close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

bd000103313

код для вставкиСкачать
На правах рукописи
ДУНАЕВА ОЛЬГА ВАЛЕРЬЕВНА
УДК: 616.12-085J2
СОЗДАНИЕ ПРОТИВОТРОМБОТИЧЕСКОГО ПРЕПАРАТА
НОВОГО ДОНОРА ОКСИДА АЗОТА
14.00.25 - «Фармакология, клиническая фармакология»
Автореферат
диссертации на соискание ученой степени
кандидата медицинских наук
Москва-2003
Работа выполнена в Московском государственном медикостоматологическом университете М З Р Ф
Н а у ч н ы й руководитель:
Доктор
медицинских
наук,
профессор Александр Георгиевич
Муляр
Официальные оппоненты: Доктор
медицинских
наук,
профессор
Владимир
Александрович Макаров
Доктор
медицинских
наук,
профессор
Игорь
Ефимович
Ковалев
Ведущее учреждение:
Всесоюзный Научный Центр по
изысканию биологически активных
веществ
(Министерство
промышленности
науки
и
технологии).
Защита состокгся « _ _ _ _ »
^2003 г. в 13.00 на заседании
диссертационного совета Д208.041.01 при
Московском
государственном медико-стоматологическом университете М З Р Ф
(Москва, ул. Долгоруковская, д. 4).
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке М Г М С У М З
РФ
(125206, ул. Вучетича, 10а)
Автореферат разослан «
»
Ученый секреггаръ дисс^зтационного
совета, доктор медицинских наук, профессор
^2003 г.
М З . Балуда
ёХХ)Ь-И
а^б^у
20320^^8
3
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.
Актуальность проблемы.
Эндотелиаяьный релаксирующий фактор или оксид азота
(NO) стимулирует дыхательную мускулатуру и вызывает
расширение
сосудов. Он образует
S-нитрозотиолы,
активирующие растворимую цитозольную гуанилатциклазуз
катализи];^тощую синтез циклического 5-гуанозинмонофосфата
(цГМФ). Последний снижает содержание свободного кальция одного из основных участников многоступенчатого процесса
гемостаза. Это приводит к угнетению агрегации тромбоцитов и
изменению
скорости
других
стадий
гемокоагуляции,
сопряженных с содержанием данного иона в плазме и клетках
крови (Б,К. Каггнунг, 1998; В Г . Граник, 2002; RangN.P., 1999).
В настоящее время в качестве медикаментозных средств при
лечении
тромбозов,
инфаркта
миокарда,
нарушений
мшфоциркуляции и др. в клинической практике используется
ограниченный круг лекарственных препаратов, наиболее
значимыми из которых являются: ацетилсалициловая кислота
(аспирин), пентоксифиллин (трентал), тикяошщин (тшшид),
клопидогрель (плавике), гепарин, ашикоагулянты непрямого типа
действия и фибринояитики, применение которых
может
сопровождаться развитием целого ряда побочных эффектов (М.Д.
Машковский, 2002; РЛС «Энциклопедия лекарств», 2002).
N 0 известен как
мощный ингибитор ахрегации
тромбоцитов. Его образование способствует
сохранению
TCiQ^ecTH крови, благодаря торможению тромбогенеза. Факторы,
регулирующие возникновение и утилизацию N 0 в эндогенных
условиях,
обеспечивают
во
многом
нормальное
функционирование сердечно-сосудистой системы.
В связи с вьппе изложенным важное значение для
современной фармакологии приобретает поиск веществ,
способствующих появлению N 0 как агента, угнетающего
спонтанную и индуцированную способность кровяных пластинок
к склеиванию. Особенностью действия этих веществ является
ферментативное освобождение NO, чем они, в принципе,
f^C. НАЦИОНАЛЬНАЯ
ВИВЛИОТЕКА
С Петербург
отличаются от известного и широко применяемого в медицинской
практике нитропруссида натрия.
Дедь и задачи исследования.
Целью проведенного исследования явился скрининг новых
доноров N 0 с последующим выбором наиболее активного и
малотоксичного
потенциального
противотромботического
лекарственного препарата.
Для достижения поставленной цели предполагалось репшть
следующие задачи:
1. Сопоставить влияние новык доноров N 0 на индуцированную
агрегацию тромбоцитов в условиях in vitro и отобрать
наиболее эффективные вещества для дальнейшего изучения.
2. Исследовать антиагрегационный эффект
перспекгавньлх
медикаментозных средств в условиях in vivo.
3. Выявить возможность отобранной субстанции влиять на
свертываемость крови в условиях in vivo.
4. Оценить
способность
потенциального
лекарственного
препарата изменять уровень свободного кальция [Ca^*]i в
цитоплазме форменных элементов крови.
5. Изучить влияние наиболее эффективного антиагрегационного
соединения
на способность нейтрофилов образовывать
активные радикалы кислорода («дыхательный взрыв»).
6. Определить его острую токсичность (LDso).
Научная новизна.
Впервые в экспериментах (с донорской кровью и на кроликах)
доказано, что новые доноры N 0 могут угнетать индуцированную
агрегацию тромбоцитов как в условиях in vitro, так и при
внутривенном и пероральном введениях (in vivo), но не влияют
на свертываемость крови. Ранее способность данной группы
соединений влиять на клеточный и плазменный гемостаз не
изучалась. Показано, что наиболее перспективная субстанция
(вещество 9) усиливает "дыхательный взрыв" нейтрофилов, т.е.
способность
последних образовывать
активные радикалы
кислорода, сниженную вследствие патологических состояний
(гистеоцитоз, гипертоническая болезнь П степени). Установлено,
что низкие показатели токсичности (LD50 = 8900 мг/кг) вещества 9
позволяют отнести его к V классу - практически нетоксичных
соединений (Сидоров К.К., 1973 г.).
Практическая зиячимость работы.
Для терапии сердечно-сосудистых заболеваний предлагается
потенвд1альное
малотоксичное
вещество,
обладающее
антиагрегащ!Онным действием, и как следствие этого,
улучшающее микроцир1^ляцшо.
Полученные данные по изучению вещества 9 являются
основной частью
пакета документов, предназначенных для
представления в МЗ Р Ф с целью получения разрешения на
первую
фазу
клинических
испытаний
в
качестве
противотромботического лекарственного препарата.
Кроме того, успешное решение данной задачи позволит
химикам-синтетикам продолжить дальнейший синтез новых
химических веществ из группы доноров NO
с заданньпиги
свойствами.
Основные положенищ выносимые на защиту.
1. Влияние
вновь
синтезированных
доноров
NO
на
индуцированную агрегацию тромбоцитов в условиях in vitro.
2. Отбор наиболее
перспективных веществ, эффективно
угнетающих функцию тромбоцитов в условиях живого
организма (кролика).
3. Изучение
способности
потенциального
антиагреганта
уменьшать уровень [Са^^г и
повышать сниженную
активность нейтрофилов человека.
4. Определение острой токсичности соединения, предлагаемого
для клинических испытаний.
Апробация работы.
Результаты работы доложены и обсуждены на совместном
заседании кафедр фармакологии, клинической фармакологии и
внутренних болезней, внутренних болезней №5, военноэкстремальной медицины, Протгокол №2 от 05.09.03 г.
Работа выполнена в соответствии с НИР М Г М С У (№
Государственной регистрации 01200100390).
Публикации и доклады.
По материалам диссертации опубликовано 8 печатных
работ.
Основное содержание работы доложено на научно
практической конференции «Лекарства - Человеку», 2002 г., г,
Харьков; У П Национальной конференции «Новое в изучении
патогенеза, диагностике, профилактике и лечении патологии
гемостаза», 2002 г.,
г. Москва; 60-й юбилейной открытой
итоговой научной конференции студентов и молодых ученых
В М А "Медицина в начале нового века: достижения и
перспективы», 2002 г., г. Волгоград; X российском национальном
конгрессе «Человек и лекарство», 2003 г., г. Москва; 2-м съезде
Российского Научного Общества фармакологов, 2003 г., г.
Москва; X X V Юбилейной итоговой конференции молодых
ученых МГМСУ, 2003 г., Г. Москва.
Объем работы.
Диссертационная работа изложена на 133 страницах
машинописного текста, содержит 38 рисунков и 23 таблицы и
состоит из введения, трех глав (обзора литературы, материалов и
методов исследования, результатов исследований), заключения,
выводов, списка литературы. Библиография включает 228
источников литературы, в том числе 73 отечественных и 155
зарубежных.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Материалы и методы исследования.
Эксперименты проводились на 198 кроликах-самцах породы
«Шиншилла» массой 2,7±0,3 кг, донорской крови, 48 белых
беспородных мышах массой 20±2,0 г. До начала основного
эксперимента
лабораторные
животные
подвергались
двухнедельному карантинному наблюдению и накануне опытов
лишались корма при свободном доступе к воде.
В ходе экспериментов были изучены 9 химических веществ,
потенциальных доноров оксида азота. Из них 2 вещества
растворимы в воде (№1, 2), 3 - растворимы в ДМСО (№ 3, 5 и 6),
у 3-х соединений растворителем является ТВИН-80 (№ 4, 8, 9) и 1
вещество нерастворимо (№7). В качестве эталонных препаратов
были использованы ацетилсалициловая кислота, как наиболее
часто используемый в терапии антиагрегант, и нитропруссид
натрия, являющийся спонтанным либератором N 0 .
Исследование агрегации тромбоцитов.
Кровь для исследований получали из краевой вены уха
кролика и смешивали с 3,8% раствором цитрата натрия в
соотношении
9:1. Исследование
агрегации тромбоцитов
проводили по методу В о т (1962) на агрегометре фирмы «ChronoLog» (США). Принцип этого метода заключается в измерении
степени изменения оптической плотности богатой тромбоцитами
плазмы при добавлении к ней индуктора агрегации.
В
качестве индукторов
агрегации были
выбраны
аденозиндифосфорная кислота (АДФ) фирмы Sigma, USA, в
конечной концентрации 10"^ М, коллаген (0,4%) НПО «Ренам»,
Россия, и арахидоновая кислота (АА) фирмы Sigma, USA, в
конечной концентрации SxlO'^M.
С учетом возможных различий условий эксперимента (по
влажности, температуре и др.) в течение одного дня тестировалось
2 вещества, в трех концентрациях или дозах каждое; проводили
два опыта на двух образцах плазмы, полученных от двух кроликов
каждой серии. Под серией понимается группа из 3 (in vitro) или 6
(in vivo) животных, на которых изучалась одна из концентраций
или доз веществ.
Определение протромбинового времени.
Определение протромбинового времени основывалось на
оценке свертывания цитратной плазмы крови при смешивании ее
с тромбопластином и раствором хлорида кальция.
в пробирку, находящуюся в водяной бане, вводили 0,1 мл
плазмы и 0,1 мл раствора тромбопластнна (серия №240600,
приобретен на НПО "МедиоЛаб"). Спустя 60 секунд добавляли 0,1
мл 0,025М раствора кальция хлорида и фиксировали время
реакции (в секундах) на коагулометре
Behnk Electronic
(Германия).
Опенка частичного активированного тромбопластинового
времени.
Плазму, лшпенную тромбоцитов, в количестве 0,1 мл
помещали в кювету коагулометра, в которою также вносили 0,1
мл АЧТВ-реагента и прогревали в течение 3 мин при t +37° С,
затем добавляли 0,1 мл 0,025М раствора хлорида кальция и
регистрировали время свертывания крови (в секундах) и
сравнивали показатели контрольной плазмы и плазмы,
полученной после перорального введения вещества.
Регистрация образования активных форм кислорода
в нейтрофилах человека.
Для исследовании способности веществ влиять на
образование активных форм кислорода О^ ( А Ф К ) ("дыхательный
взрыв") в качестве стандартного активатора нейтрофилов бьш
использован
формил-метионил-лейцил-фенилаланин
(fMLP)
бактериальной природы фирмы «Sigma». Нейтрофилы вьщелялись
из периферической крови людей путем дифференциального
центрифугирования в двухступенчатом градиенте плотности
Ficoll-Hypaque.
Жизнеспособность
изолированных
клеток
оценивалась с помощью витального красителя трипанового
синего.
Образование
О^
нейтрофилами
определялось
по
люцигенинзависимой
хемилюмининсценции
(конечная
концентрация люцигенина в пробе составляла 20 мкМ).
Хемилюмининсценция регистрировалась в виде количества
импульсов в минуту на люминометре Биотокс-7, присоединенном
к персональному компьютеру. В течение первых 5 минут
регистрировалась
интенсивность
спонтанной
хемилюмининсценции, затем к пробе добавлялось исследуемое
вещество.
Изучение уровня свободного кальция [Ca^^i
в цитоплазме лимфоцитов человека.
Для изучения уровня свободного кальция [Са^"*!!
лимфоциты выделяли из обогащенной плазмы с помощью
дифференциального центрифугирования в градиенте плотности
Ficoll-Hypaque (удельная плотность 1,078 г/мл) в течение 30 минут
при 300 об/мин (650 g). Затем отмытые дважды лимфоциты с
помощью центрифзтирования помещали в среду Хенкса,
содержащую 10 м М HEPES, рН=7,3.
Величину концентрации свободных ионов кальция в
цитоплазме клеток определяли с помощью флуоресцентного
индикатора ионов кальция Fura-2/AM. Клетки прокрашивали
непосредственно в кварцевых кюветах спектрофлуометра (1x1 см)
при температуре 37*^ С, при перемешивании суспензии (2 мл)
магнитной мешалкой. Ацетоксиметиловый эфир (Рши-2/АМ)
добавляли в виде 25мкМ раствора в диметилсульфоксиде в
концентрации 5-10 мМ. Проникновение эфира Рш^-2/АМ в клетки
и степень гидролиза до кислоты контролировали по увеличению
интенсивности флуоресценции эфира (длина волны возбуждения
= 430 нм). Прокрашивание клеток производили в течение 30
минут, после чего клетки отмывали от непроникшего в клетки
эфира Fm^-2/AM центрифугированием как описано выше.
Концентрация внутриклеточного Fura-2/AM составляла 10-20
мкМ, при этом объем цитозоля принимали равным 2 мкМ на 1
миллион клеток. Измерение флуоресценции проводили на
спектрофлуориметре Hitachi F-4000 (Япония) в термостатируемой
кювете при температуре 37° С. Длина волны возбуждения
флуоресценции - 335 нм, регистрации - 505 нм, спектральная
ширина щелей монохроматоров возбуждения и эмиссии
составляли соответственно 3 и 10 нм. Величину кальция
рассчитьгаали по формуле:
[Ca'']i = K d x ( F - F „ ^ / F ^ - F )
Где K d - константа диссоциации, равная 224 нМ;
F - наблюдаемый уровень флуоресценции;
10
Fmax И ¥гшп ' интснсивность флуоресценции, в том случае,
когда весь Fura-2/AM находится соответственно в виде комплекса
с кальцием или свободной кислоты.
Определение острой токсичности перспективного
лекарственного препарата.
LDso рассчитывали по Керберу (1931 г.).
Статистическая обработка
Полученные
данные
обрабатывались
методами
вариационной статистики с использованием компьютерной
программы «Биостат» на персональном компьютере «Pentium Ш».
Достоверность полученных данных оценивалась с применением
критерия Стьюдента (t). В работе принят уровень вероятности
р^0,05.
Результаты исследований.
Исследуемые вещества использовались в концентрациях
10'^, 10"^ и 10'^ М (при необходимости концентрацию
последовательно уменьшали до той, при которой эффект
отсутствовал). Ацетилсалициловая
кислота
изучалась в
концентрации от 10"* до
10"* М.
В первой серии опытов было установлено, что из 9 новых
доноров N 0 вещества 3 и 9 угнетали АДФ-индуцированную
агрегацию тромбоцитов, причем первое из изученных веществ
действовало более выражено (на 28% от контроля) и не уступало
по эффективности ацетилсалициловой кислоте в использованной
концентрации 10''М, которая подавляла выше указанный процесс
на 30% от контроля (рис. 1).
При использовании коллагена как индуктора агрегации
эффект изучаемых веществ отсутствовал.
11
10.7М
10-6М
10-5М
10-4М
10-ЗМ
вещество 3
вещество 9
АСК
Рис. 1. Изменение оптической плотности плазмы кроликов,
обогащенной тромбоцитами, под влиянием веществ 3, 9 и
ацетилсалициловой кислоты на модели АДФ-индуцированной
агрегации (в процентах по отношению к контролю).
12
Согласно рекомендациям профессора В.Г.
Граника
(Государственный Научный Центр по антибиотикам), в
лаборатории которого осуществлялся синтез изучаемых веществ,
для последующего исследования были отобраны вещества 1, 3, 8,
9, как предполагаемые, наиболее сильные, доноры N 0 .
При
влиянии
на
АДФ-индуцированную
агрегацию
тромбоцитов при внутривенном введении все исследованные
вещества легко разделялись на две группы. В первую группу были
отнесены соедршения 1 и 8 в дозах 0,5 мг/кг и 1,0 мг/кг
соответственно. Оба они ни в один из исследуемых промежутков
времени не изменяли процента падения оптической плотности
богатой тромбоцитами плазмы, инкубированной с АДФ.
Имеющиеся незначительные колебания плотности (50-59%) не
выходили за пределы нормы (56-57,8%) и были статистически не
существенны.
Во вторую группу вошли соединения 3, 9 в дозах 1,0 мг/кг и
0,8 мг/кг соответственно и натрия нитропруссид, как эталонный
лекарственный препарат. Все они вызывали однонаправленное
изменение процесса агрегации тромбоцитов - подавляли его.
Однако, существовали значимые количественные и временные
различия в эффекте.
Так, нагрия нитропруссид в дозе 0,8 мг/кг активно
(достоверно) угнетал агрегацию тромбоцитов уже через 15 минут
после введения. Эта временная точка единственная, в которой
нам удалось наблюдать активность - причем, значительную. Уже
через 1 час (а тем более через 3 часа) эффект исчезал (табл. № 1 ,
рис. 2).
И соединение 3, и соединение 9 действовали позднее:
девятое - через 1 час, третье - через 3 часа. Количественно
влияние на агрегацию было выражено статистически одинаково:
на их фоне действие А Д Ф ослабевало в 1,5 раза (табл. № 1 , рис 2).
Таким образом, эти серии экспериментов показали
способность веществ 3 и 9 угнетать вызываемую АДФ
склеиваемость кровяных пластинок после внутривенного
введения, что еще раз доказьгаает справедливость сделанного
нами предварительного вывода. Кроме того, подтвердилась
способность
натрия
нитропруссида
ингибировать
13
индуцированную агрегацию тромбоцитов при интравазальной
аппликации.
В условиях перорального назначения вещества I и 8 (5 и 10
мг/кг соответственно) не вьнывали значимых колебаний
агрегации тромбоцитов в течение всего периода наблюдения (4
часа).
При этом пути введения высокую активность проявили
вещества 3 и 9. Оба они качественно и количественно действовали
практически одинаково. Значительное угнетение процесса
агрегации, индуцированного АДФ, выявилось к первому часу и
составило 30% от контроля, достигало максимума через 2 часа
(40%) и, как тенденция (15-25%), сохранялась все 4 часа
наблюдения (рис. 3).
Таблица № 1 .
Влияние NO-пpoдyI|иpyюIциx веществ, натрия шпропруссвда
при внутривенном введении на ДДФ-ицдуцированную
агрегацию тромбоцитов кроликов в условиях in vivo ( М ± т).
Вещество
% падения оптической шютносга плазмы, обогащенной
тромбоцитами
Доза
Время после введения
(мг/кг)
Контроль
15 минут 60 минут 180 минут
1
0,5
57,8 ±4,2
52,2 ±3,5
50,8 ±4,8
3
hO
54,0 ±4,7
48,0 ±6,7
51,3 ±4,6 39,3 ±3,1*
8
1,0
56,0 ±6,2
59а ± 8а
54,8 ±6,0
9
0,8
54,2 ±4,5 48,3 ±8,3
Натрия
0,S
58,7 ±2,9 36,0 ±5,7* 53,3 ±3,9
ншро-
49,8 ±6,0
56,3 ±6,7
34,3 ±2,4* 53,8 ±3,0
46,7 ±3,5
прусснд
Примечание: * - достов^но по сравнению с контролем при р <
0,05.
14
45
40
35
30
25 ^
-гАг-вещество 3
20
♦ "вещество 9
15-1
- • -нитропруссид
натрия
10
5-(
О
-5
15 мин
60 мин
180 мин
240 мин
Рис. 2. Влияние веществ 3, 9 и натрия нигропруссида при
внутривенном введении на АДФ-индуцированную агрегацию
тромбоцитов кроликов (в % по отношению к контролю).
15
45
/^\40,5
АО А-
Q.
§
о.
/
35
30
i f29y
Q 25
^3,0
§
34.(
Л
iC
S
X
ф
-4-вещество 3
-^вещество 9
-
|20
X
g 15
SS
_
ш 10
5
__Vfl—
О
60 мин
120 мин
240
Рис.
3.
Изменение
функциональной
активности
тромбоцитов кроликов под влиянием перорального введения
веществ 3 и 9 на модели АДФ-индуцированной агрегации (в % по
отношению к контролю).
16
При использовании А А в качестве индуктора агрегации
эксперименты вьшолнялись также в условиях перорального
введения. Мы полагали, что такая постановка опытов вполне
оправдана возможностью назначения изучаемых веществ (в
отличие от нитропруссида натрия) не только внутривенно.
Оказалось, что вещество 9 начинает действовать уже через 1
час после аппликации, при этом степень инициации
склеиваемости кровяных пластинок АА падала на треть. Еще
более значимо действие индуктора агрегации подавлялось ко
второму часу - более чем вдвое. К концу периода наблюдения (4
часа) действие арахидоната было сопоставимо с исходным.
Эффект вещества 3, в сравнении с соединением 9,
развивался позже, но сохранялся свыше 4 часов. Количественно к
концу первого часа он выявлялся как тенденция (до 10%),
становился статистически достоверным через 2 часа (32%) и
продолжал расти весь период наблюдения (37% к 4 часу).
Таким образом, агрегация тромбоцитов, индуцированная
арахидоновой кислотой, эффективно подавлялась веществами 3 и
9 (последним в большей степени), вводимыми per os. Активность
проявлялась на протяжении более двух часов для соединения 9 и
более 4 часов для соединения 3 (рис. 4).
Полученные данные позволили отобрать для дальнейшего
изучения плазменного гемостаза, некоторых аспектов механизма
действия и острой токсичности одно из двух соединений
(вещество 9), которое, как оказалось впоследствии, по результатам
исследований профессора В.Г. Граника (разработчика данных
соединений
в
Государственном
Научном
Центре
по
антибиотикам) является наиболее сильным донором N 0 из всего
ряда изучаемых химических соединений.
Как и следовало ожидать, вещество 9 на показатели
плазменного
гемостаза
(активированное
частичное
тромбопластиновое время и тромбиновое время) эффекта не
оказало, т.к. общеизвестно, что способностью одновременно
подавлять как агрегацию тромбоцитов, так и свертывание крови
обладает только гепарин и его низкомолекулярные соединения
(эноксапарин, фраксипарин и др.).
17
Rn
-Лс вещество 31
- » " вещество 9 j
60 мин
120 мин
240 мин 300 мин
Рис. 4. Изменение агрегации тромбоцитов кроликов,
индуцированной арахидоновои
кислоты, под влиянием
перорального введения вещества 3 и 9 (в % по отношению к
контролю).
18
К сожалению, определить степень изменения уровня [Ca^^i
в цитоплазме лимфоцитов человека не удалось, т.к. интенсивность
свечения Fura-2/AM, как активатора кальциевых каналов,
перекрывалось свечением вещества 9 после предварительной
инкубации с ним данных форменных элементов крови.
Учитывая, что вещество 9 слабее угнетало модель
агрегации, индуцированной АДФ, нежели арахидоновой кислотой,
которая в тромбоцитах является субстратом для образования
тромбоксана Аг (TxAj), мы попытались выяснить, как данное
соединение влияет на образование супероксид анион радикала (Ог"
') нейтрофилами человека, активированное fMLP, предварительно
ослабленное развитием патологических процессов (гистеоцитоз,
гипертоническая болезнь П ст.). Данная постановка опыта была
выбрана в связи с тем, что для ocJш^ecт8лeния завершенного
фагоцитоза,
сопровождающегося
полным
уничтожением
патогенных микроорганизмов, в фагоцитах, в том числе в
нейтрофилах, образуются так назьгеаемые активные формы
кислорода (АФК), к которым относятся радикалы кислорода и
соединения, легко превращающиеся
в
такие радикалы. К
радикалам кислорода относятся супероксид анион (Ог"),
гидроксилрадикал (ОН*) и гидроксиперикиси липидов (ROO*). Все
эти соединения имеют на внешней молекулярной орбитали один
неспаренный электрон, что и определяет
их высокую
реакционную способность, приводящую к взаимодействию с
молекулами клетки: белком, РНК, ДНК и др. В результате такого
взаимодействия происходит крушение структуры макромоле1ц^л
и потеря их биологической активности.
Полученные данные свидетельствуют
о том, что
подпороговые концентрации вещества 9 и бактериального
активатора
фагоцитирующих
клеток
fMLP
оказывают
кратковременное потенцирующее действие на «дыхательный
взрыв» нейтрофилов крови больных с реактивным гистеоцитозом
и гипертонической болезнью Пет.
19
i
NO/
+2£
нитрат
^NOi
±£
HRTpftr
^ NO*
+£b
ОКСВД азота
1
► NO2 +JML-^ N O /
щюксид азота
нитрат
4
+02
Восталение
-► ONOO'-^
тканей
пероксшоггриг
Ншратредукгаза
т
туанилзщиклаза
шпршредукгаза
ГТФ
тОЛФ
1фотешпсиназа
аргиаав
}♦
Фосфорилирование
цвтруллин
ЫОчзятаза
Релаксация сосудов
Ингибирование адгезии,
агрегацщ! тромбоцитов
Рис. 5. Схема синтеза, превращения и основных путей
влияния оксида азота на биохимические, физиологические и
патологические процессы (цигировано по Суховой Т.В., 2000 г.)
20
Таким образом, после инкубации вещества 9 с цельной кровью в
результате взаимодействия
N0
с Ог"* возникает высоко
реактивное соединение пероксинитрит (NO3), которое, повидимому, кратковременно, но
эффективно
влияет
на
липидные компоненты плазматической мембраны клеток, в том
числе остатки арахидоновой кислоты (рис. 5).
Вследстаие этого, возможно, нарушается выделение А А из
фосфолипидного слоя плазматических мембран, а следовательно,
ее последуюищй метаболизм с уменьшением образования
тромбоксана Аг (ТхАг) в тромбоцитах. Это
снижает
функциональную активность кровяных пластинок.
Полученные данные позволяют предположить, что одним из
возможных механизмов антиагрегационного действия вещества 9
может оказаться кратковременная активация
процесса
образования радикалов кислорода в цельной крови («дыхательный
взрыв»), позволяющая снизить уровень тромбогенных факторов.
Еще одним фактом, свидетельствующим о перспективности
данного соединения является высокое значение LD50 (8900 мг/кг),
что по классификации токсичности веществ соответствует V
классу токсичности (KJC. Сидоров, 1973 г.) и позволяет отнести
его к практически нетоксичным веществам.
Суммируя все выше изложенное (с учетом проведенных
экспериментов, выявивших способность доноров N 0 угнетать
индуцированную
агрегацию
тромбоцитов),
можно
констатировать, что как нитропруссид натрия (спонтанньлй
либератор N0), так и вещества 3 и 9 (энзимообусловленная
продукция N 0 ) в организме кроликов при парентеральной (вена)
аппликации мощно тормозят склеиваемость кровяных пластинок.
Можно считать также доказанной способность новых
доноров N 0 (соединения 3 и 9) всасываться из Ж К Т и проявлять
свою антиагрегационную активность в условиях энтерального
назначения. Разумеется, по сравнению с интравазальным
введением, она реализуется несколько позже, но сохраняется на
значительно больший срок (вещества действовали более 2-4 часов
на АА-индуцированную агрегацию и около 3 часов на АДФиндуцированную).
21
В какой-то степени сделанным вьшодам противоречит
отсутствие эффекта у соединений 1 и, особенно, 8. Оба они,
согласно
структурным
особенностям,
должны
значимо
продуцировать N 0 , тем более, при условиях in vivo. Однако, мы
не смогли зафиксировать изменений агрегации тромбоцитов под
влиянием названных веществ на фоне АДФ ни in vitro, ни in vivo.
Можно допустить, что эти вещества в биологических системах
образуют недостаточное количество N 0 , либо появляющийся N 0
экранируется от точек инициации агрегации.
Хотелось бы подчеркнуть, что проведенные эксперименты
убедительно свидетельствуют о перспективности поиска мощных
антиагрегантов, эффективных при энтеральном и парентеральном
назначениях, среди производных данного ряда. Одно из них,
вероятно вещество 9 , может бьпъ рекомендовано в качестве
объекта
доклинических
исследований
по
программе
Министерства Здравоохранения Р Ф и, скорее всего, после их
завершения станет предметом клинических испытаний как
регулятор микроциркуляции (ингибитор агрегации тромбоцитов).
Возможно, наряду с ним окажется полезным и вещество 3,
однако, окончательный вывод следует делать после проведения
дополнительных исследований.
Выводы.
1. В условиях in vitro антиагрегационная активность ряда вновь
синтезированных доноров оксида азота не уступает таковой
ацетилсалициловой кислоты.
2. Потенциальные антиагреганты - диендиамин индояьного ряда,
замещенный по положению 1 индольного фрагмента,
(вещество 3) и диендиамин индольного ряда, не замещенный
по положению 1 индольного фрагмента, (вещество 9) после
внутривенного введения кроликам значительно подавляют
индуцированную функциональную активность тромбоцитов.
Эффект равен аналогичному у ниропруссида натрия, но
превышает его по длительности.
3. При пероральном введении животным вещества 3 и 9
сопоставимо угнетают действие АДФ на тромбоциты.
22
4. Вещество 9 (в большей степени, чем вещество 3) нивелирует
эффект на тромбоцшы арахидоновой кислоты.
5. Потенциальный антиагрегант стимулирует "дыхательный
взрыв" нейтрофилов человека.
6. Перспективное
лекарственное средство (вещество
9)
относится к V классу практически не токсичных соединений.
Внедрение в практику.
Полученные результаты влияния новых доноров оксида
азота на агрегацию тромбоцитов
используются в учебном
процессе на кафедре фармакологии М Г М С У при чтении лекций и
ведении практических занятий по теме "Средства, влияющие на
гемостаз".
Результаты доклинического исследования потенциального
антиагреганта являются основной частью документации,
необходимой
для
представления
в
Министерство
здравоохранения
Р Ф с целью получения
разрешения на
проведение первой фазы клинических испытаний.
Список работ, опубликованных по теме диссертации.
1. А.Г. Муляр, О Б . ^^аева, М.Т. Гасанов / Енаминовые
производные индольного ряда, как индукторы
образования активных радикалов кислорода // У П
Ншщональная конференция «Новое в изучении
патогенеза, диагностике, профилактике и лечении
патологии гемостаза». - Москва. - 2002 с. 58.
2. А.Г. Муляр, О.В. Дунаева, М,Т. Гасанов, Е.И.
Карамьппева, Н.П. Моряков / Влияние соединения 9 на
образование радикалов кислсфода («дыхательный
взрыв») и содержание свободного кальция [Са^"*^ в
образцах цельной крови // «Лекарства-Человеку». Харьков. - 2002. - с. 161-168.
3. О.В. Дунаева, М.Т. Гасанов / Новые доноры оксида
азота - перспективные антиагреганты // Материалы
60-й Юбилейной открытой
итоговой
научной
23
конференции студентов и молодых ученых В М А
"Медицина в начале нового века: достижения и
перспективы». - Волгоград. - 2002. - с. 151-152.
4. А.Г. Муляр, М.Т. Гасанов, О.В. Дунаева, В.Г. Граник /
Скрининг новых производных оксида азота по влиянию
на агрегацию тромбоцитов // «Лекарства-Человеку» Харьков. - 2002. с. 161-168.
5. А.Г. Муляр, М.Т. Гасанов, ОВ. Дунаева, Ю.А. Колосов /
Енаминовые производные индольного ряда как
источники получения новых противотромботических
лекарственных препаратов // Сб. трудов 2 съезда
Российского
Научного
Общества
фармакологов
«Фундаменатльные проблемы фармакологии». - 2003 г.
- 2 том. - с. 38.
6. А.Г. Муляр, О.В. Дунаева, М Т . Гасанов, Ю.А. Колосов
/ Поиск новых антиагрегантов среди енаминовых
производных индольного ряда, как потенциальных
доноров оксида азота // X Междун^юдный Конгресс
«Человек и лекарство». - Москва. - 2003 г. - с. 638.
7. А.Г. Муляр, О Б . Д^аева, М.Т. Гасанов, Ю.А. Колосов
/ Влияние новых доноров оксида азота на агрегацию
тромбоцитов и способность нейтрофилов генерировать
активные формы кислорода // Юбилейная конференция,
посвященная 10-летию основания всероссийской
ассоциации по изучению тромбозов, геморрагии и
патологии сосудов. - Москва. - 2003. - с. 68.
8. О.В. Дунаева, М.Т. Гасанов / Влияние новых доноров
оксида азота на клеточный гемостаз в условиях in vitro
// X X V Юбилейная итоговая конференция молодых
ученых. - Москва. - 2003. - с. 5.
РНБ Русский фонд
2006-4
24641
' г^V V.
2П (Щт -^^07
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
0
Размер файла
898 Кб
Теги
bd000103313
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа