close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

bd000103360

код для вставкиСкачать
На правах рукописи
ЛИТВИНОВА
Карина Сфгеевна
ВЛИЯНИЕ ГРАВИТАЦИОННОЙ РАЗГРУЗКИ И ТРЕНИРОВКИ НА
ХАРАКТЕРИСТИКИ КАЛЬЦИЙ-МЕХАНИЧЕСКОЙ СВЯЗИ В
ИЗОЛИРОВАННЫХ ВОЛОКНАХ СКЕЛЕТНЫХ МЫШЦ
03.00.13 - физиология
03.00.02 - биофизика
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
Москва-2005
Работа выполнена в Государственном научном центре Российской Федерации - Институте
медико-биологических проблем РАН
Научные ру1соводители:
доктор биологических наук
Борис Стивович Шенкман
аоктор физико-математических наук
Андрей Кимович Цатзгрян
Официальные оппоненты:
доктор медицинских наук, профессор
Оганов Виктор Сумбатович
доктсф медицинских наук, профессор
Никольский Евгений Евгеньевич
Ведущая организация:
Институт эволюционной физиологии и
биохимии им. И.М. Сеченова РАН
Защита диссертации состоится «
» декабря 2005 года в
часов на заседании диссертационного
совета K002.il 1.01 в Государственном научном центре Российской Федерации - Институте
медико-биологических проблем РАН по адресу: 123007, Москва, Хорошевское шоссе, д.76а.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНЦ Р Ф - Института медико-биологических
проблем РАН.
Автореферат разослан «
^» ноября 2005 г.
Ученый секрет!фь диссертационного совета,
кандидат биологических наук
ТТТР
л
И.П. Пономарева
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы
Пребывание в условиях реальной или моделируемой гравитационной разгрузки приводит к
значительным изменениям сократительных характеристик мышечных волокон млекопитающих
(Mounier et a l , 2000, Stevens et al., 1993,
Widrick et al., 1998-2000). Некоторые авторы связывают
изменение сократительных свойств с изменением объёма миофибриллярного аппарата (Mounier et
al., 2000, Stevens et al., 1993). В то же время, показано, что изменение силы изолированных
волокон оказывается более глубоким, чем изменение их структурных параметров (Widrick et al.,
1998-2000). Итак, сократительные свойства отдельных мышечных волокон могут зависеть от:
объёма сократительного аппарата; качественного и количественного состава миофибриллярных
белков; от параметров системы электромеханического сопряжения (в том числе, от кальциевой
чувствительности миофибрилл); жесткости мышечных волокон.
Роль каждого из этих факторов в процессе снижения сократительных свойств мышечных
волокон и клеточные механизмы такого снижения при гравитационной разгрузке в значительной
степени остаются неизученными.
В мышечном волокне кальций не только участвует в регуляции метаболических процессов, но и
выполняет основную роль в электромеханическом сопряжении, обеспечивающем передачу
сигнала о мьииечном со1фащении на миофибриллы. Согласованная работа кальциевых каналов и
Са-АТФазы саркоплазматического ретикулума обеспечивает тонкую регуляцию сократительной
активности мьш1вчных волокон.
О чувствительности миофибрилл к ионам кальция обычно судят по характеристикам кривой
«кальций-сила», отражающей зависимость изометрического напряжения изолированных, как
правило, скинированных волокон от концентрации кальция в растворе (Goblet et al., 1987). При
этом, сдвиг кривой вправо (в сторону меньших значений рСа и соответственно больших значений
концентрации ионов кальция) свидетельствует о снижении чувствительности миофибрилл к ионам
кальция. Известно, что, как у животных (крыс и обезьян), так и у человека после космического
полета наблюдается снижение Са-чувствительности миофибрилл (Mounier et al., 2000, Stevens et
al., 1993,
Widrick et al., J''98). Такой же сдвиг кривой «Са-сила» впразо был выявлен и в условиях
моделирования действующих факторов невесомости на Земле: в экспериментах с вывешиванием
крыс (McDonald et al., 1995) и в условиях антиортостатической гипокинезии в исследованиях с
участием добровольцев (Widrick et al., 1998). В то же время, механизмы внутриклеточной
сигнализации, зависимые от сократительной активности волокна in vivo, и запускающие цепь
событий, ведущую к снижению Са-чувствительности миофибрилл до сих пор неизвестны.
Цель работы состояла в изучении закономерностей и механизмов изменений сократительных
свойств и некоторых параметров системы электромеханического сопряжения волокон скелетных
мышц человека и животных при гравитационной разгрузке и тренировке.
^^'-'•"лцио1мл^;;;;;_
ВИБЛИОТЕКА
j
^"ISrJd^
Задачи работы;
- исследовать
сократительные
характеристики
клеточньк
свойства
маркеров
изолированных
мышечных
электромеханического
волокон,
сопряжения у
а
также
человека
и
животных, подвергнутых воздействию реальной и моделируемой гравитационной разгрузки;
- оценить роль системных и клеточных механизмов в изменении сократительных характеристик
волокон познотонических мышц в условиях гипогравитации;
- исследовать сократительные свойства и кальциевую зависимость сокращений изолированных
мышечных волокон при физической тренировке у человека.
Научная новизна работы;
- вп^вые обнаружено, что фавитациоиная разгрузка приводит к перераспределению экспрессии
изофс^м белков Са-АТФазы саркоплазматического ретикулзгма, а именно увеличивается
S E R C A I типа (быстрого типа);
- впервые установлено, что в 3-х и 7-днев1и>1й период возвращения к опорной нафузке после 14дневной
фавитационной
разфузки
не
возможностей одиночных мышечных волокон;
происходит
восстановления
сократительных
- впервые показано, что в группах реадаптации как в течение 3, так и 7 дней увеличилась доля
гибридных волокон, экспрессирующих SERCA медленного и быстрого типа (I и II);
- впервые выявлено, что стимуляция опорного входа стопы позволяет предотвратить уменьшение
сократительных возможностей волокон т. salens человека;
- впервые
показано
и доказано, что
опорная
стимуляция
чувствительности миофибрилл к свободным ионам кальция;
предотвращает
уменьшение
- впервые обнаружено, что применение кальций-связывающего агента позволяет полностью
предотвратить снижение кальциевой чувствительности миофибриллярного комплекса в
условиях фавитационной разфузки;
- впервые показано, что внутрибрюшинное введение ЭГТА на фоне фавитационной разфузки
приводит
к
предотвращению
процессов
саркоплазматического ретикулума;
изменения
экспрессии
кальциевых
помп
- впервые установлено, что 4-недельная тренировка в интервальном режиме приводит к
увеличению удельной силы одиночных мышечных волокон т. vastus lateralis человека.
Научная и практическая значимость
Полученные результаты расширяют представления о роли некоторых факторов, влияющих на
сократительные свойства одиночных волокон скелетных мышц в условиях фавитационной
разфузки и тренировки. Эти результаты имеют большое праетическое значение, поскольку
исследование сократительных свойств и некоторых параметров системы электромеханического
сопряжения в мышцах человека при моделируемой и реальной фавитационной разфузке
позволяет оценить эффективность подходов, направленных на уменьшение или предотвращение
негативного влияния невесомости на мышцы.
Результаты исследования используются в учебном процессе аспирантов ГНЦ Р Ф - Института
медико-биологических проблем РАН.
Основные положения, выносимые на защиту:
1. Снижение максимальной силы скинированных волокон т
разгрузки обусловлено устранением опорного стимула.
soleus в условиях гравитационной
2. Снижение сократительных возможностей мышечных волокон при гравитационной разгрузке
связано с накоплением ионов кальция в миоплазме.
3. Тренировка на велоэргометре в интервальном режиме, которая часто используется в подготовки
спортсменов разных специализаций, приводит к увеличению удельной силы единичных
волокон.
Апробаиия работы
Результаты исследований и основные положения работы были представлены и обсуждены на 32-
ой и 34-ой Европейских мышечных конференциях (Монпелье, Франция, 2003; Дебрецен, Венгрия,
2005); 24-ОМ, 25-ом и 26-ом Международных гравитационных физиологических съездах (Санта-
Моника, США, 2003; Москва, 2004; Кельн, Германия, 2005); 5-м Кошрессе Итальянской
ассоциации миологии (Неаполь, Италия, 2005); Международном симпозиуме «Биологическая
подвижность» (Пущино, 2004); 2-ой и 3-ей Международных конференциях по физиологии мышц и
мышечной деятельности (Москва, 2004, 2005); Конференция молодых специалистов, аспирантов и
студентов, посвященная дню космонавтики (ИМБП, Москва, 2002-2005).
Диссертация апробирована на заседании секции Ученого совета ГНЦ РФ - ИМБП РАН
«Космическая биология и физиология» 27 сентября 2005 года
Публикации
По теме диссертации опубликовано 17 печатных работ
Структура и объем диссертации
Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания методов
исследования, описания организации экспериментов, изложения результатов и их обсуждения,
общего заключения, выводов и списка цитируемой Л1ггературы. Работа изложена на 123 страницах
печатного текста, включает 24 рисунка, 9 таблиц и список литературы из 129 наименований.
М А Т Е Р И А Л Ы И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Экспериментальный материал. В работе бьши использованы биопсийные образцы мышечной
ткани крыс (линия Вистар) и биопсии человека, взятые после пребывания в условиях реальной и
моделируемой гравитационной разгрузки и интервальной тренировки. Для создания условий
микрогравитации применялась модель вывешивания задних конечностей крыс в течение 14 суток
(Morey-Holton & Globus, 2002) и модель 7-суточной «сухой» иммерсии человека (Шульженкс и
Виль-Вильямс, 1975).
5
Все добровольцы дали согласие на участие в исследованиях в соответствии с
нормами
Хельсинкской Декларации. В экспериментах с животными использовали половозрелых самцов
крыс линии Wistar в возрасте 2 месяцев выращенных в питомнике ГНЦ Р Ф - ИМБП РАН.
Животных содержали в стандартных условиях. Все процедуры были одобрены Комиссией по
биомедицинской этике ГНЦ Р Ф - ИМБП РАН.
Забор и храпение экспериментального материала. В экспериментах с участием человека пробы
мышечной ткани забирали из т
Бергстрему (1962) У крыс т
soleus и т
vastus lateralis методом игольчатой биопсии по
soleus выделяли целиком из обеих задних конечностей крысы.
Мьппцу взвешивали и из центральной ее части вырезали кусочки длиной 0,5 см.
Для иммугюгистохимического анализа полученные кусочки ткани ориентировали поперечно,
фиксировали на бумажной подложке с помощью Tissue-Tek* (ОСТ^^ Compound 4583) и
замораживали в жидком азоте Мышечные пробы хранили при температуре -80°С вплоть до
обработки.
Для анализа со/дгатительных свойств пучки мышечных волокон диаметром 0,1-0,3 мм немедленно
помещали в скииирующих раствор, содержащий ЭГТА Методика химического скинирования, при
котором происходит частичное разрупюние клеточной мембрашг, была
раннее описана Stevens
и соавт (1993). Затем пробу перемеиити в раствор для хранения при -20°С.
Анализ сократительных свойств проводили на единичных волокнах (7-10 волокон из каждой
пробы мышцы), изолированных из скицированный мышцы. Перед каждым экспериментом
изолированный сегмент волокна длиной 0,5-2 мм помещали на 10 мин. в раствор, содержащий 0,5%
детергента Triton Х-100. Затем сегменты единичных волокон переносили в камеру с
расслабляющим раствором (раствор R) Один конец волокна прикрепляли к датчику силы (модель
FORT 10, Word Precision Instruments, США, уровень шума <3 мкН) с помощью шелковой нити.
Другой конец жестко крепили к пассивному плечу - пинцету.
Механическое напряжение регистрировали 2-канальным высокочастотным аналого-цифровым
преобразователем, который был специально разработан Д.Д. Мациевским (Институт общей
патологии и патофизиологии РАМН) Продолжительность записи сокращения каждого сегмента
волокна в среднем составляла 20-30 мин, брали 8 точек (уровень силы при кажд'^Я концентрации
Са * записывали в течение 1 мин). Данные записывали в память персонального компьютера.
Профамма управления экспериментом и цифровой регистрации сигналов датчика была
разработана в ИМБП РАН. Для анализа данных экспериментов использовали программный
пакет, предоставленный Лилльским технологическим университетом (Франция), и собственно
разработанную программу, работающую в среде Microsoft Excel.
Длину саркомеров измеряли в растворе R с использованием дифракционного паттерна света НеNe лазера (длина волны 633 нм, мощность 4 мВт). Под контролем дифракции устанавливали длину
саркомеров 2,6iO,l мк - для крыс и песчанок и 2,4±0,1 мк - для человека и обезьяны, что
позволяло стандартизировать данные при измерении максимальной силы (/"о). Диаметр волокна
измеряли с помощью бинокуляра, имеющего микрометр (х80). Все манипуляции проводили при
температуре 17+1°С.
в
начале казкдого эксперимеггга тестировали Ро (максимальную силу сокращения) при
концентрации Са^*, соответствующей рСа 4,2, что позволяло полностью насытить Са'* все участки
связывания ТпС.
Рассчитывали взаимосвязь сила - концентрация Са^'^. Каждая амплитуда силы сокращения,
полученная для соответствующих
растворов с различными
концентрациями Са^*, была
нормализована на величину от максимальной силы Ро (соответствующие величины, Р/Ро, были
отнесены к рСа). Экспериментальные результаты обрабатывали с использованием уравнения
Хилла: Р/Ро = ([Cc?*]/Kdf /1+([Са'*])/Кф", где и - коэффициент Хилла (величина наклона
кривой); Kd - постоянная Хилла (pKd=-logKd=pCaso)', Са'*- концентрация кальция; Р - сила, с
которой сокращается волокно при данной концентрации Са^*; Ро - сила максимального
сокращения волокна в растворе с насыщающей концентрацией Са^^.
Растворы (рН 7,0, ионная сила 0,2М). В скинирующем растворе содержалось (в мМ): 2,5 АТР, 20
MOPS, 2.5 Mg ацетат и 5 Kj-EGTA. Для экспериментальных процедур были использованы
следующие растворы: промывочный раствор W состоял из (в мМ): 2,5 АТР, 20 MOPS, 2.5 Mg
ацетат. Расслабляющий раствор R был такой же, как и скинирующий. Для поддержания высокой
концентрации А Т Ф в клетке использовали систему, содержащую 20-30 мМ креатинфосфата и 1 1,5 мг/мл креатинфосфокиназы. Активирующие растворы состояли из промывочного раствора
(W), содержавшего различные концентрации Са^'^ (свободные ионы из СаСОз), с добавлением
буфера EGTA. Раствор, содержащий 0,5 %
расслабляющего раствора.
детергента Triton Х-100, был приготовлен на основе
Иммуногистохимический анализ мышечных срезов. Готовили криостатные поперечные срезы
толщиной 10 ум при -20°С. Срезы монтировали на предметные стекла и окрашивали антителами
против быстрой и медленной изоформ SERCA (I и 10 Анализ срезов проводили на световом
микроскопе фирмы Leica модель DC 300F. Измерения проводили с помощью системы
компьютерного анализа изображения QUANT1MET-500 (Leica) с цветной цифровой видеокамерой
JVC ТК-1280Е, Разрешение видеокамеры 720x512 пикселей с 8 бит/пиксель. Подсчитывали долю
мышечных волокон, содержащих соответствующие изоформы SERCA. Распределение волокон
было выражено как отношение числа волокон, экспрессирующих SERCA I или SERCA I I на срезе
к общему количеству волокон. В обработку включали все волокна на каждом срезе.
Статистическая обработка полученных данных выполнена на персональном компьютере с
использованием программ "Stat'stica-6.0" и "Ехсе1-7.0". Различие средних значений показателя в
сравниваемых выборках считали значимым при уровне значимости /»<0,05. Результаты
представлены в виде М±т.
РЕЗУЛЬТАТЫ ЭКСПЕРИМЕНТОВ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Часть I. Эффекты гравитационной разгрузки
1.1. Исследование сократительных свойств и некоторых параметров системы
электромеханического сопряжения волокон скелетных мышц космонавтов до и после
длительного космического полета
Прямые данные, касающиеся эффектов гравитационной разгрузки можно получить при
исследовании мышц космонавтов до и после длительного космического полета.
Исследование
мышечной ткани проводили у 3-х членов экипажей М К С (А, В, С) в длительных космический
полетах (МКС - 6, 7 и 8) в рамках бортового эксперимента «МИОН». Космонавты А, В и С
провели на станции 6 месяцев. Пробы мышечной ткани забирали из т
soleus дважды: в
предполетном периоде и к концу 0-х суток после посадки Космонавты в ходе полета выполняли
профилактические физические тренировки по бортовой программе. В основу тренировок было
положено выполнение беговых (на бегущей дорожке) и велоэргометрических нагрузок в
повторном режиме
Дважды во время полета была проведена запись объема и интенсивности
выполняемых нагрузок в течение стандартного микроцикла. Полученные значения объема и
интенсивности нагрузок сопоставляли с теми значениями, которые были предварительно
рекомендованы космонавтам.
Анализ сократительных свойств одиночных скинированных волокон т . soleus двух
космонавтов (А и С). После длительного космического полета у космонавтов А и С значения
диаметра мышечных волокон и максимальной силы, были значительно ниже, чем до полета
(табл. 1.1). Достоверное, хотя и менее выраженное, уменьшение диаметра и изометрической силы
волокон т soleus было ранее выявлено в работах Widrick и соав! (1999-2001) при исследовании
эффектов 18-суточного космического полета. Согласно их данным, уменьшение диаметра волокон
и максимальной силы составило соответственно 5% и 13%. При исследовании эффектов
длительной гипокинезии Yamashita-Goto (2001) обнаружил более существенное снижение как
диаметра, так и силы волокон т. soleus человека. После 60 и 120 суток гипокинезии диаметр
волокон уменьшился, соответственно, на 8% и 36%, а изометрическая сила - на 38% и 76%,
соответственно. Глубина изменений, полученных в настоящем исследовании больше, чем при
кратковременном космическом полете (табл. 1.1.). Однако следует заметить, что космонавты
провели 6 месяцев на борту орбитальной станции. В таком случае, на полученные изменения
сократительных свойств одиночных волокон т. soleus обоих космонавтов А и С следует взглянуть
с другой стороны. После 120 суток постельной гипокинезии диаметр волокон уменьшился на
36%. В нашем случае, длительное пребывание космонавтов на борту М К С привело к уменьшению
этого показателя на 47%. Если разделить период пребывания на три равные части, то получится,
что за 40 дней гравитационной разгрузки диаметр одиночных волокон т. soleus уменьшался в
среднем на 15%. Однако, уменьшение диаметра у космонавтов после космического полета было
больше, чем изменение абсолютной силы изолированных волокон. За 120 дней гравитационной
разгрузки максимальная сила одиночных волокон т soleus в среднем снизилась на 38%, чем до
полета, т.е. за 40 дней снижение этого показателя составило всего 12%. После 60 суток постельной
8
гипокинезии
изометрическая
сила
волокон
снижалась
на
38%,
после
120
суток
гипокинезии - 76%.
Таблица 1.1
Значения диаметра волокон (D), изометрического напряжения волокон- абсолютной (Р») и удельной (P^d)
силы, а также показатели кальциевой чувствительности миофибрилл (M±ni).
космонавт А
Параметры
космонавт С
до полета
после полета
до полета
после полета
(10 волокон)
(7 волокон)
(7 волокон)
(6 волокон)
D, (мкм)
92,5±3,01
85,6±!,37*
90,0±2,12
81,2±1,90*
РоХМ)
0,55±0,02
0,37±0,04*
0,72±0,03
0,49+0,02*
82,8±3,21
63,7±3,11*
113,0316,15
95,10+4,26*
рСатт
6,95+0,03
6,7±0,01*
6,85+0,03
6,65±0,02*
pCaso
5,83±0,01
5,7±0,03*
5,78±0,02
5,66+0,01*
Рул, (кН/м^)
'достоверное отличие от исходного уровня при /К0,05
Результаты проведенного анализа свидетельствуют о том, что стандартные бортовые нагрузки и
система профилактики космонавтов А и С оказали заметное коррекционное воздействие на
сократительные свойства одиночных волокон скелетных мышц в условиях длительного
пребывания в реальной невесомости.
Снижение удельной максимальной силы мышечных волокон т soleus ранее показали Fitts и
соавторы (1998) после космических полетов человека MacDonald (1995) получил аналогичное
снижение удельной силы в экспериментах с вывешиванием крыс. Группа же французских
авторов, как в реальной, так и в условиях моделируемой невесомости не обнаружила такого
эффекта (Mounier et a l , 1997) В настоящем исследовании у обоих космонавтов после 120 суток
космического полета обнаружено достоверное снижение удельной силы на 25%
HfrrepecHo и то, что длительное пребывание в условиях гравитационной разгрузки приводит
также и к уменьшенил чувствительности миофибрилл к свобод.(ым ионам Са * Так, кривая,
отражающая зависимость относительной силы волокон от концентрации Са * в растворе, после
дли-гельного космического полета у космонавтов А и С сдвигается вправо, что свидетельствует об
увеличении концентрации, необходимой для той же силы сократительного ответа волокна, т.е. о
снижении чувствительности миофибрилл к Са^* (рис 111). Количественным отражением этого
сдвига является достоверное уменьшение порогового рСа и pCaso. Этот эффект был впервые
обнаружен при исследовании волокон т soleus крыс, находившихся в условиях невесомости на
борту советских биоспутников серии «Космос» (Mounier et а!, 1991). В дальнейшем, уменьшение
чувствительности миофибрилл к Са^^ было обкар^океко в экспериментах с человеком после
пребывания в условиях, как космического полета, так и гипокинезии (Yamashita-Goto et a l , 2001)
S:
50
Рис. 1.11 Зависимости напряжения от концентрапии кальция скинированных единичных волокон
m soleus космонавтов А и С Кривые получены аппроксимацией данных уравнением Хилла (см раздел
«Методы обработки и анализа материала») Показаны средние значения P/Pgim Синяя кривая - до полета,
красная кривая - после полета.
Этот феномен имеет очевидное функциональное значение, указывая на снижение сократительных
возможностей волокна в диапазоне субмаксимальных нагрузок (Macintosh, 2003). Изменение
чувствительности миофибрилл к Са^* может быть следствием изменения паттерна изоформ
тропонинов Т и С в сторону увеличения доли изоформ, характерных для волокон быстрого типа
(Stevens, 2002). Не исключено также, что уменьшение сократительного ответа на заданную
концентрацию Са^* обусловлено уменьшением вероятности образования необходимого количества
акгомиозиновых мостиков (Riley, 1998) в результате количественных или конформационных
изменений миофиламентов (например, деформации или дезинтефации тонких нитей).
Иммуногистохимический анализ Са-АТФаза саркоплазматического ретикулума (SERCA) т.
soleus у космонавтов. Гравитационная разгрузка приводит к перераспределению экспрессии
изоформ белков Са-АТФазы саркоплазматического ретикулума, а именно увеличивается SERCA I
быстрого типа (KJandarian et al., 1996). Эти белки являются важнейшими звеньями системы
электромеханического сопряжения и в значительной степени определяют характеристики
сократительных ответов волокна. Процент содержания SERCA I достоверно выше в разгруженных
мьиицах у обоих космонавтов. Впервые были получены данные, свидетельствующие об изменении
медленной г^зоформы Са-АТФазы саркоплазматического ретикулз^а мышечных волокон т. soleus
при гравитационной разгрузке (рис. 1.1.2). По нашим данным процент волокон, экспрессирующих
SERCA I I , уменьшается: на 22% у космонавта В, на 30% у космонавта С. Однако такое уменьшение
НС согласуются с данными S. Kandanan. В ее работах при гравитационной разгрузке не наблюдалось
уменьшение SERCA II типа Возможно, такое расхождение данных связано с экспрессией в
мышечных волокнах еще одного типа SERCA. В работах Martin и соавт. (2001) была обнаружена
изоформа SERCA III в волокнах человека, а потом и в волокнах крысы. В наших экспериментах
окрашивали препараты антителами только против SERCA I и SERCA II. Следует заметить, что при
гравитационной разгрузке многократно наблюдался сдвиг соотношения медленных и быстрых
10
ичоформ миозина в б ы с ф у ю сторону у крыс после космическою почета и антиор1ОС1а1ическ01о
вывешивания (Ogano\ et al
!981) У чечовека после космическою полегл и антиоргостагической
1ипокинезии признаки анало1ичных изменений не были значимыми fOhira et a l . !999)
В нашем эксперименте профилактические физические упражнения на борту космического
аппарата не предотвратили
изменения белков Са-АТФазы саркопла^матического peJикyлyмa у
космонавтов В и С Э ю т факт можно связать со снижением чувствигельности миофибрилл к Са^" и
смешением вправо ка^1ьциевой кривой Сравнивая процент увеличения лнух белков можно сделать
вывод, что Са-АТФаза саркоплазма!ическою ретикучума быстрых волокон более лабильна, т е
более чувствительна к понижению мышечной активности в условиях опорной разгрузки
100%
1
Рис
112
Cooi ношение мышечных
волокон, содержащих SERC А I, S E R C A II
типа, а также S E R C A I/II типа в m ioleus
двух космонавтов (%, Mi^m) Первые два
столбика до и после полета - данные
космонавта В. вюрые два столбика
данные космонавта С
*дос1оверное
отличие
от
предполетных
данных
каждог о космонавта (/КО.05)
до полета
после полета
до полета
после полета
B S E R C A " | I P S F R C A I/II типа i s E R C A I типа
1.2. Исследование сократительных характеристик единичных волокон т. ^loleus к р ы с
в период 3-х и 7-лневного восстановления после 2-недельного с н я т и я опорной нагрузки
Выявление существенных изменений сократительных свойств одиночных волокон в условиях
1 равитационной разгрузки стиму тировало исследования этих же показателей после выведения из
состояния гипокинезии.
В
экспери.мепте использовали
половозрелых самцов 1фыс линии Wistar в возрасте 2 .месяцев
выращенных в ниюмнике Г И Ц Р Ф - И М Б П Р А Н . Ж и в о т ы х содержшш в сгаширтных условиях Они
получапи корм в соответствии с рационом для лабораторных животных и воду ad hhitiim
Все
процедуры с животными был1" одобрены Комиссией по биомедицинской этике Г Н Ц Р Ф - И М Б П Р А ! I
Животные были разделены на 4 группы (и - количество животных в группе)
«Контроль»; фуппа № 2 - «Вывешивание»; группа № 3
группа № I -
«Вывешивание + восстановление 3 дня»,
группа № 4 - «Вывешивание + восстановление 7 дней»
Группу Hi \ - «Контроль», составили 7 крыс, которые находились в к.чегках в течение 14 дней
Животные группы № 2 - «Вывешивание» («=7).
в течение 14 дней находились в положении
антиортостатического вывешивания Животных группы Хг 3 - «Вывепшвание + восстановление 3
дня»
ff7=5), и группы № 4 - «Вывешивание + восстановление 7 дней» («=6), после 14-ги дней
II
вывешивания помещали в клетки и забивали через 3 и 7 дней восстановительного периода
соответственно.
Анализ сократительных свойств одиночных волокон т. soleus крыс. Уменьшение массы
мышечной ткани является обязательным следствием гравитационной разгрузки. 14-дневное
вывешивание крыс привело к достоверному снижению сырого веса мышцы на 38% по сравнению
с животными контрольной группой (табл. 1.2). 3-суточное восстановление крыс практически не
повлияло на изменение этого показателя. Однако, через 7 дней сырой вес мышцы т. soleus
практически полностью восстанавливается. По данным серии работ группы Musacchia и соавторов
(1983), в которых сравнивали вывешивание крыс с другими моделями микрогравитации, масса
мышц задних конечностей нормализуется через 1-2 недели после 7-, 14-, и 18-суточного
вывешивания крыс.
Таблица 1.2.
Значения веса т soleus (W), диаметра волокон (D), изометрического напряжения волокон; абсолютной (Рд)
и удельной iPyi) силы, а также показатели кальциевой чувствительности миофибрилл (pCaso, рСа,„„),
(М±т).
Восстановление
Восстановление
Контроль
Вывешивание
Параметры
3 дня
7 дней
(40 волокон)
(50 волокон)
Вес т. soleus, (мг)
D, (мкм)
Ро, (мН)
Руа, (кН/м')
рСа„ш
рСа;о
109,7±1,3
79,6+1,6
0,47+0,02
100,0+7,0
7,02±0,05
5,85+0,06
(33 волокна)
71,1±6,3**
60,1±2,1*
0,26±0,05*
91Д±7,3
6,69гШ,02*
5,68+0,01*
._
^ А ПС. S
..
76,2+8,6*'
62,14+1,8*
0,25+0,06*
81,20+16,7
6,7±0,03*
5,7±0,02*
(41 волокно)
101,8+7,7
63,6±3,0*
0,24+0,01*
77,10+6,4*
6,8+0,02*
5,76+0,01*
Как и следовало ожидать, пребывание в условиях моделируемой действии микрогравитации
привело к значительным изменениям сократительных характеристик мышечных волокон т soleus
у крыс. Диаметр волокон уменьшился на 15%, абсолютная сила - на 32%. удельная ~ на 5%.
Ни 3-суточное, ни 7-суточное восстановление не привело к увеличению ни одного из приведенных
показателей (табл. 1.2).
Атрофия т soleus при вывешивании задних конечностей крыс происходит за счет уменьшения
размеров мышечных волокон, а не их количества (Thomason et a l , 1990) Следовательно, вес
мышцы и диаметр отдельных волокон должны восстанавливаться вместе Но в нашем
эксперименте вес мышцы полностью восстановился через неделю возобновления мышечной
нагрузки, а диаметр волокон - нет Одним из феноменов, сопровождающих кратковременное
пребывание в условиях гравитационной разгрузки (иммерсия, космический полет), является
дегидратация (Григорьев и др., 1978), очевидно, затрагивающая как объем циркулирующей
плазмы и внеклеточную воду, так и внутриклеточную воду (Лобачик и др., 1998). Таким образом,
редукция площади поперечного сечения мышечных волокон может быть обусловлена, как
12
уменьшением объема белкового, так и небелкового (главным образом, водного) компонентов.
Учитывая особенности техники первичной обработки при анализе скинированных волокон,
следует принимать во внимание, что для проникновения ионов кальция волокна применяется
метод скинирования сарколеммы В процессе скинирования в мембране появляются поры, через
которые уходит часп. небелкового компонента В нашем эксперименте восстановление сырого
веса мышц крыс может быть связано с интенсивной гипергидрагацией волокон в период 7дневной реадаптации после двухнедельного снятия опорной нагрузки В таком случае, оценивая
изменения диаметра изолированных волокон мышц животных фуппы «Восстановление 7 дней»,
мы не могли наблюдать восстановления этого показателя Снижение удельной максимальной силы
мышечных волокон от soleus при вывешивании крыс ранее показали (McDonald et а!, 1995) Это
может свидетельствовать, прежде всего, о том, что снижение абсолютной силы волокна не может
бып, следствием лишь уменьшения объема сократительного аппарата (атрофии), но должно быть
обусловлено также и действием других внутриволоконных механизмов. Такими механизмами
могут быть как изменения качественной структуры миофибрилл, включая избирательный распад
белков саркомерного цитоскелета (Toursel et al, 2002), так и изменения кальциевой реактивности
миофибриллярного аппарата, которые неоднократно наблюдались при исследовании волокон
т soleus после пребывания в условиях микрогравитации (Stevens et al., 2002). В нашем
исследовании, кривая, характеризующая зависимость относительного изометрического
напряжения от концентрации кальция, у животных трех экспериментальных групп (вывешивание,
восстановление 3 и 7 дней) была смещена вправо (рис 12 1) Аналогичный сдвиг кривой вправо
был выявлен как в условиях моделирования действующих факторов невесомости на Земле (Kischel
et al., 2001), так и после космического полета крыс (Mounicr el al., 1991).
100
9: м--
Рис 121 Зависимости напряжения от
концентрации кальция скинированных
единичных волокон т. salens крыс.
1^ивые
получены
аппроксимацией
данных уравнением Хилла Показаны
средние значения P/Pgbm. Черная кривая
- контрольная группа; красная кривая вывешивание; светло-серая кривая восстановление 3 дня; темно-серая кривая
- восстановление 7 дней.
В работах группы Mounier (2001) показано, что снижение чувствительности миофибрилл к
кальцию при вывешивании крыс сопровождается изменениями паттерна изоформ тропонинов I и
С. Авторы этого цикла работ полагают, что изменения паттерна тропонинов являются структурной
основой изменений чувствительности миофибрилл к кальцию при гравитационной разгрузке Не
13
исключено также и то, что уменьшение сократительного ответа на данную концентрацию Са
обусловлено уменьшением вероятности образования необходимого количества актомиозиновых
связей в результате количественных или конформационных изменений миофиламентов (Riley,
1998). Также было показано, что относительное содержание титина и небулина при вывешивании
крыс значительно снижается (Shenkman, Podlubnaya, 2003). Следует отметить, что уменьшение
относительного содержания нсбулина, который является важнейшим скелетным компонентом
тонких миофиламентов, может обусловить их дезинтеграцию и соответствующее снижение
вероятности образования актомиозиновых связей. А это в свою очередь может снизить Са^'^
чувствительность миофибрилл.
Иммуногистохимический анализ Са-АТФаза саркоплазматического ретикулума (SERCA)
т. soleus
у 1фыс. Поскольку идентифицированы различные изоформы Са-АТФазы,
специфические для быстрого и медленного типов волокон скелетных мышц, а также показана
более высокая активность Са-АТФазы для быстрых волокон по сравнению с медленными (Peters et
al., 1999), можно предположить, что в ходе вывешивания в медленных волокнах синтезируется
быстрая Са-АТФазы при подавлении синтеза медленной изоформы фермента. У крыс,
подвергнутых 14-дневному антиортостатическому вывешиванию, обнаружено 40±3% волокон,
содержавших быструю (SERCA I типа) изоформу Са-АТФазы саркоплазматического ретикулума,
против 27±1% у К01прольных животных
(Рис. 1.2.2). Восстановление не приводило к
определенной стабилизации распределения изоформ быстрой и медленной SERCA по мышечным
волокнам. Однако, в группах восстановления как в течение 3, так и 7 дней увеличилась доля
гибридных волокон, экспрессируюших SERCA обоих типов (I и II) и составила 17% и 14%
соответственно. По-видимому, в период адаптации к возобновлению опорной нагрузки в
медленных волокнах т. soleus, подвергнутых трансформации во время вывешивания, происходит
постепенные процессы деградация синтезированных в ходе вывешивания быстрых изоформ СаАТФазы и синтеза медленной Са-АТФазы, характерной для этого типа волокон в норме.
100%
80%
Рис
12 2
Соотношение
мышечных волокон, содержащих
SERCA I, SERCA II типа, а также
SERCA 1Л1 типа с, т. soleus у
крыс (%, M-tm)
*достоверное
отличие от контрольной группы
(р<0,05).
60%
20%
-
Контроль
Вывешивание
Восстановление 3 Восстановление 7
дня
И SERCA П
□ SERCA 1/11 типа
дней
ВЗЕВСМтипа
14
1.3. Роль опорного стимула. 7-ми суточная «сухая» иммерсия
В эксперименте приняли участие 8 добровольцев мужского пола: средний возраст 26,5013,16
лет, рост - 178,30+3,95 см, вес - 77,90+11,09 кг, которые прошли специальный медицинский
отбор. Испытуемые были полностью информированы обо всех процедурах, применяемых в
эксперименте, и дали письменное согласие на участие в нем. Эксперимент бьш одобрен
Физиологической секцией Российской национальной комиссии по биологической этике.
Испытуемые были разделены на две группы. Контрольную группу составили 4 человека, в
течение 7-ми суток находившихся в условиях «сухой» иммерсии без дополнительных воздействий.
Испытуемого
помешали в горизонтальном положении в специальную ванну, покрытую
водонепроницаемой пленкой, изолирующую его от жидкости - воды. Размеры пленки значительно
превосходят площадь поверхности воды, благодаря чему осуществляется свободное и практически
полное погружение тела человека в воду. При этом достигается равномерное давление воды на
всю поверхность тела, что моделирует полное отсутствие опорных стимулов, характерное для
невесомости. Температуру воды автоматически поддерживали на уровне 33''С в течение всего
времени воздействия. Во второй группе из 4-х человек, дополнительно к условиям иммерсии
проводили искусственную стимуляцию глубоких рецепторов давления опорных зон стопы с
помощью компенсатора опорной разфузки. Разработанный в ИМБП совместно с НПО «Звезда»
компенсатор опорной разфузки представляет собой специальный ботинок, в подошву которого
вмонтированы пневматические подушки, обеспечивающие давление на опорные зоны стопы в
заданном режиме. Стимуляцию проводили ежедневно. Стимулы (0,2±0,15 кг/см^) подавали в
течении 10 минут с частотой, соответствующей 75-ги шагам в минуту, и в тече1ши 10 минут с
частотой, соответствующей 120-ти шагам в минуту, в начале каждого часа в течение 6-ти часов
За неделю до начала иммерсии и в первый день после ее окончания из т soleus левой ноги
забирали пробы мышечной ткани.
Анализ сократительных свойств одиночных волокон т. soleus человека. В эксперименте у
всех испытуемых контрольной группы наблюдали уменьшение, как диаметра мышечных волокон
в диапазоне от 15% до 34%, так и максимальной изометрической силы в диапазоне от 28% до 57%
(табл. 1.3). Ранее бьшо выявлено менее выраженное уменьшение этого показателя при
исследовании эффектов 18-суточной АНОГ и 18-суточного космического полета (Yamashita-Goto
et a l , 2001, Fitts et al , 1998) После АНОГ снижение силы волокон составило соответственно 13%,
после космического полета - 2 1 % Таким образом, глубина изменений, полученных в настоящем
исследовании, оказывается значительно большей, чем пос-е кратковременной АНОГ и
сопоставимой лишь с эффектами 18-дневного космического полета и длительной АНОГ Согласно
данным более ранних исследований многие другие характеристики двигательного аппарата
(изокинетическая сила мышц, показатели сухожильных рефлексов) при иммерсии претерпевают
более глубокие изменения, чем в условиях гипокинезии (Григорьева, Козловская, 1987). Если
считать, что степень безопорности при использовании иммерсионной модели значительно больше,
чем при гипокинезии, и сопоставима со степенью безопорности, характерной для реалыюй
невесомости, то можно предположить, что как размеры, так и сила мышечных волокон зависят в
большей степени от опорного воздействия, чем от действия других биомеханических факторов
15
Исходя из этого предположения, целесообразно оценить эффекты иммерсии, сочетанпой с
прямой стимуляцией опорных зон стопы
Данные, полученные у испытуемых этой группы значительно отличались от данных основной
группы У них было выявлено небольшое снижение диаметра волокон от 8% до 18% и отсутствие
достоверных изменений максимального изометрического напряжения (табл 1.3) Таким образом,
применение опорной стимуляции в значительной степени предотвратило снижение диаметра и
силы отдельных мышечных волокон т snleus у человека В более ранних экспериментах нашей
лаборатории применение опорной стимуляции стопы предотвращало уменьшение размеров
мышечных волокон т
soleus и трансформацию медленных волокон в быструю сторону при
вывешивании крыс (Shenkman, Nemirovskaya, 2000) Интересно, что выраженность этого эффекта
была значительно менее выражена при иммобилизации т soleus. Эти данные были подтверждены
в экспериментах DeDoncker и др (2001) и Clarke и др. (2005) с механостимуляцией опорных зон
стопы у вывешенных крыс В нашем исследовании стимуляция опорного входа позволила
предотвратить уменьшения сократительных возможностей волокон от soleus человека
Таблица 1.3.
Значения диаметра волокон (D), изометрического напряжения волокон абсолютной (Ро) и удельной (/'^.d)
силы, а также показатели кальциевой чувствительности миофибрилл (М±т).
Параметры
D, (мкм)
группа «Иммерсия»
до иммерсии
(30 волокон)
группа «Иммерсия + Опора»
после иммерсии
(27 волокон)
до иммерсии
(29 волокон)
после иммерсии
(29 волокон)
98±3,34
75,4+2,75*
91,31+5,13
81,2±3,5
Рв.(мН)
0,49 ± 0,01
0,34 ±0,03*
0,44+0,03
0,52+0,04*
Ло, (кН/м')
65,25+3,4
70+3,8
67,2+4,9
91,2+9,96
6,73+0,01
5,70 + 0,01*
рСа„,„
6,83 ± 0,02
6,64 + 0,02*
6,79 + 0,01
pCajo
5,78 + 0,02
5,66 + 0,01*
5,77 + 0,04
•достоверное отличие от исходного уровня (fxOfiS)
Интересно и то, что опорная стимуляция предотвращает также и уменьшение чувствительности
миофибрилл к свободным ионам кальция, как правило, наблюдаемое при разгрузке. Так, кривая,
отражающая зависимость относительной изометрической силы волокон от отрицательного
логарифма концентрации ионов Са^*, после пребывания в условиях иммерсии сдвигается вправо,
что свидетельствует о снижении чувствительности миофибрилл к ионам Са * (рис. 1.3.1). У
испытуемых, применявших стимуляцию опорного входа на фоне иммерсии, не было обнаружено
достоверных изменений этой кривой. В настоящем исследовании впервые получены прямые
свидетельства влияния изменений опорной афферентации на сократительные характеристики
мышечных волокон т soleus человека Не исключено, что это влияние опосредовано активностью
двигательных единиц т. soleus Это предположение вполне согласуется с результатами
экспериментов Layne и соавторов (1998), обнаруживших увеличение электромиографической
активности т. soleus у космонавтов, применявших стимуляцию опорных зон стопы
16
Ь
mvnna «Иммерсия»
50
rpvnna «Иммерсия-Юпора»
Рис 1.3 I Зависимости напряжения от концентрации кальция скинированных единичных волокон
т soleus человека. Кривые получены аппроксимацией данных уравнением Хилла Показаны средние
значения P/Pgtm. Синяя кривая - до иммерсии, красная кривая - после иммерсии.
Изменение сократительных свойств волокон под влиянием изменений активности опорного
входа может быть опосредовано изменением активности двигательных единиц Киренская и др.
(1986) показали, что уже после трех суток пребывания в сухой иммерсии субмаксимальная
произвольная механическая активность разгибателей голени обеспечивается за счет активности
быстрых, а не медленных (как в норме) двигательных единиц. Миллер, Саенко и др (2003)
показали, что в ходе иммерсии происходит достоверное снижение электрической активности
от. soleus, а при использовании опорного стимулятора на фоне иммерсии, такого уменьшения
активности не наблюдается.
Иммуногистохимический анализ Са-АТФаза саркоплазматического ретикулума (SERCA) в
группе «Иммерсия». В настоящем исследовании впервые показано, что 7 дней «сухой» иммерсии
привели к перераспределению экспрессии изоформ Са-АТФазы саркоплазматического
ретикулума, а именно к увеличению SERCA I быстрого типа у всех испытуемых группы
«Иммерсия» (рис. 1.3 2). Изменение содержания SERCA медленного типа в волокнах т soleus
человека не было достоверным. Результаты, полученные в настоящем исследовании, полностью
согласуются с данными, полученные в лаборатории S Kandarian (Peters et a l , 1998) в
экспериментах с вывешиванием крыс
Таким образом, устранение опоры, обусловливая
инактивацию медленных мотонейронов спинного мозга, вероятно, приводит к снижению
механической активности медленных волокон т soleus. Накопление Са * в таком разгруженном
мышечном волокне могло повлиять па структуры саркомерного цитоскелета, приводя к снижению
максимальных силовых характеристик и Са-чувствительности миофибрилл.
17
Рт
/ ?2
С оотношение мышечных
волокон содержащих SERCA !. SfcRCA
II типа, а также S E R C A I'll
inria в
т
sotciis )
испытуемых
группы
«Иммермия» (% M-in) *лос10верное
01личие от исходных чначений (/кО,05)
до иммерсии
ISERCAIIrnna
после иммерсии
DSERCAI/il типа
« S E R C A I типа
1.4. Накопление ионов к а л ь ц и я в разгруженном волокне.
Вывешивание крыс в сочетании с в н у т р и б р ю ш и н н ы м введением Э Г Т А
В чксперимептс использовали 20 половозрелых са.мцов крыс линии Wislai
Животные были
разделены на 4 группы но 6 крыс в каждой (и - количество животных в группе) ipyuna X " I «Контропь -» физраствор, ipynna № 2
«Контроть -• Э Г Т А » , группа № 3
«Вывешивание ■*-
физраствор». ipytHid № 4 - «Вывешивание + ЭГТ.Л».
Животные группы Х " I - «Контроль + физраствор». паходи;1ись в клетках в течение 14 дней
каждые 48 часов и ч вн>1рибр10Шинно вводили 0,3 мт физиологического раствора
Животным
1руппы № 2 - «Контроль ^ О Г Т А » каждые 48 часов вводили 0.3 мл раствора "ЭГТА (30 M I Э Г Т А
на 0,3 мл физио 101ИЧССК010 paciBopa) Животные фуппы № 3
«Вывешивание + физраствор» в
течение 14 лнсй находились в положении ан1иортоста1ическо10 вывешивания, каж/1ыс 48 часов
им вну1рибрюшинно вводили 0.3 Ml физиоло1ичсского раствора
Животные ipynubi К» 4
«Вывешивание ' Э Г Т А » также в течение 14 дней находились в положении антиортостатичсскою
вывешивания, но им каждые 48 часов вводили 0,3 мл раствора Э Г Т А (30 M I Э Г Т А на 0,3 мл
физиологического раствора) Забой животных проводили путем гильотинирования, после чет о из
обеих задних конечное!ей крысы выделяли т
soleui
Анализ с о к р а ш т с л ь н ы х свойств одиночных волокон т. soleus к р ы с . Применение стандаргной
.модели антиорюстатического вывешивания крыс приводило к достоверному снижению веса
мышцы и диа.мстра изолированных волокон (табл
1 4)
соответствии
другими
с
результатами,
полученными
ранее
Эти данные находятся в полно.м
авторами
при
использовании
аналогичной экспериментальной модели (Thomason et a l , 1990) В этой экспериментальной серии
нам не удалось обнаружи1ь различий в степени развития гипо1равитационной атрофии т
soleus
между вывеи1енными животными, получавшими и не получавшими кальций-связываюший агент
В нашем более раннем исследовании (Григорьев и др , 2002), выполненным с HCiiOjib30BaHHCM
д р у ю ю хелатора лвухва.1ептных катионов ( Э Д Т А ) , 1акой »ффект был выявлен (хотя и на фоне
глубоких
нарушений
гистологической
структуры
ткани)
Возможно,
такое
расхождение
18
результатов связано с природой применяемого агента, и вопрос требовал последующего
экспериментального
разрешения. В
настоящем исследовании обнаружено достоверное и
значительное снижение максимальных значений абсолютной изометрической силы волокон в
обеих группах вывешенных животных по сравнению с животными виварного контроля. Такое
снижение также было ранее зарегистрировано рядом авторов (McDonald et al., 1995, Stevens et al.,
1998). В TO же время, в группе вывешенных животных, не получавших кальций-связывающий
агент, снижение силы волокон было более глубоким, чем уменьшение их диаметра. При этом,
естественно, удельная максимальная сила в этой группе животных оказывалась достоверно
уменьшенной. Уменьшение удельной силы в аналогичных условиях гравитационной разгрузки
было ранее отмечено в работе McDonald и др. (1995).
Таблица 1.4
Значения диаметра волокон (£)), изометрического напряжения волокон: абсолютной {Рц) и удельной (Р^)
силы, а также показатели кальциевой чувствительности миофибрилл (М±т).
Параметры
D, (мкм)
/'<7.(мН)
РуА, (КН/М^)
рСОтп
pCaso
Котроль+физраствор
(33 волокна)
75,6±1,84
0,46 + 0,01
100,2+3,1
7,02 + 0,05
5,86 + 0,02
Контроль+ЭГТЛ
(40 волокон)
78,5±2,05
0,48 ±0,03
109+4,5
7,00 ±0,03
5,85 + 0,01
•достоверныеотличияот контрольной грутты (р<0,05);
'достоверное отличие от группы «Вывешивание+физраствор»
Вьгаешивание+фгорасгаор
(37 волокон)
60,0+3,10*
0,26±0,03*
90,3±6,8
6,69 + 0,02*
5,67 + 0,02
ВывешиваниеН-ЭГТА
(41 волокно)
62,1+2,75*
0,35+0,04*
105±9,77*
7,10 + 0,05*
6,05 + 0,04'
В условиях реальной и моделируемой микрогравитации, как правило, выявляется снижение
кальциевой чувствительности миофибрипл (Mourner et a l , 1991). Б настоящей работе также
наблюхщлся сдвиг кривой «кальций-сила» у животных, получавших инъекции плацебо на фоне
гравитационной разгрузки, что свидетельствует о снижении чувствительности волоконот.soleus к
ионам кальция (рис. 1.4.1). Известно, что волокна, содержащие быстрые изоформы тяжелых цепей
миозина, обычно демонстрируют более низкую чувствительность к ионам кальция (Stevens et al.,
1998). Поэтому можно вслед за рядом авторов интерпретировать снижение кальциевой
чувствительности, как феномен, сопутствующий общей тенденции к трансформации мышечного
фенотипа в «быструю» сторону в условиях разгрузки (Stevens et al., 2001, Bastide et a l , 2002). Мы
предположили, что повышенная базальная концентрация ионов кальция может быть одним из
стимулов, обусловливающих снижение чувствительности миофибриллярного комплекса к
кальцию в условиях гравитационной разгрузки. Если это предположение верно, то хроническое
воздействие кальций-связывающим агентом, позволит полностью или частично предотвратить
снижение кальциевой чувствительности миофибрилл у вывешенных животных. В настоящем
исследовании пороговые значения рСа для животных, получавших инъекции ЭПГА, оказались
выше (соответственно пороговые концентрации ионов кальция - ниже), чем даже у группы
виварного контроля. При этом кривая «Са-сила» у этих животных оказалась несколько смещенной
влево от кривой группы виварного контроля (хотя значительное смещение наблюдается лишь для
нижней части кривой). Таким образом, в полном соответствии с первоначальной гипотезой,
19
применение кальций-связывающего
кальциевой
разгрузки
чувствительности
агента позволило полностью лредотвратить снижение
миофибриллярного
комплекса
в
условиях
гравитационной
Результаты эксперимента ясно указывают на то, что повышенная базальная
концентрация ионов кальция в мьнпечных волокнах у вывешенных животных может быть одним
из важных элеме1ггов механизмов внутриклеточной сигнализации, обусловливающих развитие
глубоких функциональных изменений сократительного аппарата.
g; 05
Рыс 1.4.1. Зависимости напряжения от
концентрации
кальция
скинированных
единичных волокон т soleus крысы. Кривые
получены
аппроксимацией
данных
уравнением Хилла. Показаны
средние
значения
P/Pgisn. Черная
кривая
объединенная кривая групп № 1 и 2; красная
кривая - группа № 3; голубая кривая - группа
№4.
Иммуногистохимический анализ Са-АТФаза саркоплазматического ретикулума (SERCA). В
настоящем исследовании получены данные, позволяющие ответить на вопрос «Влияет ли
применение кальций-связывающего агента в условиях разгрузки на систему кальциевых каналов
саркоплазматического ретикулума?»
У крыс, подвергнутых вывешиванию с введением физиологического раствора обнаружено
достоверное увеличение (47%) волокон, содержавших быструю изоформу (SERCA I типа) СаАТФазы саркоплазматического ретикулума (рис 1.4.2) При вывешивании животных, получавших
инъекции ЭГТА. содержание волокон, содержавших SERCA 1, составило 29+3%, что достоверно
отличается от показателей группы вывешенных животных, получавших инъекции
физиологического раствора и оказывается даже ниже значений, характерных для животных
контрольной фуппы Таким образом, мы показали, что действие кальций-связывающего агента
позволяет полностью предотвратить увеличение экспрессии быстрой изоформы кальциевой помпы
саркоплазматического ретикулума. Этот результат позволяет высказать предположение о
значимости накопления внутриволоконного кальция при гравитационной разгрузке для изменения
важного звена системы электромеханического сопряжения в мышечных волокнах.
Итак, данные, полученные в настоящем исследовании, свидетельствуют о том, что применение
кальций-связывающего aretrra (ЭГТА) приводит к уменьшению степени снижения максимального
изометрического напряжения отдельных скикн*^ованных волокон .*??. soleus у крыс, подвергнутых
антиортостатическому вывешиванию, полностью предотвращает снижение чувствительности
миофибрилл к кальцию в отдельных скицированных волокнах т. soleus у крыс, подвергнутых
антиортостатическому вывешиванию, а также приводит к предотвращению процессов изменения
экспрессии кальциевых помп саркоплазматического ретикулума.
20
Рис 1.4 2. Соотношение мышечных
волокон, содсржаишх SERCA 1, SERCA
П типа, а также SERCA 1Л1 типа в
т soleus крыс (%, М±т) *достовериое
отличие от исходных значений.
Коитроль+ЭГТА
□ SERCA II
HSERCAI/II
Выавштание+ЭГГА
■SERCAI
Часть I I . Эффекты интервальной тренировки на велоэргометре
В исследовании приняли участие 7 практически здоровых мужчин 23-29 летнего возраста, вес
68,1±3,5 кг. Тренировочные занятия проводили 5 раз в неделю: с понедельника по пятницу в
течение месяца. Они включали разминку, основную часть и «заминку».
Разминка состояла из 3-минутной работы на велоэргометре с мощностью аэробного порога (АэП),
которая составляла 102-157 Вт. Основная часть состояла из непрерывной работы постоянной
мощности или работы переменной мощности. В зависимости от фазы тренировочного цикла
соотношение между тренировочными занятиями с нагрузками постоянной и переменной
мощности менялось. С 1-ой по 4-ую неделю оно сосгавило 2.3, а с 5-й по 9-ю неделю 1.4. Во время
тренировочного занятия с нагрузкой постоянной мощности испытуемые выполняли работу на
велоэргометре с мощностью на уровне ниже порога анаэробного обмена (ПАНО) - 175-210 Вт в
течение 50 минут (лактат на 10-30 мин работы 3-3,5 ммоль/л). Тренировочное занятие с нагрузкой
пеуемепной мощности состояло из чередующихся 2-минутной пиковой нагрузки мощностью
выше MOL- яости ПАНО (218-274 Вт), и 4-минутной нагрузки с мощностью на уровне АэП (102-157
Вт). «Заминка» для обеих групп состояла из 2-минутной работы на велоэргометре с мощностью
АэП (102-157 Вт) и растягивания мышц сгибателей и разгибателей коленного сустава и
разгибателей тазобедренного сустава (отдельно левой и правой ноги) в статическом режиме в
течение 1 мин. Коррекцию мощности тренировочных нагрузок проводили на 2 и 4 неделе.
Пробы мышечной ткани забирали из т. vastus lateralis дважды: до начала эксперимента и через
5 дней после окончания силовой тренировки и проведения всех тестов.
Анализ сократительных свойств одиночных волокон волокон т. vastus lateralis человека.
Тридцатисуточная тренировка на велоэргометре в интервальном режиме привела к достоверному
приросту удельного напряжения одиночных волокон от vastus lateralis на фоне 3%-ного
увеличения диаметра мышечного волокна, и 5%-ого увеличения максимальной силы. Показатели
кальциевой чувствительности (pCamn и рСа») после такой тренировки достоверно увеличились
21
Это повлекло за собой смещение кривой зависимости относительного изометрического напряжения
скинированных волокон от концентрации кальция, выраженной в величине рСа, влево (рис. 2)
Табл. 2
Значения диаметра волокон т vastus lateralis (D), изометрического напряжения волокон- абсолютной (Рц) и
удельной (PyS) Силы, а также показатели кальциевой чувствительности миофибрилл ( М ± т )
Параметры
D, (мкм)
Яо,(мН)
Pyi, (кН/м^)
рСа„„
pCaso
до тренировки
(38 волокон)
после -фенировки
97,23±0,59
100,77+0,50
1,58±0,05
1,65+0,06
203,78±6,12
215,62+5ДЗ*
7,00±0,04
7,11 ±0,05*
5,73+0,07
5,95+0,05*
(46 волокон)
* достоверное отличие от исходного уровня (р<0,05).
100
t
Рис.
2
Зависимости
напряжения от
концентрации
кальция
скинированных
единичных волокон т.
vastus lateralis
человека
Кривые
получены
аппроксимацией данных уравнением Хилла.
Показаны средние значения P/Pgtm. Черная
кривая - до тренировки; красная кривая после тренировки
50-
Аналогичные результаты были получены ранее при исследовании эффектов
силовой
тренировки (Plant et al., 2003) При спринтерской тренировке приросты произвольной силы
достигались преимущественно
за счет
оптимизации
системы центрального
управления
движениями, при этом изменений сократительных характеристик отдельных волокон не было
обнаружено (Harber et al., 2003). В настоящем исследовании интервальная тренировка, часто
используемая в практике подготовки спортсменов самых разных специализаций, оказалась
достаточно эффективной в отношении изменений как удельной силы, так и показателей,
характеризующих сократительные свойства волокна в субмаксимальном диапазоне.
22
1.
2
ВЫВОДЫ:
Уменьшение диаметра, максимального изометрического напряжения, а также показателей
кальциевой чувствительности миофибрилл единичных скинированных волокон т. soleus
является закономерным следствием пребывания в условиях гравитационной разгрузки.
Гравитационная разгрузка приводит к увеличению доли волокон, содержащих быструю
изоформу Са-АТФазы саркоплазматического ретикулума (SERCA I), в т. soleus.
3.
Применение механической стимуляции опорных зон стопы на фоне 7-суточной «сухой»
иммерсии у человека предотвращает снижение силы одиночных мышечных волокон
т. soleus и уменьшение чувствительности миофибрилл к ионам Са^*.
4
Введение кальций-связывающего агента на фоне антиортостатического вывешивания крыс
приводит к уменьшению степени снижения максимального изометрического напряжения
отдельных скинированных волокон т
soleus, а также предотвращает снижение
чувствительности миофибрилл этих волокон к кальцию и изменения экспрессии изоформ
кальциевого насоса саркоплазматического ретикулума
5
Интервальная тренировка на велоэргометрс приводит к увеличению удельного
изометрического напряжения и кальциевой чувствительности миофибрилл в т. vastus
lateralis человека.
1.
Методы и аналитические технологии для анализа механических характеристик скелетных
мышц животных применительно к задачам космической биологии и медицины. // I
Конференция молодых специалистов, аспирантов и студентов, посвященная дню
космонавтики. Тезисы докладов. Москва. - 2002. - С.20.
Методы и аналитические технологии для анализа механических характеристик скелетных
мышц животных применительно к задачам космической биологии и медицины. // 7-ая
международная конференция «Системный анализ и управление космическими комплексами».
Тезисы докладов. Евпатория. - 2002. - C.6I.
Эффекты кальций-связывающего агента в m.soieus крыс на фоне моделируемой
гравитационной разгрузки. // Доклады Академии Наук. - 2002. - Т.284, - С.833-836. (соавт
Григорьев А.И., Шенкман Б.С., Белозерова И.Н., Немировская Т Л . , Матвеева О.А.,
Безымянный А.С.)
Effects of Са^*- binding agents on unloaded rat soleus: muscle тофЬоЬду and sarcomeric titin
content. // J . Grav. Physiol. - 2002. - V.9(l). - P.139-140. (coauthors Shenkman B.S.,
Nemirovskaya T.L., Belozerova I.N., Vikhlyantsev I.M., Matveeva O.A., Podlubnaya Z.A.)
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
2.
3.
4.
5.
6.
Сократительные характеристики отдельных скинированных волокон m.soieus крысы в
условиях гравитационной разгрузки: кальциевые механизмы. // I I Конференция молодьпс
специалистов, аспирантов и студентов, посвященная дню космонавтики. Тезисы докладов.
Москва. - 2003. - С.27. (соавт. Шенкман B.C., Немировская Т. Л.)
Сократительные х^актеристики одиночных скинированных мышечньк волокон крысы при
действии
кальций-связывающего
агента
на
фоне
фавитационяой
разгрузки.
П Международная конференция по физиологии мышц и мышечной деятельности. М Г У
23
им. М В. Ломоносова Тезисы докладов. Москва - 2003. - С 37-38 (соавт Шенкман Б.С.,
Немировская Т. Л.)
7.
Сократительные характеристики одиночных скинированных волокон т . soleus крысы в
условиях гравитационной разгрузки: эффекты кальций-связываюхаего агента. // Биофизика
- 2003, - Т.48. - С.905-910. (соавт Козловская И.Б., Немировская Т.Л., Шенкман Б С )
8.
Effect of artificial support stimulation on soleus single fiber characteristics in men exposed to 7-day
"dry" immersion. // 24* Annual International Gravitational Physiology Meeting Abstracts. Santa
Monica California. - 2003. (coauthors Nemirovskaya T.L., Gasnikova N . M , Kozlovskaya I.B.,
Shenkman B.S.)
9
Effect of Ca^*-binding agent on contractile characteristics of single skinned soleusfibersin hindlimb
suspended rats. // 24* Annual International Gravitational Physiology Meeting Abstracts. Santa
Monica California. - 2003. (coauthors Nemirovskaya T.L., Shenkman B.S.)
10.
Effects of artificial support stimulation on soleus single fiber characteristics in men exposed to 7day dry immersion // J Muscle Res. Cell Motil. - 2003. - V.24. - P.374. (coauthors Nemirovskaya
T.L., Gasnikova N.M., Kozlovskaya I.B., Shenkman B.S.)
11.
Сократительные характеристики волокон и белки саркомерного цитоскелета m soleus
человека в условиях гравитационной разгрузки. Роль опорного стимула. // Биофизика. - 2004
- Т.49. - С 881-890 (соавт. Шенкман Б.С., Подлубная З.А., Вихлянцев И М , Удальцов С Н.,
Немировская Т.Л., Лемешева Ю.С , Мухина A.M., Козловская И.Б.)
12
Effects of artificial support stimulation on fiber and molecular characteristics of soleus muscle in
men exposed to 7-day dry immersion. // J . Grav. Physiol. - 2004. - V.l 1. - P 131-133. (coauthors
Vikhiyantsev I.M., Kozlovskaya 1.В., Podlubnaya Z.A , Shenkman)
13
Afferent and peripheral control of musclefiberproperties during gravitational unloading. // J . Grav,
Physiol. - lOM. - V . l l . - P.111-1I4. (coauthors B.S. Shenkman B.S., Nemirovskaya T.L.,
Podlubnaya Z.A., Vikhiyantsev I.M., Kozlovskaya I.B.)
14.
Эффекты накопления базального кальция миоплазмы в условиях гравитационной разгрузки.
// IV Конференция молодых специалистов, аспирантов и студентов, посвященная дню
космонавтики. Тезисы докладов. Москва. - 2005. - С 28. (соавт. Мухина A.M.)
15.
Креатин как метаболический модулятор свойств мышечных волокон человека в условиях
силовой тренировки // Физиология мышц и мышечной деятельности. Материалы Ш
Всероссийской с международным участием школы-конференции по физиологии мышц и
мышечной деятельности. Москва. - 2005. - С.35. (соавт. Б.С. Шенкман Б.С., Гасникова Н.М.,
Тфакин П.П., Вихлянцев И.М., Подлубная З.А., Немировская Т.Л., Хотченков В.П.,
Стеханова Т.Н., Попов Д.В., Нетреба А.И., Виноградова О.Л.)
16.
Effects of Ca *-biding EGTA on content of sarcomeric cytoskeletal proteins and fiber contractility
in hindlimb suspended rats. // 9* European Symposium on Life Sciences Research in Space.
26 Annual Intemational Gravitational Physiology Meeting. Abstracts. Cologne, Germany. - 2005.
17.
- P. 147. (coauthors Vikhiyantsev I.M., Podlubnaya Z.A., Shenkman B.S.)
Effect of Ca^^-biding agent EGTA on fiber contractility and sarco(endo)plasmatic reticulum CaATPase isoform distribution in hindlimb suspended rats // Basic Appl. Myol. - 2005. - 15 (2).
- P.I03-I04. (coauthors Moukhina A.M., Shenkman B.S.)
24
Исследование поддержано грантами Р Ф Ф И №№ 99-04-48961, 01-04-48617, 02-04-50025, 03-0406691, 03-04-48487, 04-04-49044, 04-04-48617 и Программой фундаментальных исследований
Российской академии наук и Министерства промышленности, науки и технологии РФ.
»227б5
Р Н Б Русский фонд
2006-4
24708
Подписано в печать 15.11.2005.
Формат 84x108/32. Тираж 100 экз. Заказ №1564.
Отпечатано в печатном салоне «Р-Принт»:
125015, г. Москва, ул. Б. Новодмитровская, д. 14, оф. 517
Тел. (095) 730-74-05 доб. 156,257.
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
0
Размер файла
1 302 Кб
Теги
bd000103360
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа