close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

bd000103420

код для вставкиСкачать
На правах рукописи
Ивочкина Ирина Леонидовна
МОРФО-ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ Х А Р А К Т Е Р И С Т И К А МИОКАРДА
ПРИ ДЕЙСТВИИ ПРОИЗВОДНЫХ ЛИДОКАИНА В У С Л О В И Я Х
Э К С П Е Р И М Е Н Т А Л Ь Н О Й ПАТОЛОГИИ
03.00.25 - Гистология, цитология, клеточная биология
14.00.25 - Фармакология, клиническая фармакология
Автореферат
диссертации на соискание ученой степени
кандидата медицинских наук
Саранск, 2005
Работа выполнена на кафедре цитологии, гистологии, эмбриологии с курсом
медицинской биологии ГОУВПО "Мордовский государственный
университет им. Н.П. Огарева.
Научные руководители:
доктор биологических наук,
профессор Кругляков П.П.,
доктор биологических наук,
профессор Балашов В.П.
Официальные оппоненты: доктор медицинских наук,
профессор Ямщиков Н.В.,
доктор медицинских наук,
профессор Балыкова Л.А.
Ведущая организация: Российский государственный медицинский
университет, г. Москва
Защита состоится «/»»
2005 г. на заседании диссертаци­
онного совета Д 21211701 npi^'OVBrid "Мордовский государственный уни­
верситет им. Н.П. Огарева" (430000, г. Саранск, ул. Ульянова, 26а).
С диссертацией можно ознакомится в научной библиотеке ГОУВПО
"Мордовский государственный университет им. Н.П.Огарева" (430000,
г. Саранск, ул. Большевистская, 68).
Автореферат разослан « f ^ >fc^g-<^<44«^2005 г.
Ученый секретарь диссертационного совета,
доктор биологических наук, профессор
П.П. Кругляков
I^y-
, ^o-^Si^fS"
О Б Щ А Я Х А Р А К Т Е Р И С Т И К А РАБОТЫ
Актуальность исследования. Сердечно-сосудистая патология, в том
числе ишемическая болезнь сердца (ИБС), до настоящего времени, остается
ведущей причиной смертности населения стран мира. (Чазов Е.И., 2001; Те­
рещенко С.Н. и соавт., 2005; Аронов Д.М., Лупанов В.Г., 2005). Прогресс в
изучении механизмов реализации ИБС, а также успехи в изыскании новых
методов фармакологической коррекции заболевания в значительной степени
может способствовать снижению фатальности сердечно-сосудистых заболе­
ваний.
Работы в данном направлении не могут бьггь эффективными без широ­
ких эксп^>иментальных исследований. В частности, важным является тести­
рование безопасности лекарственных средств, обладаюпдах противоаритмической активностью, при длительном введении животным, находящимся в
условиях хронического иммобилизационного стресса (Балашов В.П. и соавт.,
2002). Ак1уальность этого важного направления, находящегося на стыке ин­
тересов морфологии и фармакологии, вытекает, с одной стороны, из резуль­
татов многоцентровых зарубежных исследований (Coplen S.E., et al., 1990;
Echt D.S.et al., 1991; Flacer G.C., et. al., 1992; CAST II, 1992; Teo K.K.et. al.,
1993; Caims J.A., et al., 1995), a, с другой стороны, определяется важными корелляциями, обнаруженными в наших ранних работах (Шеворакова Т.И.,
2000; Бирлюкова Д.В., 2002; ЕрмолаеваТ.В., 2002; Шувалова Е.Н., 2003).
Основанием для проведения аналогий между токсичностью препаратов
в клинических условиях и в эксперименте является хорошо известный фа1гг
общности ведущих патогенетических звеньев стрессорного и ишемического
повреждения миокарда (Меерсон Ф.З., 1984, 1993). Используя данный метод
исследования потенциальных противоаригмических средств можно с боль­
шей долей уверенности прогнозировать безопасность лекарственных средств
в клинике, в том числе, их способность повышать смертность кардиологиче­
ских больных.
Однако исследования потенциальных противоаритмических средств,
еще не прошедших фазу клинических испытаний, ранее не проводились.
Следовательно, возможности использования указанной методики для про­
спективной оценки безопасности на сегодня не изучены. В этом плане наше
внимание привлекли производные лидокаина, модификация структуры кото­
рых была достигнута либо изменением анионной части молекулы (ЛХТ-300), либо кватернизацией атома азота, путем присоединения аллилморфолинового радикала (ЛХТ-12-02).
Интерес к указанным соединениям определяется их несомненной пер­
спективностью как источников создания новых высокоэффективных и безо­
пасных лекарственных средств. По данным литературы по своей фармаколо­
гической активности они существенно превосходят структурный предшест­
венник - лидокаин, а протнвоаригмическая активность соединения ЛХТ-1202 сравнима с активностью кватернидин^ УУСТ!5,Ри'Жу'^^?; Блинов Д.С. и
БИБЛИОТЕКА
)
спстчлу^ адЛ
др., 2004; Сернов Л.Н. и др., 2005). Однако оценка безопасности ЛХТ-3-00 и
ЛХТ-12-02, в том числе изучение особенностей влияния этих веществ на
ультраструкгуру миокарда животных, подвергнутых 2 5 % иммобилизационному стрессу, ранее не проводилась и представляется весьма актуальной.
Цель исследования - изучение структурных изменений миокарда, раз­
вивающихся при хроническом стрессе и протекции производными лидокаина
ЛХТ-3-00 и ЛХТ-12-02.
Представленная работа выполнялась в соответствии с научной темой кур­
са медицинской биологии Мордовского государственного университета "Фар­
макологическая коррекция стрессорных и ишемических повреждений органов и
систем организма". Номер государственной регистрации 01200104129.
В соответствии с целью, выполнение настоящей работы предполагало
рещение следующих задач:
1. Изучение острой токсичности производных лидокаина при различных
путях введения;
2. Оценка фармакотоксикологических свойств производных лидокаина и
изменений ультраструктуры миоифда при длительном введении мышам в ус­
ловиях хронического стресса;
3. Исследование влияния тестируемых соединений на пгфаметры цен­
тральной и системной гемодинамики.
Научная новизна. Впервые выполнено фармакотоксикологическое ис­
следование двух оригинальных производных лидокаина. Установлена их острая
токсичность при различных путях введения. Приоршстными являются Данные
о влиянии третичного и четвертичного дериватов лидокаина (ЛХТ-3-00 и ЛХТ12-02 соответственно) на динамику летальности мышей, подвергнутых хрони­
ческому иммобилизационному стрессу, а также сведения об изменении массы
тела животных и относ»ггельной массы сердца и других внутренних органов.
Впервые показано отсутствие негапгивного влияния изучаемых соедине­
ний на ультраструктуру кардиомиоцитов и эндотелиоцитов кровеносных сосу­
дов миокарда в условиях иммобилизационного стресса. Впервые показана гемодинамическая безопасность ЛХТ-3-00 и ЛХТ-12-02. Выявлено отсутствие у
соединений отрицательного хронотропного, дромотропного и инотропного эф­
фектов.
Практическая ценность работы. В результате комплексного морфоло­
гического и фармакологического исследования получены результаты, свиде­
тельствующие о достаточной безопасности производных лидокаина ЛХТ-3-00 и
ЛХТ-12-02, что в совокупности с ранее полученными данными об их высокой
противо^итмической активности, делает эти вещества перспективными в каче­
стве потенциальных лекарственных средств. Материалы, представленные в ра­
боте подтверждают правомочность использования модели хронического стрес­
са для доклинической оценки безопасности лекарственных средств. Результаты
диссертационного исследования ЛХТ-3-00 и ЛХТ-12-02 внедрены в научноисследовательскую работу кафедры гистологии и курса медицинской биологии
Г О У В П О "Мордовский государственный универс(ггет".
Апробация работы. Результаты исследований, представленные в дис­
сертации, докладывались на Огаревских чтениях - научной конференции моло­
дых ученых Мордовского госуниверскгета (Саранск, 2003-2005); 59-ой регио­
нальной конференции по фармации и фармакологии (Пятигорск, 2004); Всерос­
сийском конгрессе «Человек и лекгцктво» (Москва, 2004 - 2005); 2-Й Всерос­
сийской научной конференции «Актуальные вопросы здоровья и среды обита­
ния современного человека» (Ульяновск, 2005); Всероссийской №^нопрактической конференции «Общество, здоровье, лекарство» (Саранск, 2005).
По теме диссертации опубликовано 5 работ.
Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора
литера1уры, описания материалов и методов исследования, четырех глав с ре­
зультатами собственных исследований, заключения и выводов. Работа изложе­
на на 118 страницах набранных в Microsoft Word, иллюстрирована 27 рисунка­
ми и 17 таблицами. Библиографический список содержкг 157 работ отечест­
венных (92) и зарубежных (65) авторов.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Исследованию были подвергнуты, два производных лидокаина, синтези­
рованные во всероссийском научном ценгре биологически-акгивных веществ
(Старая Купавна, Московская область):
Диэтиламино-2,6-диметилацетанилид глутамината (лабораторный шифр
ЛХТ-З-ОО);
а-^-аллил-М'М0рфолинил-2,б-диметилаиетанилида бромид (лаборатор­
ный шифр ЛХТ-12-02).
В работе использовали химически чистые субстанции. В качестве препа­
ратов сравнения выступали лидокаина гидрохлорид и кватернидин. Применяли
официнальные жидкие лекарственные формы, соответственно в виде 2% рас­
твора в ампулах по 2 мл и 0 4 % раств^» в ампулах по 5 мл.
Исследования выполнены на 743 нелинейных белых мышах (18-23 г) и
104 беспородных домашних кошках (2 - 3,5 кг). Все болезненные процедуры, в
обязательном порядке, проводили под общей анестезией. В качестве средства
хшя наркоза использовали тиопентал натрий (50 мг/кг, внутрибрюшинно).
Острую токсичность производных лидокаина оценивали на беспо­
родных белых мышах (массой 18-20 г) при внутрибрюшинном и пероральном путях введениях. Показатель острой токсичности (LDso) вычисляли гра­
фически по методу Миллера и Тейнтера (Беленький М.Л., 1%3). В опытах на
кошках (Арзамасцев Б.В. и соавт., 2000) титровали (внутривенно) смертель­
ную дозу испытуемых веществ (LDioo).
Оценку фармакотоксикологических свойств соединений при хро­
ническом стрессе проводили с помощью метода предложенного Балашовым
В.П. и соавт. (2002). Пролонгированный иммобилизационный стресс (по 6
часов на протяжении 1,5 месяцев) воспроизводили по методу Hecht А. et а1.
(1971) в модификации Коломейцевой И.А. (1988). Исследуемые соединения и
препараты сравнения вводили внутрибрюшинно, ежедневно в объеме изото­
нического раствора хлорида натрия, не превышающего 0,1 мл. Через 6 недель
после начала эксперимента животных взвешивали, забивали декапитацией
под эфирным наркозом, проводили визуальный осмотр внутренних органов и
отсекали печень, почки, селезенку, сердце, легкие. О токсическом эффекте
соединений судили по показателю смертности животных и величине относи­
тельной массы органов.
Для электронно-микроскопического исследования брали фрагменты
стенки левого желудочка сердца мышей. Кусочки ткани фиксировали в смеси
глутарового альдегида и параформа на 0,1 М фосфатном буфере (рН 7,2) в
течение 4-12 часов при 4° С. После промывания в 0,15 М фосфатном буфере
(рН 7,2) (пять смен по 30 минут при 4° С) проводили постфиксацию в 2 %
растворе осмиевой кислоты в течение 3 часов при 4° С.
Для обезвоживания кусочки постепенно проводили через батарею
спиртов возрастающей концентрации до абсолютного этанола (50°, 70", 96°,
-1 смена по 30 минут при 4° С и 100° - 3 смены по 30 минут при 18°С). Затем
применяли 2 смены окиси пропилена при 18°С. Перед заливкой проводили
пропитку материала в смеси эпоксидных смол с окисью пропилена в соотно­
шении 1:1. Затем кусочки помещали в чистую заливочную смесь на 30 минут
при 60°С. Заливку материала осуществляли в смесь эпоксидных смол ЭПОНАРАЛДИТ (Mollenchauer Н., 1964) с последующей полимеризацией в течение
2-х суток при 60°С. Ультратонкие срезы (50-80 им) получали на микротоме U1tracut, монтировали их на сетки и бленды и контрастировали уранилацегатом (5%
раствор в метиловом спирте) и цитратом свинца (Reynolds E.S., 1963, Venable
J . , Coggeshal R., 1965). Препараты изучали в элеюронный микроскоп ЭМ-125
при ускоряющем напряжении 75 кВ.
Исследование параметров системной гемодинамики у кошек проводили
методом элекгромагнитной флуориметрии с помощью отечественного расхо­
домера крови РКЭ-2. Подопытных животных переводили на искусственное
дыхание, проводили торакотомию в 4-ом межреберье справа и накладывали
электромагнитный датчик (Сб или С?) на восходящую часть дуги аорты. За­
пись кривой ударного выброса производили на ЭЛКАР-6 до введения препа­
ратов (исходные показатели контроля) и на протяжении последующих 15
мин. Артериальное давление (АД) определяли прямым способом при помощи
манометра Людвига в сонной артерии. Другие параметры системной гемоди­
намики: минутный объем кровообращения (МОК) общее периферическое со­
противление сосудов (ОПСС), сердечный индекс (СИ), работу левого желу­
дочка (РЛЖ) определяли с помощью известных расчетных формул (Селезнев
С.А. и соавт., 1976). Внутрижелудочковое давление и его первую производ­
ную (dP/dT) регистрировали при помощи датчиков давления "Бентли" (Вели­
кобритания) на самописце фирмы "Уго Базиль" (Италия). С целью воспроиз­
ведения острой ишемии миокарда, перевязывали нисходящую ветвь левой
коронарной артерии через 5 минут после регистрации исходных параметров.
Статистическую обработку результатов исследования проводили мето­
дами "х " и t-критерия Стьюдента при 5% уровне значимости (Беленький
М.Л., 1963; Закс Л., 1976). В работе использовали персональный компьютер
Pentium - 200 ММХ.
Р Е З У Л Ь Т А Т Ы ИССЛЕДОВАНИЯ И И Х ОБСУЖДЕНИЕ
Исследование острой токсичности
Для оценки диапазона испытуемых доз провели исследование острой
токсичности соединений. Сведения о величине показателя LDso для ЛХТ3.00, ЛХТ-12.02 и препаратов сравнения приведены в таблице 1. Для уста­
новления относительной токсичности производных лидокаина, LDso их
структурного предшественника (лидокаина гидрохлорида), при соответст­
вующих путях введения, была принята за единицу.
При внутрибрюшинном введении острая токсичность лидокаина гид­
рохлорида была невысока и составила 200±15 мг/кг. Модификация структу­
ры молекулы путем замены гидрохлорнд-аниона на глутаминовую кислоту
(ЛХТ-3-00) сопровождалось некоторым повышением острой токсичности со­
единения.
Таблица 1.
Острая токсичность
№
п/п
1
2.
3
4
производных лидокаина и препаратов сравнения
при различных путях введения б е л ы м м ы ш а м
Источник данных
Вещество
Кол-во
LDjo. мг/кг
Коэффициент
(доверительные
относительной
животных
границы)
токсичности
Лидокаин
ЛХТ-3-00
Кватернидян
ЛХТ-12-02
Внутрибрюшинное введение
200*15 (173-f^227)
1,00
80
166±14 (140<-192) •
0,83
110
54±4(46+«2)*
0Д7
80
82±5 (76*94) *
0,41
100
Костин Я.В.,
Собственные
Костин Я . В ,
Собственные
Лидокаин
ЛХТ-3-00
Кватериидин
ЛХТ-12-02
80
60
60
60
1,0
1,07
1,51
2,12
Костин Я . В ,
Собственные
Костин Я . В ,
СоСютвенные
Примечания:
р<0,05.
Пероральное введение
297±14 (271-324)
320±20 (301+354)
450±26 (400^-500) *
630±26 (578+689)*
отличия при сравнении с лидокаином достоверны при
Значение LO^ для кватернидина составляет 54±4 мг/кг, что более чем в
три раза меньше соответствующего показателя для лидокаина. Острая ток­
сичность ЛХТ-12-02 так же превышает острую токсичность лидокаина при
внутрибрюшинном введении. Обращает на себя внимание тот факт, что пока­
затели LDso для ЛХТ-12-02 и кватернидина, достоверно различаются. Следо­
вательно, однонаправленная химическая модификация лидокаина приводит к
получению соединений, токсичность которых при внутрибрюшинном введе­
нии мышам меньше, чем в случае с тримекаиновыми дериватами.
Далее водные растворы тестируемых веществ вводили бодрствующим
белым мышам в желудок с помощью специального зонда в объеме не более
0,2 мл в нарастающих концентрациях. Результаты наблюдений учитывали
спустя 72 часа после введения.
При пероральном введении острая токсичность третичного производ­
ного лидокаина (ЛХТ-3-00), при сравнении со своим структурным предшест­
венником, имела тенденцию к снижению, тогда как токсичность четвертич­
ного производного (ЛХТ-12-02) бьша статистически ниже, чем у лидокаина.
Анализ полученных данных свидетельствует о низкой биодоступности чет­
вертичных производных местных анестетиков при их пероральном введении.
Очевидно, что наиболее выраженные фгфмакологические свойства у препа­
ратов данной группы следует ожидать при парентеральных путях введения.
На следующем этапе исследования производные лидокаина вводили
наркотизированным кошкам внутривенно в виде водного раствора под кон­
тролем ЭКГ со скоростью 1 мг/кг/мин до остановки сердечной деятельности
(табл.2).
Полученные нами данные свидетельствуют о сохранении закономерно­
стей динамики показателей токсичности производных лидокаина, выявлен­
ных при испытании на мышах, и при их внутривенном введении кошкам. И
третичный дериват - JTXT-3-00 - и четвертичное производное - ЛХТ-12-02
при введении кошкам в вену оказались более токсичны, чем их структурный
предшественник. Кроме того, четвертичное соединение было более токсич­
ным, чем третичное производное.
Таблица 2.
Острая токсичность производных лидокаина при внутривенном введении
кошкам
№
п/п
1.
2.
J,
Препарат,
лабораторный шифр
соединения
Лидокаин
ЛХТ-3-00
ЛХТ-12-02
5
5
4
Скорость
введения
мг/кг/ыин
1,0
1.0
1,0
LDioo, мг/кг
(М±т)
12&ь7
115±6
901:4*
Коэффициент отно­
сительной токсич­
ности
1,0
0.89
0.70
Примечание: * - различия при сравнении с лидокаином достоверны при
р<0,05
Таким образом, токсические свойства производных лидокаина при
внутрибрюшинном, внутривенном и оральном введении при сопоставлении
со структурным предшественником - лидокаином меняются однонаправлено.
Учитывая, что на этапе доклинических исследований, потенциальные противоаритмические препараты тестируют в дозах, составляющих 2,5-3% от их
LD50 при внутрибрюшинном введении белым мышам, мы определили дозы
ЛХТ-3-00 и ЛХТ-12-02, оптимальные для выполнения последующих разде-
лов работы. Эти дозы соответственно составили 4,1 мг/кг - для третичного
деривата и 2,0 мг/кг для четвертичного производного лидокаина.
Фармакотоксикологические свойства производных лидокаина
в условиях хронического стресса
Для адекватной оценки неблагоприятных эффеетов лекарственных
средств, обнаруженных клиницистами ( C A S T 1,1989; C A S T I I , 1993; Тео К.К. et
а!., 1993; McAlister, Тео К.К., 1997) использовали модель 25%-ного иммобилизационного стресса по И.А. Коломейцевой (1988). Обоснование адекватности
исследования фармакотоксикологических свойств ангиаритмических средств с
использованием данного подхода было представлено В.П. Балашовым и соавт.
(2002) и апробировано в диссертационном исследовании Е.Н. Шуваловой
(2003).
Для того чтобы иметь возможность однозначно интерпретировать резуль­
таты фармакотоксикологических исследований, полученных на модели хрони­
ческого иммобилизационного стресса, нам представлялось целесообразным
вначале оценить влияние длительного внутрибрюшинного введения ЛХТ-3-00,
ЛХТ-12-02 и препаратов сравнения на летальность мышей, находящихся в ус­
ловиях стандартной двигательной активности. С этой целью вещества вводили
перитонеально, б раз в неделю, однократно, в объеме 0,1 мл на инъекцию в те­
чение 1 месяца. Все растворы и инструментарий подвергали обязательной сте­
рилизации. Результаты экспфиментов приведены в таблице 3.
Таблица 3.
Влияние производных лидокаина и препаратов сравнения на смертность
интактных животных
Вещество, мг/кг
Количество животных:
в опыте
погибших
(%)
Контроль № 1
Лидокаин 10,0
ЛХТ-ЗЧЮ 4,1
Кватернидин 2,0
ЛХТ-12-02 2,0
20
40
40
40
40
0
1
0
0
0
0
2,5
0
0
0
В контрольной серии опытов 40 животным вводили стерильный изотони­
ческий раствор хлорида натрия. Было показано, что плацебо не провоцировало
летальность подопытнък животных на протяжении 1 месяца наблюдения. Та­
ким образом, популяция мышей, особи которой включены в эксперимент, явля­
ется относительно здоровой. В ней не наблюдается летальности по возрастным
или инфекционным причинам. Травматизация при внутрибрюшинном введении
иглы также не является фатальной и сама по себе не может служить причиной
гибели животных в массовом порядке.
10
Внутрибрюшинное введение исследуемых соединений и препаратов
сравнения мышам, находящимся в условиях стандартного двигательного режи­
ма не сопровождалось приростом их летальности по сравнению с контрольной
серией (табл. 3). Один случай гибели животного был отмечен на фоне длитель­
ного введения лидокаина. В связи с этим летальность в данной эксперимен­
тальной серии составила 2,5%, что по сравнению с контролем было статистиче­
ски не значимо (р>0,05).
На следующем этапе работы (табл. 4), для индукщ1и повреждения сер­
дечной мышцы, подопытных животных в течение 1 месяца подвергали регу­
лярному шестичасовому иммобилизационному стрессу. Тестируемы соедине­
ния, и преп^аты сравнения вводили мышам внугрибрюшинно, в дозах, в кото­
рых они были тестированы на интактных животных.
Таблица 4.
Влияние производных лидокаина и препаратов сравнения на летальность
мышей в условиях длительного иммобилизационного стресса
Вещество, мг/кг
Количество животных:
погибших
в опыте
(%)
Контроль № 2
Лидокаин 10,0
ЛХТ-3-00 4,1
Кватернидин 2,0
ЛХТ-12-02 2,0
38
40
30
40
40
12
21
И
16
»7
31,6
52,5*
36,6
40
42.5
Примечание: * - различия при сравнении с контролем достоверны при
р<0,05 (по критерию х).
В контрольной серии опытов № 2 иммобилизация животных сопровож­
далась фоновой смертностью. На фоне внутрибрюшинного введения плацебо
(0,9% стерильный раствор хлорида натрия) из 38 подопытных животных погиб­
ло 12 (31,6%). Летальные исходы отмечались с 8-х по 14-е сутки наблюдения и,
обычно, происходили непосредственно во время иммобилизации. Необходимо
отгметить, что полученные результаты сопоставимы с данными других авторов
(Шеворакова Т.И., 2000; Бирлюкова Д.В., 2002; Ермолаева Т.В., 2002; Шувало­
ва Е.Н., 2003). Величина летальности в контрольной серии опытов (примерно
1/3 животных) является приемлемой для тестирования исследуемых соедине­
ний. Она позволяет достаточно надежно зарегистрировать и подтвердить стати­
стическими расчетами как возможный протекторный, так и вероятный "летальногенный" эффекты веществ.
При введении лидокаина процент летальности мышей в условиях стресса
возрос до 52,5% (р<0,05). Начало гибели животных отмечали на 11 сутки, а ее
пик был зарегистрирован на 30 день (7 мышей). В дальнейшем летальные исхо­
ды продолжались регулярно до конца периода наблюдения, в среднем состав­
ляя примерно 1 животное в 5 дней.
11
Летальность на фоне введения третичного производного лидокаина ЛХТ3-00 (36,6%) была сопоставима с аналогичным показателем в контрольной
фуппе животных (31,6%). Полученные результаты позволяют предположить
относительную безопасность ЛХТ-3-00 при его длительном применении.
ЛХТ-12-02 вызывал гибель несколько большего количества животных
(42,5%), что, однако, статистически было также не достоверно относительно
контрольной серии опытов (р>0,05). Отличия в динамике смертности проявля­
лись более ранним началом летальных исходов, которые мы наблюдали с 1-х
суток опыта, и более поздним их окончанием (22 сутки).
Полученные нами результаты свидетельствуют о том, что в условиях
длительного иммобилизационного стресса как четвертичное аммониевое про­
изводное лидокаина, так и его третичный дериват, содержащий в качестве
аниона глутаминовую кислоту, оказываются достаточно безопасными соедине­
ниями. Анализируя динамику летальности животных, следует подчеркнуть, что
если в контроле и при введении ЛХТ-3-00 максимальный процент легальных
исходов приходится на 7-14 сутки, то для ЛХТ-12-02 кривая растянута почти по
всему графшдг.
Поскольку хронический стресс оказывает влияние на многие физиологи­
ческие параметры организма человека и животных, в том числе на массу тела
(Кузнецов В.И., 1974; Панферова Н.Е., 1977; Меерсон Ф.З., 1981, 1984), мы
провели измерение этого показателя у "стрессированных" животных в динами­
ке. Анализ динамики массы тела мышей представлен в табл. S.
Таблица S.
Влияние производных лидокаина на массу тела мышей (г) при
хроническом иммобилизационном стрессе
Соединение
7сутки
14 сутки
21 сутки 28 сутки
Исход
(доза, мг/кг)
Контроль
22,8±0,8
20,9±0,6* 20,6±0,6* 20,7±0,5* 21,5±0,4
ЛХТ-З-ОО (4,1)
21,7±0,4 20,5±0,3» 20,1±0,3* 20,4±0,4* 22,3±0,5
21,9±0,6 20,1±0,5» 18,8±0,2*'» 20Д±0,4* 21,6±0,4
ЛХТ-12-02 (2,0)
Примечание: * - различия при сравнении с исходными значениями дос­
товерны при р<0,05; * - различия с соответствующим показателем в контроле
достоверны при р<0,05
В контрольной серии опытов отмечено постепенное снижение массы тела
на 7-21 сутки опыта. К концу периода наблюдения вес мышей увеличивался и
на 28-е сутки он не отличался от исходных значений. Вероятно, такая динамика
массы тела животных является отражением стадийности стресс-реакции и сви­
детельствует о ее повреждающем характере, по крайней мере, в первые 3 неде­
ли эксперимента.
В группе животных, получавших третичное производное лидокаина ЛХТ3-00 в дозе 4,1 мг/кг внутрибрюшинно, динамика массы тела была тождествен­
ной изменениям веса мышей в контроле. К концу четвертой недели наблюдения
12
вес животных даже проявлял тенденцию к увеличению по сравнению с исход­
ными п^аметрами. Наиболее значительная потеря массы тела у животных от­
мечена в группе ЛХТ-12-02 на 14-е сутки наблюдения - до 18,8±0Д. В то же
время на 28 неделе опыта средний вес животных, получавших четвертичное
производное лидокаина, вернулся к исходным величинам.
Необходимо подчеркнуть, что максимальное снижение массы тела, про­
исходящее на 14-21 сутках эксперимента, совпадает с пиком смертности ж и ­
вотных. Кроме того, мы установили, что ЛХТ-12-02 нарушает ад^тгацию ж и ­
вотных к стрессу, тогда как негативный эффею' от применения третичного про­
изводного лидокаина - ЛХТ-3-00 - был выражен в меньшей степени.
Известно, что хронический стресс оказывает влияние не только на массу
тела животных, но и на коэффициент массы органов (Кузнецов В.И., 1974;
Панферова Н.Е., 1977). Авторы также указывают на снижение массы тепа и
снижение массы сердца в условиях длительной полной иммобилизации, причем
уменьшение массы тела происходит более интенсивно, что является причиной
относительной гипертрофии миокарда.
Другие исследователи (Тигранян Р.А., 1985) показывают увеличение аб­
солютной и относительной массы сердца в условиях длительной неполной ги­
подинамии. Следовательно, изучение абсолютной и относительной массы орга­
нов является важным разделом работы, так как данные показатели закономерно
отражают уровень стресс-опосредованного повреждения органов животных и
могут явиться надежным критерием токсичности или безопасности тестируе­
мых производных лидокаина (табл.б.).
Полученные данные свидетельствуют о том, что абсолютная и относи­
тельная массы печени, почек и селезенки под действием стресса не изменяется.
Абсолютная и относительная массы сердца к 28-м суткам стресса, также как и
относительная масса легких, статистически достоверно увеличиваются по срав­
нению с иитактными животными.
Таблица 6.
Влияние производных лидокаина на абсолютную и относительную
массы органов мышей при длительном стрессе
Орган
Печень
Легкие
Сердце
Почки
Селезенка
Показатель
веса органа
абсолютный
относшельный
абсолютный
относительный
абсолютный
относительный
абсолютный
относительный
абсолютный
относительный
Интактные
Ul±0,044
5.69±0,330
0,19±0,015
0,90*0,081
0.13±0,016
0,61±0,081
0,27±0,022
l,2i0,09
0,13±0,017
0,62±0,072
Условия эксперимента
Контроль
ЛХТ-3-00,4,1
1,12±0,041
1,16*0,015
5,62±0,013
5,70*0,238
0,18±0.020
0,15*0,030
0,92±0,101
0,75*0.014
0Д0±0,0И*
0,17*0,088
1,01±0,067*
0,84*0,011*
0,23±0,015
0,26*0,030
1,18±0,063
1,32*0,039
0,10±0,005
0,11*0,010
0,51±0,022
0,54*0,015
ЛХТ-12-02,2,0
1,15*0,019
5,35*0,015
0,16*0.017
0,73*0,038
0,18*0,012
0,84*0,025*
0,27*0,030
1Д7*0,037
0,11*0,010
0,52*0,019
Примечание: * - различия достоверны при сравнении с группой интакгных животных при р<0,05
13
Исследуемые соединения не оказывают влияния на относительную и
абсолютную массы легких, печени, почек, селезенки. Что касается сердца, то
нами установлено, что оба производных лидокаина препятствуют стрессопосредованному увеличению абсолютной массы сердца. На фоне длитель­
ного введения обоих соединений сохраняется лишь относительная гипертро­
фия миок^да, причем выраженная в значительно меньшей степени, чем в
контрольной серии опытов.
Таким образом, представленные данные позволили убедиться в адек­
ватности выбранных дозировок ЛХТ-3-00 и ЛХТ-12-02. В дозах составляю­
щих 2,5% от соответствующих LDso, третичный и четвертичный дериват ли­
докаина не повышали смертность животных в условиях стресса оказывали
минимальное негативное действие на динамику массы тела не усугубляли
стресс-опосредованного негативного изменения коэффициентов масс внут­
ренних органов мышей. Анализируя полученные данные о динамике массы
сердца в условиях стресса, считаем возможным отметить особую важность
этого критерия при оценке безопасности и стресс-протекторной активности
дериватов лидокаина, обладающих противоаркгмической активностью.
Влияние производных лидокаина на ультраструктуру миокарда мышей
в условиях стресса
В предварительных экспериментах мы обнаружили, что в сравнении с
миокардом интактных мышей, ультраструкгура кардиомиоцитов животных,
подвергнутых длительной иммобилизации, претерпевала характерные изме­
нения, согласующиеся с представленными в литературе (Меерсон Ф.3.,1981,
1984; Непомнящих Л.М. и др., 1989; Подсеваткии В.Г., 1996). Наиболее яр­
ким проявлением стресса на ультраструктурном уровне явилось образование
многочисленных зон интерстициального и внутриклеточного отека. Внутри­
клеточный отек сопровождался изменением электронной плотности цитоплазматического матрикса. Также в этой зоне отсутствовали миофибриллы,
элементы саркоплазматического ретикулума и митохондрии. В зоне интер­
стициального отека уменьшалось количество коллагеновых и эластических
волокон, отсутствовали клеточные компоненты соединительной ткани
В миокарде животных группы контроля наблюдали повреждение со­
кратительных элементов. Весьма часто имели место контрактуры, прояв­
ляющиеся в уплотнении Z-зон, а также уменьшение величины изотропных
участков саркомеров миофибрилл. Кроме того, выявлялись участки сарко­
плазмы, в которых находились миофибриллы в состоянии разволокнения.
При этом утрачивалась связь актиновых и миозиновых миофиламентов, что,
видимо, обусловлено разрушением контактных участков глобулярных голо­
вок миозина. Заметные изменения претерпевал и энергетический аппарат
клеток. Форма органелл обычно не изменялась. Митохондрии выглядели
круглыми, овальными или вытянутыми, но их матрикс был конденсирован­
ным. В некоторых митохондриях кристы фрагментировались. В зоне дест-
14
рукции крист обнаруживались точечные зоны просветления. Весьма харак­
терным было набухание элементов саркоплазматического ретикулума.
Особенностью миокарда мышей подвергнутых иммобилизационному
стрессу является образование множественных инвагинаций ядерной оболоч­
ки, а также значительное преобладание гетерохроматина, располагающегося
в виде массивных осмиофильных скоплений в нуклеоплазме. Преобладание
гетерохроматина свидетельствует, видимо, о снижении синтетической актив­
ности клетки, а появление многочисленных складок и инвагинаций ядерной
оболочки свидетельствует о формировании адаптационно-компенсаторных
реакций путем образования дополнительной поверхности ядерной оболочки,
а, следовательно, повышении возможностей ядерно-цитоплазматических
взаимоотношений для реализации наследственной информации. Негативные
изменения отмечались и со стороны эндотелиоцитов кровеносных капилля­
ров. Их цитоплазма часто выглядела либо уплотненной, либо истонченной.
Уплотнение происходило, видимо, за счет повышения коллоидных свойств
цитоплазматического мапгрикса, тогда как истончение является обычным фи­
зиологическим явлением для капилляров. Несомненно, уплотнение цитозоля
эндотелиоцитов и повышение его элеюронной плотности сопровождается
ухудшением обменных процессов, на это также указывало малое содержание
пиноцитозных пузырьков в цитоплазме этих клеток. Кроме того, нередко на­
блюдался отек эндотелиоцитов, сопровожоаюшийся значительным просвет­
лением цитоплазматического матрикса, уменьшением содержания цитоплазматических органелл. Уменьшался просвет таких капилляров, что также сви­
детельствует о снижении гисто-гематических обменных процессов. Форма
других эндотелиоцитов имела складчатый xapairrep, вследствие изменения
гемодинамических условий циркуляции, а также механического воздействия
избытка тканевой жидкости в периваскулярной зоне, возникающего при интерстициальном отеке.
Исследуемые производные лидокаина не вносили существенного изме­
нения в карпгину стресс-опосредованного повреждения ультраструктуры мио­
карда мышей. Основные изменения со стороны мембранных органелл, сокра­
тительных элементов и ядерного аппарата клеток сохранялись и при протек­
ции ЛХТ-3-00 или ЛХТ-12-02. О количественной характеристике разницы в
степени отека и других ультраструктурных изменений, наблюдаемых в кон­
троле и при действии тестируемых соединений судить трудно. С одной сто­
роны мы не проводили морфометрических исследований, а с другой стороны
в них и не было особой необходимости, поскольку морфологическая кгфтина
изменялась незначительно.
Тем не менее, следует отметить, что на фоне введения ЛХТ-3-00 и ЛХТ12-02 митохондрии выглядели менее поврежденными, митохонфиальные кристы сохраняли свое типичное строение, однако матрикс был повышенной осмиофильности, что может свидетельствовать о развитии компенсаторных про­
цессов с целью поддержания энергопродукции в присутствии производных ли­
докаина на достаточно высоком уровне. Кроме того, намного реже отмечались
15
участки ингерстициального и внутриклеточного отека. Площадь последнего в
поле зрения микроскопа была несколько меньше, чем в контроле. Следует от­
метить значительное снижение морфологических изменений со стороны микроциркуляторного русла. Реже обнаруживался отек и возникновение складчато­
сти эндотелиоцитов, а также отек периваскулярной зоны, что сопровождалось
сближением капилляров и плазмалеммы кардиомиоц1пх)в. Несомненно обмен­
ные процессы при таких взаимоотношениях значительно возрастали, что, ви­
димо, оказывало положительный эффект на морфо-функциональное состояние
кардиомиоцкгов и, возможно, снижало последствия стрессорных повреждений.
Наиболее
важным
заключением
по
итогам
электронномикроскопического исследования миокарда животных, получавших ЛХТ-3-00 и
ЛХТ-12-02, следует признать то, что производные лидокаина не усиливали деструетивное действие стресса. Совокупность наблюдаемых ультраструк1урных
изменений на фоне их применения ни в коей мере нельзя признать как синнергичные действию стресса. Следовательно, можно предположить, что в дозах со­
ставляющих 2,5% от соответствующих LD50 оба соединения не обладают кардиотоксическими свойствами и можно предполагать их достаточно высокую
безопасность как потенциальных противоаритмических средств.
Оценка влияния пртаводных лидокаина на системную гемодинамику
Важным аспектом оценки безопасности противоаритмических средств
является изучение их гемодинамической безопасности. Влияние сердечно­
сосудистых средств на хроно-, дромо-, батмо- и инотропную функцию сер­
дечной мышцы, а также - на тонус резистивных сосудов является важней­
шим аспектом их исследования. При этом важно учитывать, что в силу мето­
дических особенностей, гемодинамические эффекты соединений оценивают­
ся только в остром эксперименте. Поэтому, в отличие от хронического экс­
перимента, вещества не способны проявлять физическую или физиологиче­
скую кумуляцию. В связи с этим, при проведении настоящего раздела рабо­
т ы , дозы испыгуемых производных лидокаина мы увеличили в два раза - с
2 , 5 % от LDso до 5%. Результаты выполненных исследований частично пред­
ставлены на рисунке I .
У интактных кошек болюсное введение ЛХТ-3-00 в дозе 8,3 мг/кг не
приводило к урежению частоты сердечных сокращений, сопровождалось не­
выраженным депрессорным эффектом, снижением тонуса резистивных сосу­
дов, не вызывающим однако нарушений периферической тканевой перфузии
ввиду значительной систолической поддержки, нарастающей в течение по­
следующих 20 минут.
16
Рис. 1. Динамика dP/dt„u для интактного (А) и ишемизированного (Б)
миокарда левого желудочка кошек при введении производных лидокаина.
В условиях ишемического нарушения гемодинамики - развития брадикардии, регрессии инотропной функции, гипотонии - введение третичного
производного лидокаина не усугубляло, но и не корригировало явлений кардиогемодепрессии. При сравнении гемодинамических эффектов ЛХТ-3-00 и
его структурного предшественника - лидокаина, следует отметить, что со­
единение ЛХТ-3-00 является более безопасным, а потому и более привлека­
тельным для коррекции нарушений ритма сердца при коронарной болезни
сердца.
При сравнении гемодинамических эффектов ЛХТ-12-02 с соответст­
вующими эффектами лидокаина и кватернидина мы пришли к выводу, что
изменения параметров центральной и системной гемодинамики, вызываемые
введением четвертичного производного лидокаина ЛХТ-12-02, сопоставимы
с таковыми тримекаинового аналога кватернидина. Также как и соединение
ЛХТ-3-00, использование вещества ЛХТ-12-02 в качестве противоаритмического средства более безопасно, нежели лидокаина, поскольку не сопровож-
17
дается негативными сдвигами основных гемодинамических констант ни сра­
зу после введения, ни в течение последующего наблюдения. ЛХТ-12-02 не
снижает артериального давления, напротив, несколько его повышает, начи­
ная с 10 минуты после введения, не уменьшает ударного объема левого же­
лудочка. ЛХТ-12-02 как кватернидин и лидокаин не угнетает сократительную
акгивность левого желудочка и, таким образом, лишено отрицательного инотропного эффекта. Напротив, в условиях ишемической стагнации сократи­
тельной функции миокарда соединение ЛХТ-12-02 на 10-40 минутах после
введения оказывает инотропную поддержку, сопровождающуюся рефлек­
торным снижением частоты сердечного ритма.
Таким образом, оценивая весь комплекс полученных данных можно
констатировать, что производные лидокаина ЛХТ-3-00 и ЛХТ-12-02 проде­
монстрировали высокую степень безопасности, как в условиях хронического
эксперимента, так и в условиях острого тестирования гемодинамических ха­
рактеристик интактных кошек и кошек с экспериментальным инфарктом
миокарда. Наиболее очевидным преимущество испытуемых веществ в плане
безопасности противоаритмической терапии становится, при сравнении их
эффектов с эффектами этацизина, выявленными ранее на нашей кафедре
Шуваловой Е.Н. (2003). Учитывая данные о высокой противогфитмической
активности ЛХТ-3-00 и ЛХТ-12-02 (Блинов Д.С, Костин Я.В., 2003; Блинов
Д.С. и соавт., 2004) оба соединения следует признать перспективными для
создания на их основе эффективных и безопасных лекарственных средств.
ВЫВОДЫ
1. Третичное (ЛХТ-3.00) и четвертичное (ЛХТ-12.02) по тесту опреде­
ления LDso при внутрибрюшинном введении мышам, а также LDioo при внут­
ривенном введении кошкам, являются более токсичными соединениями, чем
их структурный предшественник лидокаин. При пероральном введении ток­
сичность дериватов лидокаина существенно снижается.
2. Производные лидокаина (2,5 % от LDso), в отличие от своего струк­
турного предшественника не повышают смертность белых мышей при хро­
ническом введении в условиях длительного (б недель) 25% иммобилизационного стресса.
3. ЛХТ-3.00 и ЛХТ-12 не усугубляют стресс-опосредованную потерю
массы тела подопытными животными и не оказывают негативного влияния
на абсолютную и относительную массу печени, легких селезенки, почек и
сердца.
4. Длительное введение производных лидокаина в дозах, составляющих
2,5 % от LDso, не усиливает негативные эффекты стресса на ультраструктуру
миокарда мышей: нарушения морфологии ядер, частота контрактурных по­
вреждений миофибрилл, деструкция мембранных органелл, выраженность и
частота внутри- и интерстициальных отеков не имеют ярких отличий между
животными контрольной и опьттных серий.
18
S. Третичное и чепгвертичное производные лидокаина не проявляют гемодинамически значимых кардиодепрессивных свойств.
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ
Для углубленного доклинического исследования фармакологии ЛХТ3.00 и ЛХТ-12 рекомендуется изучать фармакодинамику соединений в безо­
пасных дозах, составляющих 2,5% от LDso при внутрибрюшинном введении
мышам.
СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО Т Е М Е ДИССЕРТАЦИИ
1. Противоаригмическая активность производных лидокаина, получен­
ных путем присоединения аминокислоты или кватернизации. // Мат.
59-й регион. Конф. По фармации и фармакологии. - Пятигорск, 2004. С. 188-200. (Блинов Д.С, Букаев О.Н., Скачилова С. Я.)
2. Исследование острой токсичности четвертичного аммониевого произ­
водного лидокаина при различных путях введения. // Материалы кон­
гресса «Человек и лекарство». Москва, 2004. - С. 769. (Блинов Д.С,
Букаев О.Н., Кузнецова В.Л., Волкова Н.А.)
3. Ультраструктурная организация и адренергический контроль миокарда
при введении производных местных анестетиков. // Мат. X I I Всеросс.
Национального конфесса «Человек и лекарство-2005». Москва, 2005. С. 701. (Балашов В.П., Кругляков П.П., Блинов Д.С, Ховряков А.В.,
Русскина Е.Л., Агеносова О.Г.)
4. Анализ фармакотоксикологического действия производных лидокаина.
// Матер. 2-й Всеросс. научн. конф. «Актуальные вопросы здоровья и
среды обитания современного человека». Ульяновск, 2005. - С.23-26.
(Балашов В.П., кругляков П.П., Блинов Д.С, Маркелова И.А., Альмяшева М.И.)
5. Оценка хронической токсичности препаратов метаболического дейст­
вия при стрессе. //Мат. науч.-практич. конф., посвященной памяти
проф. Костина Я.В. Саранск, 20 - 21 октября 2005. - С. 47-48. (Ермо­
лаева Т.В., Альмяшева М.И.)
Подписано в печать 10.11.2005 г.
Бумага офсетная. Формат 60x84 1/16 Гарнитура Тайме.
Печать способом ризографии. Уел печ. л. 1,16. Уч.- изд л. 1,02.
Тираж 100 экз. Заказ № 409.
Отпечатано с оригинала-макета заказчика
в копи-центре «Рефере1тг». ИП Тимошкина Л.В
430000, г. Саранск, ул. Полежаева, 49.
тел. (8342) 48-25-33
»2312T
РНБ Русский фонд
2006-4
24768
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
0
Размер файла
912 Кб
Теги
bd000103420
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа