншина В Н ,
Гремякова Т А , Анисимов А П , Анисимов Г А , Коробова О В , Ежов И Н , Лиходед В Г ,
(РФ)
31 Гремякова Т А , Анисимов А П Серологическая активность антигена "фракция I "
Yersinia pestis определяется его белковым компонентом // Гомеостаз и инфекционный процесс
Мат докл Международ науч конф 1996 г - Саратов, 1996 - С 319
32 Гремякова Т А , Фурсова Н К , Фомченков В М , Волковой К И Сравнительная ха­
рактеристика физических и биологических свойств ЛПС Yersinia pestis и R-мутатнов энтеробактерий//Микробиология - 1996 -Т 65 - Х а б -С 763-767.
33 Гремякова Т А., Ремнева Л В , Титарева Г М , Бахтеева И В Изучение т vivo и in vitro
рекомбинантного штамма АгоА ^. typhimurium SL3261, стабильно наследующего плазмиду p F S l ,
кодирукяцую синтез капсульного антигена Y pestis II Мат науч -практ конф посвященной 100летию образования противочумной системы (Том I) 1997 г - Саратов, 1997 - С 28
34 Фурсова Н К , Красильникова В М , Гремякова Т А. Особенности генетической пере­
дачи, наследования и экспрессии плазмид, содержащих/ла-оперон чумного микроба, в клетках
аттенуированных сальмонелл // Мат науч -практ конф, посвенные 100-легию образования
противочумной системы (Том II) 1997 г Саратов, 1997 - С 145
35 Фурсова Н К , Красильникова В М , Гремякова Т А Рекомбинантные плазмиды, со­
держащие Fra-оперон чумного микроба особенности генетической передачи, наследования и
экспрессии в клетках атгенуированных энтеробактерий // Вести Акад Мед Наук - 1997 - № 6 С 11-16
36 Ш м е л » В А , Гремякова Т А , Амельченко В В Иммуномодуляция протективной ак­
тивности рекомбинантного капсульного антигена Y. pestis цитокинами // Мат науч -практ конф
посвященной 100-летию образования противочумной системы (Том I) 1997 г Саратов, 1997С 258
37 Anisimov А Р , Amelchenko V V , Andruschenko В N , Greniyakova Т А СаПМ-mutant
Yersinia pestis variant avoids immunity induced by its own subunit or killed vaccine preparations // NederlandsTijdschriftVoorMedischeMiCTobiology - 1998 - V 6 - S I I - S 35.
38 Anisimov A. P , Gremyakova T A L P S structure determines the serovariant of epitopes of cap­
sular antigen in enterobacteria carrying C«7/3l/-daniaged Fra operon from Yersinia pestis II Nedcrlands
Tijdschrift Voor Medische Microbiology - 1998 - V 6 - S I I - S 17
39 Gremyakova T A Fursova N K, Remneva L P , Shaihutdinova R A , Zilenkov E L Tem­
perature restricted lyses of Yersinia pestis cells by enterobacterial R-Hpopolysaccharide specific F P l
phage//Nederlands Tijdschrift Voor Medische Microbiology 1998 - V 6 - S I I -S 19
40 Gremyakova T A , Stepanshina V N , Anisimov A P , Potapov V N Characterization of na­
tive and modified pH6 antigen of Yersinia pestis II Nederlands Tijdschrift Voor Medische Microbiology
- 1998 - V 6 - S U - S 19
41 Gremyakova T A , Titareva G M , Bakhteeva 1 V , Remneva L V , Krasilnikova V M Aro A
Salmonella typhimurium S13261 expressing Yersinia pestis capsular F I antigen plasmid maintanance and
protectivity/ZNederlandsTijdschrift Voor Medische Microbiology-1998 - V 6 -SII -S 17
33
42 Gremyakova Т A , Modulation of the protective properties of plague vaccine preparations by
monophosphoryl lipid A // Nederlands Tijdschrift Voor Medische Microbiology - 1998 - V 6 - SIX S. 36
43 Gremyakova T A , Shaihutdinova R. A Antigenic shift of Yersinia pestis lipopolysaccharides
expressed at various cell growth temperature // Nederlands Tijdschrift Voor Medische Microbiology 1998 -V. 6 - S I I . - S . 17.
44 Жиленков E Л , Фомченков В М., Новиков И А , Садомов В.Э , Оборотов М В., Гремякова Т А Изучение взаимодействия фагов микроорганизмов с использованием методов флюориметрии и элсктроориентационной спектроскопии//Вест Рос Акад Мед Наук 1999 - N 12 С 24-29
45 Горшков О В Попов Ю. А. Плотников О П , Виноградова Н Д., Гремякова Т. А. Савостина Е П Микробиологические свойства коллекционных штаммов Yersinia pestis II Проблемы
медицинской и экологической биотехнологии. Мат докл Юбилейная науч конф посвященная
25-летию Г Н Ц прикладной микробиологии (14-15 декабря 1999 г, Оболенск) - Оболенск, С 48
46 Балахонов С В Белькова С А., Шайхутдинова Р 3 Гремякова Т. А., О возможности
внутривидового типирования Yersinia pestis бактериофагов F P 1 и FP3 // Матер межрегиональной
научно-практич конф^жнции "Актуальные аспекты природно-очаговых болезней", посвященной
80-летию Омского Н И И природно-очаговых инфекций М З России. - Омск, 16-17 окт2001 г С 170-172
47 Виноградов Е В , Линдлер В , Кочарова Н А., Сенченкова С И , Шашков А С , Книрель Ю А , Холст О , Шайхутдинова Р 3 , Гремякова Т А , Анисимов А П // Структура коро­
вой части липополисахаридов чумного микроба Проблемы инфекционной патологии в регио­
нах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера Вторая науч конф. с международным ifMacmем Новосибирск, 29-31 мая, 2002 г -С 217-218,
48 Gremyakova Т А , Vmogradov Е V , Lmdner В , Kocharova N А , Senchenkova S N ,
Shashkov А S , Knirel Y u А., Hoist О , Shaikhutdinova R. Z , Anisimov A. P Influence of growth
tenperature on the core struaure of the lipopolysaccharide of Yersinia pestis strain KM218 //8* Interna­
tional Symposium on Yersinia (September 4-8, 2002, Turku, Finland) - Tuiku, 2002 - P 67-68
49 Shaikhutdinova R Z , Gremyakova T A , Zhilenkov E L , Dentovskaya S V , Anisimov Л P
Phage-susceptibility testing and LPS-electrophoretic mobility analysis of different Yersinia pestis "subspecies"//8* International Symposium on Yersinia (September 4-8, 2002, Turku, Finland) - Turku,
2002 -P 71
50 Vinogradov E V , Lmdner В , Kocharova N A , Senchenkova S N , Shashkov A S , Knirel
Y A , Hoist О , Gremyakova T A., Shaikhutdinova R Z and Anisimov A. P. The core structure of the
lipopolysaccharide from the causative agent of plague, Yersinia pestis // Carbohydrate Research. 2002 V 337 -P. 775-777
51 Gremyakova T A , Vinogradov E. V , Lindna В , Kocharova N A , Senchenkova S N . ,
Shashkov A S , Knirel Y A , Hoist О , Shaikhutdinova R Z , Anisimov A P The core structure of
the lipopolysaccharide of Yersinia pestis strain KM218 Influence of growth temperature // In M
Skuraik, J A Bengoechea, К Granfors (eds), The genus Yersinia Entering the fiinctional genomic era,
Advances in experimental medicine and biology, vol 529 Kluwer Academic / Plenum publishers. New
York. - 2003. - P 229-232
52 Knirel Y A , E Vinogradov, S N Senchenkova.N A Kocharova, В Lmdner, О Hoist, R Z
Shaikhutdinova, Anisimov A P , T A Gremyakova Structural variability of the lipopolysaccharide of
Yersinia pestis //The Carbohydrate Woitehop 2003 (March 27-30, 2003, Gustrow-Rostock, Germany)
34
53 Knirel Y A , Vinogradov E V , Senchenkova S N , Kocharova N A , Lindner В , Hoist О ,
Shaikhutdinova R Z , Anisimov A P Gremyakova T A Temperature-dependent variations in the
lipopolysaccharide structure of Yersinia pestis //XII* European Carbohydrate Synqjosium (July 6-11,
2003, Grenoble, France) - Grenoble, 2003 - P. 120.
54 Анисимов A П , Книрель Ю A , Виноградов E В , Линднер Б , Кочарова Н А , Дентовская
С В , Фурсова Н К , Бахтеева И В , Титарева Г М., Шашков А С , Шайхутдинова Р 3, Сенченкова
С Н , Гремякова Т А , Холст О // Лшюолигосахарид (ЛОС) Yersinia pestis -один из основных
факто-ров патогеняости и возможная мишень для химиотерапии Биотехнология
состояние и
перспективы развития Матер. 2-го Московского международного Конгресса (10-14 ноября 2003
г . Москва) М ■ ЗАО " П И К "Максима". Р Х Т У им Д И Менделеева С 15
55 Anisimov А Р , Vinogradov Е V , Lindner В , Shaikhutdinova R.Z, Dentovskaya S V , Fursova
N К , Bakhteeva 1V , Titareva G M , Kocharova N A , Senchenkova S N , Hoist О , Gremyakova T A.,
Pier G В , Knirel У A Temperature-dependent variations in the l^opolysaccharide structure and
biological properties of Yersinia pestis IIJBC - (submitted).
СПИСОК ДОКУМЕНТОВ о ВНЕДРЕНИИ Н А У Ч Н Ы Х РЕЗУЛЬТАТОВ В ПРАКТИКУ
4
М 15 234 - 90 Методика лабораторная способа использования стандартного ипокулята
для проверки ростовых качеств плотных питательных сред Утверждена 27 04 1990 зам дирек­
тора В Н И И П М проф Волковым В Я (учрежденческий уровень внедрения)
5
М Л 15 272 -90 Методика лабораторная по усовершенствованию питательной среды для
периодического глубинного культивирования с аэрацией в колбах вакцинного штамма чумного
микроба E V Н И И Э Г при температуре 27 "С Утверждена 30 07 1990 зам директора В Н И И П М
проф Боровиком Р.В.
6
М 15 233 - 90 Методика лабораторная оценки качества жидких питательных сред с по­
мощью референс-инокулята Утверждена 21 05 1990 зам директора В Н И И П М проф Волко­
вым В Я .
7
Гремякова Т А , Степаншива В И , Анисимов А П , Ежов И Н Штамм Salmonella minnesota K M l - продуцент капсульного антигена F I Yersinia pestis Справка о депонировании охра­
носпособного штамма в Российской коллекции патогенных бактерий "Микроб" от 27 02 92 г
8
Акт внедрения бактериофага FP1 от 26 марта 1999 г , РосНИПЧИ «Микроб», Саратов
Утвержден директором Р о с Н И П Ч И «Микроб» Кутыревым В В
9
Акт внедрения рекомбинаятного штамма Salmonella minnesota R595pFSl (продуцент
капсульного антигена F I Yersinia pestis) от 26 марта 1999 г Утвержден директором РосНИПЧИ
«Микроб» Кутыревым В В
10
Акт внедрения бактериофагов FP1 и FP3 от 18 марта 2003 г Н И П Ч И Сибири и Дальнего
Востока Утвержден директором НИПЧИСДВ проф Голубинским Е П
11
Акт вне;<рения препарата рекомбинантного капсульного антигена СаП Y. pestis # 59 от
16 апреля 2003 г АООТ "Институт инженерной иммунологии" РАО "Биопрепарат" Утвержден
директором АООТ Пчелинцевым С Ю
12
Акт внедрения препарата липополисахарида Y. pestis # 60 от 16 апреля 2003 г АООТ
"Институт инженерной иммунологии" РАО "Биопрепарат" Утвержден директором АООТ Пче­
линцевым С Ю
35
БЛАГОДАРНОСТИ
Моя искренняя признательность моему научному консультанту - профессору Констан­
тину Ивановичу Волковому, за постоянное внимание и интерес к проводимой работе, возмож­
ность логического обобщения и завершения проделанного большого этапа работы
Считаю своим приятным долгом выразить искреннюю благодарность всем моим соав­
торам - сотрудникам Г Н Ц прикладной микробиологии Р А О "Биопрепарат" (Оболенск, Мос­
ковская обл), И О Х им Н Д Зелинского Р А Н (Москва), РосНИПЧИ "Микроб" (Саратов),
Н И П Ч И Сибири и Дальнего Востока (Иркутск), принимавшим участие в планировании и про­
ведении экспериментов, обсуждении их результатов и оказывавшим помощь в оформлении
диссертации
Благодарю директора Г Н Ц П М д ф-т н , проф В Я Волкова, за создание условий для
проведения экспериментов, представленных в настоящей работе, и директора М Н И И Э М им
Г Н Габричевского д м н , проф В А Алешкина за предоставленную возможность защитить
диссертацию на Специализированном Совете Д 208 046 01 по присуждению ученой степени
доктора медицинских наук
Пользуясь случаем, приношу искреннюю признательность всем рецензентам настоящей
работы за многочисленные замечания, вопросы и поправки, которые, по возможности, были
учтены и, в ряде случаев, помогли уточнить, а иногда и пересмотреть некоторые положения и
формулировки
36
Отпечатано в копицентре «Учебная полиграфия»
Москва, Ленинские горы, МГУ, 1 Гуманитарный корпус
www.btprint ГЦ e-mail: zakaz(aistprint.ru тел 939-3338
Закач Х» 434, тираж 120 экз. Подписано в печать 12.01 2004 г
Отпечатано в копицентре «Учебная полиграфия»
Москва, Ленинские горы, МГУ, 1 Гуманитарный корпус
www stprint ru e-mail- zakaz@stpnnt.ru тел 939-3338
Заказ № 434, тираж 120 экз Подписано в печать 12 01 2004 г.
РНБ Русский фонд
2006-4
23500
^
-
'
■
-
\
KS^J
17 я;-;?. 2004
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
0
Размер файла
1 994 Кб
Теги
bd000103049
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа