close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

bd000103312

код для вставкиСкачать
На правах рукописи
Азизов Олег Валерьевич
Полярографическое исследование NO-донорной активности лекарственных
веществ на основе С-ншросоединений
15.00.02. - фармацевпгическая химия, фармакогнозия
АВТОРЕФЕРАТ
Диссертации на соискание ученой степени
кандидата фармацевтических наук
Москва-2003
Работа выполнена в Московской медицинской академии им. И.М. Сеченова
Научные руководители:
■ доктор фармацевтических наук, академик
РАМН, профессор Арзамасцев А.П.;
- доктор химических наук, профессор
Григорьев Н.Б.
Официальные оппоненты:
- доктор фармацевтических наук,
профессор Пятин Б.М.
- доктор фармацевтических наук,
профессор Казьмина Э.М.
Ведущая организация:
- Институт Государственного контроля ле­
карственных средств НЦ ЭСМП МЗ РФ
Защита состоится «^ ?» GRH'HJU^AJ- 2003 г. в j ^у^час на заседании Дис­
сертационного совета Д.208.040.09 в Московской медицинской академии им.
И.М.Сеченова (121019 Москва, Никитский бульвар, 13)
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ММА им. И.М.Сеченова
(117998 Москва, Нахимовский проспект, 49)
Автореферат разослан «.!> » ^^ЮлУ^
2003 i
Ученый секретарь Диссертационного совета
доктор фармацевтических наук
Н.П. Садчикова
f^
..3.0«
3
Общая характеристика работы
Актуальность проблемы
Изучение биологического действия оксида азота (N0) - новая и чрез­
вычайно быстро развивающаяся область биохимии и биохимической фарма­
кологии. До конца 80-х годов, пока не было доказано существование эндо­
генного оксида азота (синтезируемого из L-аргинина при участии специаль­
ных ферментов - NO-синтаз в различных органах и тканях), никто не предпо­
лагал, что такая простая молекула, как N 0 может выполнять важнейшие
функции в организме млекопитающих. Отсюда понятен интерес к поиску но­
вых соединений (потенциальных лекарственных средств), способных умень­
шать или увеличивать количество оксида азота в функциональных системах
организма.
Данная работа включает в себя полярографическое исследование хи­
мического и электрохимического превращений бронопола, метронидазола,
нитазола и гем-полинитрометильных производных 1,3,5-триазина. В связи с
наличием у вышеперечисленных соединений нитро-группы, их можно рас­
сматривать как потенциальные источники оксида азота, и, принимая во вни­
мание известную цитотоксическую активность NO-доноров, представлялось
важным исследовать возможность отщепления N 0 данными соединениями в
условиях электрохимического превращения и под воздействием химических
реагентов.
Цель и задачи исследования
Целью настоящей работы явилось
доказательство
наличия
N0-
донорных свойств изучаемых веществ в условиях химического окисления,
восстановления или гидролиза.
Для достижения поставленной цели были решены следующие задачи:
• Модифицирование имеющихся полярографических методик определе­
ния NO-донорных свойств применительно к предметам исследования.
• Полярографическое исследование химических превращений
лекарственных веществ на основе С-нитросоединений.
И>С НАЦИОНАЛЬНАЯ
БИБЛИОТЕКА
С Петербург
Мв^РК
4
• Изучение механизма электрохимического и химического поведения
исследуемых соединений.
Научная новизва
На основании полученных результатов предсказана шгготоксическая
активность изученных соединений, связанная с генерацией оксида азота и
подтвержденная результатами биохимических испытаний.
Выдвинуто предположение, что антимикробное действие бронопола
обусловлено высокой окислительной способностью пероксинитрит-аниона,
образование которого возможно при химическом окислении и гидролизе
бронопола в кислородсодержащей среде.
Предположено,
что
противоопухолевое
действие
гем-
полишпрометильных производных 1,3,5-триазина связано с процессами их
биотравсформации, в результате которой могут выделяться такие цитотоксические продукты как оксид азота и пероксинитрит-анион.
Предложена схема гидролитических превращений метронидазола и нитазола в щелочных растворах. Предложен новый механизм антимикробного и
антшфотозойного действия метронидазола и нитазола, основывающийся на
возможности образования in vivo цигогоксических нитро-анион-радикалов и
пероксинитрит-аниона.
Предложен полярографический метод качественного и количественно­
го определения бронопола, метронидазола и нитазола в субстанции.
Практическая значимость
Показана перспективвость поиска новых цитотоксических и цитостатических лекарственных средств среди С-нитросоединений
Поляроп)афический метод качественного и количественного определе­
ния исследуемых лекарственных веществ может применяться как альтерна­
тивный при контроле качества данных препаратов.
Апробация работы
Основные результаты исследований докладывались на Международном
фармацевтическом конгрессе (г. Вена, 2000 г.), на IX и X Российских нацио-
нальных конгрессах "Человек и лекарство" (г. Москва 2002 и 2003 г.), на за­
седании кафедры фармацевтической химии ММА им. Сеченова (г. Москва,
30 мая 2003 г.)
Связь выполненной работы с проблемным планом фармацевтиче­
ских наук и производства. Диссертационная работа выполнена в рамках
темы НИР "Совершенствование контроля качества лекарственных средств"
Основные положения, выносимые на защиту:
•
Результаты исследования гидролитических и окислительных превра­
щений бронопола
•
Результаты изучения электрохимического и химического восстановле­
ния исследованных производных 1,3,5-триазина
•
Результаты исследования гидролитических превращений метронидазо-
ла и нитазола
Структура и объём диссертации
Диссертация состоит из введения, обзора литературы, четырех глав
экспериментальных исследований и списка литературы. Работа изложена на
136 страницах машинописного текста, содержит 10 таблиц, 19 схем и 25 ри­
сунков, библиография включает ISO наименований.
Содержание работы
Во введении обоснована актуальность темы диссертации, её научная
новизна и практическая значимость работы. В обзоре литературы обобщены
данные о биологической роли оксида азота.
Во второй главе на основании полученных данных предложена схема
ион-радикального окисления бронопола и выдвинуто предположение о том,
что механизм действия бронопола обусловлен образованием при окислении
кислородом воздуха сильного окислителя перюксинитрита. Представлены две
методики количественного определения бронопола.
В третьей главе исследована и доказана NO-донорная активность неко­
торых прюизводных гем-полинитрометильных производных 1,3,5-триазина.
6
в четвертой главе полярографически показано, что известный лекарст­
венный препарат метронидазол может быть экзогенным донором оксида азо­
та Предложен механизм генеравд1и N O при гидролитических превращениях
метронидазола. Описана методика количественного определения метронидазола.
В пятой главе доказывается выделение оксида азота при гидролитиче­
ских и восстановительных превращениях химиотерапевтического препарата
нитазол. Представлена количественная методика анализа нитазола.
Основное содержание работы
1.0бьекты и методы исследования.
В работе использовались реактивы классификащ1и х.ч. Все растворы
готовились на дистиллированной воде. Полярофафические измерения про­
водились в растворах, предварительно освобожденных от кислорода воздуха
пропусканием тока азота в течение 3-х минут, по трехэлектродной схеме с
использованием универсального полярофафа ПУ-1 (Беларусь) и автоматизи­
рованной системы на основе ПУ-1, а также двухкоординатного самописца
ЛКД4-003 ( Р Ф ) .
2.Исследование механизма генерации оксида азота антимикробно­
го препарата "бронопол"
Противомикробное средство бронопол - 2-бром-2-нитропропан-1,3диол - один из наиболее широко применяемых консервантов. Антимикробное
действие бронопола в настоящее время приписывается выделяющемуся в
процессе биотрансформации формальдегиду, а также элеетроакцепторным
свойствам атома брома в его молекуле.
Целью данной работы бьшо исследование особенностей полярографи­
ческого восстановления бронопола, необходимое для разработки полярофафической методики его количественного определения, а также исследование
гидролитических и окислительных превращений этого соединения, в процес­
се которого происходит высвобождение нитрит-аниона.
7
Полярографическое поведение бронопола исследовалось в интервале
рН 0-12. На полярограммах бронопола имеются три волны. 1-я волна (как по­
казано на рис №1) в положительной области потенциала не зависит от рН и
соответствует восстановительному элиминированию брома с образованием
аниона соответствзтощего нитросоединения, которое при протонизации
кислых растворах частично (для 2-бром-2-нитропропана максимум
в
- до
33%) переходит в аци-форму (что представлено на схеме №1).
•,*
0,4
1^6
0,1
\,t
1^
1,1, -Ё,Ь(|.м.^
Рис.1 Семейство полярограмм бронопола в растворе 1 н HCIO4; концентра­
ция бронопола (1(Г* моль/л): 1 - 0; 2 - 1; 3 - 2,1; 4 - 3,1; 5-4,1.
В кислых растворах (рН<2) наблюдаются еще 2 волны, которые дает
образовавшаяся при потенциалах первой волны аци-форма
водного,
восстанавливающаяся
вначале
до
нитропроиз-
оксима (с потреблением
2-х электронов), а затем - до амина (с потреблением 4-х электронов) (схема
2):
■^-''"•^
~Чс-»Г°^^-
^J-^r^l^-HC^^
- » - : : C ^-^"
N'
>х„-> >-"^,*#™С,-^>-'^.
Схема 1
\^
„ И * +2e+2tf \
^С
N^
^
^/.
Т
:-=>._^c=NOH +
^,=^-*Si^
>
"^сн—NHj
+т
Схема 2
Химическая лабильность бронопола, влияет на его полярографическое
поведение, в частности, это проявляется неустойчивостью токов во времени.
Тем не менее, разработка количественных полярографических методик его
определения оказалась возможной при использовании концентрированных
фоновых электролитов, в особенности - сильнокислых. Нами были разрабо­
таны две методики с использованием в качестве фоновых электролитов 0,2 М
раствора перхлората натрия и 1 М хлорной кислоты. Обе методики характе­
ризуются высокой точностью и воспроизводимостью (табл. 1).
Таблица 1
Метрологические характеристики методов полярографического
определения бронопола
Параметры
а
1М НС104
70,091
0,2MNaCIO4
50,076
Ь
0,0273
0,1199
S
0,0650
г
Si
Р%
t
Дх
ё%
0,9999
0,0314
95
2,78
0,08729
1,24
0,1581 0,9998
0,0707
95
2,78
0,19654
2,9
Нахш были изучены процессы гидролиза бронопола, с одной стороны, в
условиях, когда в системе отсутствует окислитель, в том числе - кислород
воздуха, а с другой - когда в среду вводится дополнительный окислитель (пероксид водорода или феррицианид калия).
Исследование гидролиза бронопола в щелочных обескислороженных
растворах проводились непосредственно в полярографической ячейке. О
протекании процесса гидролиза судили по снижению во времени токов элек­
тровосстановления.
Высвобождение нитрита при гидролизе и окислении бронопола
подтверждалось нами с помощью реакции образования нитропруссид-аниова
(рис.2).
Все данные о выходе нитропруссид-аниона, полученные при пщролизе
и окислении бронопола, приведены в табл. №2. В этой же таблице для срав­
нения представлены данные для нитроэтана.
~^
о?5
cj*
n'l -Е^Е,((*».к.»)
Рис.2 Образование нитропруссид-аниона при окислении бронопола феррицианидом калия в деаэрированном растворе 0,01 H.NaOH. Концентрация
Кз[Ре(СМ)б] - 2 Ю ' моль/л; концентрация бронопола - 1,1 10' моль/л. 1 дифференциально-импульсная кривая исследуемого раствора; 2 - дифферен­
циально-импульсная кривая после добавки стандарта нитропруссида натрия.
Концентрация стандарта нитропруссида натрия - 8 Ю"* моль/л
10
Таблица 2
Выход нитропруссид-аниона при гидролизе и окислении бронопола
и нитроэтана при концентрации 10'^ моль/л
Условия процесса
Выход нитропруссид-аниона, %
для нитроэтана
для бронопола
Выдержка на воздухе водного
раствора при комнатной тем­
пературе 1 сутки
-
8
Прогрев 30 минут при 80" в
иепродутом буферном раство­
ре с рНЗ
0,6
4
Прогрев 30 мин-при 80° в про­
дутом растворе 0,01н.НаОН
ол
14
80
96
60
50
1
30
Прогрев 30 мин при 80° в
0,01 н. растворе NaOH в при­
сутствии 0,002М Кз[Ре(СК)б]
Прогрев 30 мин. при 80° в
0,01н. растворе NaOH в при­
сутствии 0,004 М Н2О2
Прогрев 30 мин при 80° в
фосфатном буферном растворе
с рН 5 в присутствии 0,004 М
Н2О2
Из данных таблицы видно, что присутствие окислителя в растворе
щелочи значительно повыщает выход нитропруссид-аниона для обоих
веществ. В особенности эта разница существенна для нитроэтана, который в
отсутствие окислителя, гидролитическим путем, практически не отщепляет
нитрит-анион (NOj'). Кроме того, таблица показывает существенное различие
в окисляемости нитроэтана и бронопола. В щелочных растворах между этими
веществами нет принцитшального различия, но в более мягких условиях
окисления, при рН 5, способность к отщеплению нитрит-аниона сохраняется
только у бронопола.
11
Полученные экспериментальные результаты использованы нами для
установления схемы окисления бронопола и уточнения механизма его противомикробного действия. Последовательность окислительных превращений
бронопола приведена на схеме 3.
"°-"К /■■■ .- ""'"К /"'
НО-СН^ \ ^
Н 0 - С 1 ^ N)5o -ВГ-
""""^•L
-он
•"-^Г
^N0,
2\,^"
Схема 3
°2
"°"°к *
Н0-С1^
.нр
^ -н+
но-сч
J"-"''k.
НО-СН^
При окислении кислородом в этом процессе обязательно появляются
активные формы кислорода ( А Ф К : супероксид-анион 0{,
радикалы ОН' и
НОз", пероксид водорода), а поскольку параллельно происходит также отще­
пление нитрит-аниона, весьма вероятным становится образование пероксинитрит-аниона по реакции;
NOj+Н2О2
V ONOO- + HjO
Таким образом, можно предположить, что механизм бактерицидного
действия бронопола должен быть обусловлен в первую очередь действием
пероксинитрита. Известно, что бронопол вызывает окисление сульфгидрильных фупп дегидрогеназных ферментов на поверхности клеточных стенок
микроорганизмов, и, скорее всего, этот эффект является следствием присут­
ствия в системе именно пероксинитрит-аниона, который представляет собой
чрезвычайно сильный окислитель. Кроме того, возможно воздействие самого
оксида азота на гемсодержащие ферменты микроорганизмов. Что касается
брома (действию которого в настоящее время приписывается бактерицидная
активность бронопола), то окислительное действие свойственно его радика­
лам и кислородным соединениям (как, например, бромноватистая кислота
( Н В Ю ) ) , которые могут образоваться в присутствии радикалов брома. Появ­
ление подобных соединений при чисто гидролитических превращениях не­
возможно, но предложенная схема как раз объясняет их образование как про-
12
дукгов окисления или диспропорционирования отщепляющихся при окисле­
нии радикалов брома.
З.Полярография
и
NO-донорная
активность
гем-
полинитрометильных производных 1,3,5-триазина
Известно, что производные триазина, имеющие в заместителях гемдинигрофуппу, обладают противоопухолевой активностью (Гидаспов, Бахарев -2000).
В
связи
с
полннитрометильных
наличием
во
производных
всей
изучаемой
группе
гем-
1,3,5-триазина (таблица №3) гем-
полинятро-группировки, которую, исходя из электрохимических свойств по­
добных соединений, можно рассматривать как потенциальный источник ок­
сида азота, и, принимая во внимание известную цитотоксическую активность
NO-доноров, представлялось целесообразным исследовать возможность от­
щепления N0 данными производными 1,3,5-триазина в условиях электрохи­
мического восстановленяя и под воздействием химических восстановителей
и затем сопоставить полученные данные с исследованиями цитотоксическои
акгавности в стандартных условиях.
Таблица 3
Потенциалы полуволн первых ступеней восстановления гемполинитрометильных производных триазина
Соединение
Е'|Л (нас.к.э.) в
водно-диметилформамидном (10%)
буферном растворе
срН5
уИг
лл
N^N
1 Н ^ ^ Т Г ^ОСЮйСЦОТ
-0,54
-E'I/2 (нас.к.э.) в
безводном диметилформамидном
растворе 0,02 М
перхлората тетрабутил-аммония
1,10
13
ш^ь
-0.42
1,04
-0,45
0,85
+0,21
0,60
+0,03
0,7
ЛЛ
-0,82 ( 5 % Д М Ф )
0,95
1
-0,84 ( 5 % Д М Ф )
1,07
лл
лл
2 (Сг"Л
«Cjll,),
ir^N
3 iKxiijCNOjbC-^
NIM^
tr
^qNo^avJH
H^H
4
сн^(н*г^соп0,
MUijb
N^N
Зсн^ЛД сцмрлр
NlCHJ,
I ^ N
б.(СН,),Й
N'^ ^0(NO,),ai,UI,CN
N1KII,
N-'S'^N
7Cir,l<II
N^'^aNO^CHjClljCOOCHi
В данной работе для всех соединений, кроме № 6 (соед №6 имеет низ­
кую растворимость, поэтому не могли быть приготовлены растворы с доста­
точно низким содержанием растворителя, где только и наблюдается волна
азотистой кислоты) в слабокислых небуферных растворах полярофафическнм методом была зафиксирована волна восстановления азотистой кислоты,
свидетельствующая об отщеплении нитрогруппы на предшествующих стади­
ях восстановления (схема 4):
R-C ( X ) (НОгЬ + 2е + Н* -> R-(X) C=N02" + H N O i
HNO2 + е + Н* -^ NO + Н2О.
Схема 4
14
В то же время электрохимические процессы восстановления во многих
случаях в значительной степени совпадают по направлению с химическим
восстановлением, что можно было ожидать и для исследуемых производных
1,3,5-1риазина. Действительно, для всех исследованных соединений восста­
новление с отщеплением нитро-группы было поягверждено положительной
реакцией Грисса (диазокомпонент - сульфаниловая кислота, азо-компонент а-нафтилэтилендвамин).
Кроме того, при исследовании влияния одного из производных - со­
единения № 1
на активность фермента растворимой гуанилатциклазы была
установлена активация этого фермента, что типично для доноров N 0 . Иссле­
дование проводили в Институте биомедицинской химии Р А Н в лаборатории
профессора И.С. Севериной. Таким образом, можно предполагать, что гемдинитро-производные триазина способны проявлять NO-донорные свойства
не только в условиях химического восстановления, но и в биологических
системах.
Потешшал первой волны характеризует относительную легкость отще­
пления нитро-группы в условиях восстановления, несмотря на то, что, в зави­
симости от рН и состава фонового электролита, этот процесс может быть за­
маскирован и наблюдаемые явления могут быть усложнены. То же относится
к одноэлектронным волнам образования анион-радикала, получаемым в не­
водном растворителе ( Д М Ф А ) .
С использованием полярографического метода в данной работе полу­
чены 2 группы значений потенциалов полуволн Е ' | Д , характеризующих от­
носительную способность исследованных соединений к отшеплению нитрофуппы (табл. 3).
Из данных таблицы 3 можно составить 2 ряда убывания относительной
NO-донорной активности (которая тем выше, чем более положительное зна­
чение имеет величина E'l/j);
4 > 5 > 2 = 3>1>6 = 7
для раствора с 10%ДМФ
4>5>3>6>2=7=1
для безводного раствора Д М Ф
15
Полученные ряды в цепом схожи, хотя полностью совпадают лишь для
первых членов (№ 4, 5). Из представленных данных видно, что динитроэтанольные производные (№ 1, 2 и № 3) близки между собой и занимают сред­
ние места по относительной активности. Соединение № 6, судя по вели­
чинам Е'|/2 , наименее активно. Наиболее акгавны производные, имеющие
дополн»ггельные электровоакцепторные группы - № 4 и № 5. Эти соединения
восстанавливались с отщеплением нитро-группы не только аскорбиновой ки­
слотой, но и ферроцианидом калия, что было подтверждено образованием
полярофафически-акгивного продукта - нитропруссид-аниова.
Таким образом, можно предположить, что противоопухолевое действие
исследованных полинитропроизводных триазина в какой-то мере связано с
процессами их биотрансформации, в результате которой могут выделяться
такие цитотоксические продукты как оксид азота и анион пероксинитрита.
4.Исследование механизма генерации оксида азота при химических
превращениях препарата "метронидйзол"
При изучении вопроса о том, в каких условиях метронидазол (142оксиэтил)-2-метал-5-нитроимидазол) может являться донором оксида азота,
нами первоначально исследовалось восстановление препарата такими реа­
гентами, как ферроцианид калия и аскорбиновая кислота. Однако, использо­
вание этих восстановителей при рН 3-7 не привело к появлению в растворе
нитрит-иона, как это происходит в случае производных 5-юггрофурана. Сле­
дует, тем не менее, указать, что при восстановлении метронидазола ксанганоксидазой реализуется целый ряд процессов, связанных с атакой по поло­
жениям 2 или 4 имидазольного цикла и его раскрытием, сопровождающимся
отщеплением азотистой кислоты.
Другая возможность высвобождения оксида азота из нитрозамещенных
имидазолов заключается в щелочном расщеплении соединений этого типа,
сопровождающемся дезароматизацией и элиминированием нитрогрулпы в
виде нитриг-аннона. С применением метода фиксации нитрит-аниона в виде
полярографически активного нитропруссид-аниона, а также путем проведе-
16
них реакции Грисса с раствором, полученным после нагревания препарата в
щелочном растворе, установлено, что при этом действительно образуется
нитрит-анион. Нами проводилось исследование кинетики гидролиза метронидазола, при этом константа скорости гидролиза метронндазола в 0,01 н.
NaOH при 80 "С равна ~1,610'* м и н ' (для сравнения к гидролиза 1-(2оксиэтил)-2-стирил-5-нитроимидазола в сходных условиях равна 6,4210''
мин'). В 0,1 и.NaOH отщепление нитрогруппы метронидазола (во всех слу­
чаях фиксируемое полярографичесюО протекает количественно за ЗОмин.
Существенно медленнее этот процесс протекает в боратном буферном ра­
створе при рН 10 (на 2-3% за 1,5 часа при SO^C). Возможная схема расщепле­
ния имидазольного цикла в метронидазоле, связанная с атакой гидроксиланиона по положению 4 имидазольного цикла приведена ниже (схема 5):
I
Mt-^'^^N'
11 _ н о ^
N0,
dHjCHjOH
M«TpOHMjqason
—*-Ho->![*
Г~15н"
М.-" ^ N - " " ^ N 0 ,
JCH
CHjCHjOH
■""
Г^Х^н
Н,0
HN'^ ^ ^ j " "'NO,
С
CfИ , О Н , О Н
^ MeCoMH, ♦ „ ^ , J < : "
CHjCHjOH
tl**^
Jlil^
CHjCHjOH
HNO,
CHjCHiOH
Схема 5
Подтверждением выделения оксида азота при дефадации метрон1шазола является активация этим препаратом фермента растворимая гуанилатциклаза (И.С. Северина). Степень активации зависит, как это характерно для
экзогенных доноров N 0 , от концентрации метронндазола. Найденные для
метронидазола NO-донорные свойства хорошо коррелировались с влиянием
этого препарата на такие гемодинамические параметры, как частота сердеч­
ных сокращений (ЧСС) и системное артериальное давление (АД) в экспери­
ментах на животных (крысы) Сравнение полученных результатов с данными
17
для типичного донора N 0 - изосорбита-5-монониграта показало, что эффек­
ты метронидазола и изосорбита-5-мононитрата весьма схожи. Такие экспе­
рименты были проведены В.А. Паршиным в отделе медицинской химии
ФГУП1ШОПИК.
Биохимические данные по активации растворимой гуанилащиклазы и
результаты фармакологического изучения, т.е. эксперименты, проведенные в
присутствии различных ферментов, показывают, что наши модельные опыты
in vitro, обнаруживающие возможность высвобождения оксида азота в ре­
зультате гидролитических превращений метронидазола, имеют достаточно
надежное обоснование. Разумеется, мы не можем утверждать, что принятый
механизм действия метронидазола должен быть полностью пересмотрен, ис­
ходя из его NO-донорных свойств. Однако, с нашей точки зрения, учитывать
это обстоятельство при рассмотрении вопросов о «мишенях», на которые
воздействует этот препарат в организме, совершенно необходимо. И здесь
следует указать еще на один фактор, связанный с высвобождением оксида
азота из молекулы метронидазола. Если в организме этот процесс протекает
при участии нтро-анион-радикала (образующегося при восстаиовлении нитрогруппы), становится возможным его взаимодействие с кислородом (в орга­
низме-хозяине, пораженном анаэробной инфекцией) с возвращением исход­
ного препарата и образованием супероксид-анион-радикала. Последний сразу
вступает во взаимодействие с оксидом азота с образованием пероксинитрита
(схема 6). Отсюда следует, что противомикробное действие метронидазола
может быть обусловлено и образованием пероксинитрита - сильнейшего
окислителя, разрушающего жизненно важные ферменты микроорганизмов.
RN02 =!=^* Ша;
Схема б
+ Ог
^ С^" + N0
cynepoKcmанион
► ONOO"
пврока«1фиг
18
В настоящей работе представляло интерес рассмотреть полярофафическим методом процесс электрохимического восстановления метронидазола
на капельном ртутном электроде (р.к.э.) с целью разработки методики его ко­
личественного определения.
Полярографическое поведение метронидазола определяется наличием в
его молекуле электрохимически активной -NO2 -фуппы, которая восстанав­
ливается до гидроксшгамина (с потреблением 4-х электронов), а затем - до
амина (с потреблением 2-х электронов), что соответствует на полярограммах
в кислых растворах двум волнам - первой четырехэлектронной и второй двухэлекгронной.
Нами были установлены оптимальные условия для количественного
определения метронидазола полярофафическим методом: в 0,4H.H2SO4
Ме­
тодика харакгеризуется простотой, точностью и воспроизводимостью и, та­
ким образом, может применяться
для количественного определения суб­
станции метронидазола (табл 4).
Таблица 4
Метрологические характеристики полярографического определе­
ния метронидазола
Параметры
0,4 н. H2SO4
а
30,302
b
0,3032
S
0,0742
5.Исследование NO-донорных
г
0,9996
Sr
0,0332
Р%
95
t
2,78
4х
0,1922
свойств антимикробного
8%
2,27
препарата
"нитазол"
Для доказательства образования анион-радикала при электрохимиче­
ском восстановлении нитазола (2-ацетиламино-5-нитротиазол) исследовалась
полярография нитазола в безводном диметйлформамиде на фоне 0,2М
NaC104. Полученные постояннотоковые полярофаммы для нитазола и мет­
ронидазола, взятых для сравнения в одинаковых концентрациях, показали,
что величины предельного тока для данных соединений примерно равны, что
19
указывает на сходство механизмов их одноэлекфонного полярографического
восстановления - образование нитроанион-радикала.
Анализ формы волн по уравнению Ильковича-Гейровского также под­
твердил их одноэлектронный характер.
Для проверки возможности отщепления нтрогруппы нитазола в ре­
зультате химического восстановления 10% водно-спиртовой раствор 210'*М
нитазола и 10''М аскорбиновой кислоты в фосфатном буферном растворе с
рН 5 в течение 30 минут прогревался при температуре 80°С. Заключение о
прохождении реакции восстановления метронидазола с элиминированием
нигрофуппы в виде нитрит-аниона было сделано на основании реакции
Грисса.
Щелочной гидролиз нитазола наблюдался уже в буферном водноспиртовом растворе с рН 9. О его наличии судили по появлению в растворе
нитрит-анионов - около 1-2 % , что зафиксировано реакцией Грисса.
Количественное исследование гидролиза нитазола (IC^M) проводилось
в водно-спиртовом (10% этилового спирта) 0,1 н. растворе NaOH при 37 "С
непосредственно в полярографической ячейке. На протекание процесса гид­
ролиза указывало уменьшение предельных токов электровосстановления
нитрофушш во времени, что непосредственно свидетельствует об ее элими­
нировании. Наряду со снижением во времени катодной волны, одновременно
наблюдается появление и дальнейший рост анодной волны. Обращает на себя
внимание факт выхода на постоянное значение как катодного, так и анодного
предельного тока.
Данный факт доказывает появление в растворе сульфгидрильного про­
изводного, которое, вероятно, образуется в результате раскрытия тиазольного
цикла и последующей перегруппировки (схема 7).
20
.л-д^-^-д—.
Схема 7
Таким образом, анодный ток, в соответствии со схемой 7, обусловлен
электроокислением тиола (VI).
Высвобождение нитрит-иона при гидролизе было количественно уста­
новлено по реакции образования нитропруссид-иона после прогрева гидролизованного раствора с ферроцианидом калия. Поскольку образующееся
сульфпуфильное производное (VI) может в данной среде взаимодействовать
с нитрит-ионом, в результате реакщш образуется соответствующий дисуль­
фид (VII), который может элеюрохимическн восстанавливаться на ртутном
капельном электроде, давая вклад в наблюдаемый ток электровосстановления
ншрогрутшы нитазола. По-видимому, выход во времени на постоянное зна­
чение как анодного, так и катодного токов указывает на достижение некоего
стащюнарного состояния в данной окислительно-восстановительной систе­
ме.
Кинетические параметры реакции щелочного гидролиза нитазола рас­
считывались на основе предположения о квазимономолекулярном механизме
21
процесса гидролиза. В этих условиях константа скорости гидролиза к = 1,03i o ' с"', период полуразложения Т|д= 120 минут. Эти значения рассчитаны с
учетом возрастания во времени вклада катодной волны электровосстановле­
ния дисульфида в суммарную волну, то есть при расчетах к и тш использова­
ли экспериментальные значения разности высот катодной и анодной волн
при соответствующих временах, полагая с определенным приближением, что
анодная волна окисления тиола равна катодной волне электровосстановления
дисульфидного производного.
Подтверждением выделения оксида азота при деградаций нитазола яв­
ляется активация этим препаратом фермента растворимая гуанилатциклаза,
которая опосредует ряд функций N 0 . Степень активация зависит, как это ха­
рактерно для экзогенных доноров N O , от концентрации нитазола (И.С. Севе­
рина).
Активация рГЦ как нитазолом, так и метронидазолом указывает на ге­
нерацию оксида азота в биологических системах вследствие биотрансформа­
ции данных препаратов и коррелируется с данными по выделению N O в ре­
зультате их химических превращений.
Кроме того, нами установлены оптимальные условия для количествен­
ного определения субстанции нитазола полярографическим методом: 50%
спиртовой раствор в фосфатном буфере рН 8. При этих условиях на полярограммах видны две волны, причем первая одноэлектронная, вторая - трехэлекгронная с потенциалами полуволн -0,70 и -1,12 В соответственно. Высо­
та полярографической волны определялась при потенциале -1,5 В. Величина
Е'Л нитазола в данных условиях может также служить качественной характе­
ристикой последнего (определение подлинности). В сильнокислых растворах,
таких как рН 2,4 и 3,6 наблюдается одна четырехэлектронная волна. Данная
методика количественного и качественного определения нитазола характери­
зуется простотой, точностью и воспроизводимостью (табл. 5).
22
Таблица 5
Метрологические характеристики полярографического определе­
ния нитазола
Параметры
а
b
50% спиртовой р-р рН 8 10,074 0,2450
S
Ss
Р%
t
3,0374
95
2,78
г
0,0837 9,9996
Дх
8%
0,1041 2,38
Таким образом, на основании полученных результатов можно предположтъ, что механизм химиотерапевтического действия нитазола связан как с
непосредственным действием оксида азота, проявляющемся в ингибировании
железо-содержащих ферментов микроорганизмов и простейших, так и с об­
разованием пероксинитрит-иона в результате взаимодействия N 0 с суперок­
сид-анионом, возможным в аэробных условиях (схема 8):
>^RN02+ Oj- -►RNO,+ 0 \
R-NO:
2
сишюпо* продуиы +
ONOO
RSNO (и другие продукты)
где R - 2- ацетиламинотиазолил-З
Схема 8
Обп|ие выводы
1. Проведено исследование кинетики гидролиза бронопола в деаэрирован­
ных щелочных растворах и доказано отщепление нитрит-аниона в данных
условиях.
2. Предложен механизм химического окисления бронопола, связанный с об­
разованием оксида азота и супероксид-аниона в присутствие кислорода.
3. Выдвинуто предположение, ^го антимикробное действие бронопола обу­
словлено высокой окисхгательной способностью пероксинитрит-аниона.
23
образование которого возможно при химическом окислении и гидролизе
бронопола в кислородсодержащей среде.
4 Полярографическим методом впервые доказана способность генерации
N 0 гем-полинитрометильных производными 1,3,5-триазина в условиях
электрохимического и химического восстановления.
5. Выдвин)пго
предположение,
что
противоопухолевое
полинитрометильных производных ],3,5-триазина
действие
гем-
связано с процессами
их биотрансформации, в результате которой могут выделяться такие цитотоксические продукгы как оксид азота и пероксиннтрит-аыион.
6. Полярографическим методом исследована кинетика гидролиза химиотерапевтических препаратов метронидазол и нитазол в растворах с различ­
ными рН.
7. Предложена схема гидролитических превращений метронидазола и нитазола в щелочных растворах, включающая раскрытие обоих гетероциклов с
дальнейшим элиминированием нитрогруппы в виде нитрит-аниона и по­
следующим его превращением в оксид азота.
8. Предложен новый механизм антимикробного и анпшротозойного дейст­
вия метронидазола и нитазола, основывающийся на возможности образо­
вания in vivo цитотоксических нитро-анион-радикалов и пероксинэтританиона.
9. Разработаны полярографические методики количественного определения
бронопола, метронидазола и нитазола.
24
По теме диссертации опубликованы следующие работы:
1. AjTamastsev А., Azizov О., Grigoriev, Levina V. Possible mechanizm of
antimicrobial action of "bronopol" // Abstracts: Pharmacy World Congress
2000.- Vienna, Austria, 26-31 August 2000. - P. 104.
2. Левина В.И.Дзизов O.B., Арзамасцев A.П.,Григорьев Н.Б., Граник В.Г.
// Противоопухолевый препарат гадроксимочевина - донор оксида азо­
та. Вопр. биол. мед. и фармац. химии. -2001.- N 1.- С. 47-49
3. Левина В Л . Азизов О.В., Пятакова Н.В., Бусыгина О.Г. , Северина
И.С., Арзамасцев А.П., Григорьев И Б , Граник В.Г
NO-донорные
свойства антвмшфобного средства бронопола (2-бром-2-нитропропан1,3-диола) // Вопр. биол. мед. и фармац. химии. -2001- N 2.- С. 54-56
4. Левина В. И., Азизов О. В., ГЬпакова И. В., Паршин В. А., Северина И.
С , Арзамасцев А. П., Григорьев Н. Б , Граник В. Г. NO-донорная ак­
тивность препаратов для лечения протозойных инфекций метронидазол
и интазол // Человек и лекарство: Тез. докл. 9 Российского нац. кон­
гресса. - М., -2002- С. 649.
5. Левина В. И., Азизов О. В., Пятакова И. В., Северина И. С , Арзамасцев
А. П., Григорьев Н. Б., Граник В. Г. Генерация оксида азота гфи гидро­
литических превращениях химиотерапевтического препарата "нитазол"
// Вопр. биол. мед. и фармац. химии. - 2002.- N 4- С. 6-10
6 Григорьев И. Б., Левина В. И., Азизов О. В., Пятакова И. В., Паршин В.
А., ^^замасцев А П . , Северина И. С , Граник В Г. NO-донорные свой­
ства химиотерапевтического средства "метронидазол" // Вопр биол.
мед. и фармац. химии. - 2002- N 4- С. 10-14.
7 Гидаспов А . А , Бахарев В В . , Качановская Е В , Булычев Ю И , Азизов
О. В., Левина В. И., Арзамасцев А. П., Григорьев Н. Б , Граник В. Г
Синтез и NO-донорные свойства полинитрометильных производных
1,3,5-триазина
// Человек и лекарство: Тез. докл. 10 Российского нац.
конгресса.-М.,-2003-С. 706.
М М Л им.и.М.Сеченова
Иолпнсано в печать
Тираж
2003г.
РНБ Русский фонд
2006-4
24640
I i
t.ji i-^-'J
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
0
Размер файла
774 Кб
Теги
bd000103312
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа