close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

bd000103421

код для вставкиСкачать
На 1фавах рукописи
САПИН КИРИЛЛ АНАТОЛЬЕВИЧ
КОРРЕКЦИЯ ОСТРОЙ ПЕЧЕНОЧНОЙ НЕДОСТАТОЧНОСТИ
АЛЛОТРАНСПЛАНТАЦИЕЙ ГЕПАТОЦИТОВ
В ЭКСПЕРИМЕНТЕ.
14.00.27-хирургия
Автореферат
диссертации на соискание ученой степени
кандидата медицинских наук
Воронеж - 2005
Работа выполнена на ка(|)сдре oPiiicft .4iii)yi)rHii, медищшской биолоснн и
гетгспжн ['осуларсгвекного о5{)ачова-1слъиого учреждения высшею
професспопшшного o6p<noBjmim ( Г О У ВПО) «Воронежская госуда11(.1ксн11ЛЯ
меднщшская жадсмия им М И Г)урде11ко Федерального агенгства ко
чдравоочраиешио и социши.ному рачвнпгю»
HayiHftiu руководитель
доктор медгщннскич наук, профессор
Котпеттев Пеггр Иванович
Офиги1алтлые оппонеты
/(октор медгщниских паук , профессор
Пархисенко КЭр»ш Алексалдровтгч
доктор медшцпгскнч паук , профессор
Паппсова Воля Сергеевна
Ве,'131пая органпйщпя
Г О У ВПО «Курсгаш государеiBeimj.ift
медпюглскнн угагоерс1ггет Фсдсршгьного
шентства по -здравоохр^шешпо н социтп.ному
paiBHi-Jno»
■^aiiijira состотся «2-2 » декабря 2()05 i в 10 часов . на ^dceд;uпш
Wicceirrauuointoro совета Д 208 009 01 при Г О У ВПО «Воронежская
государственная мсдсщппск-.ш акадеюгя им П И Бурденко Федерал1>но| о
aieirrcTBa по здравоохрапегпио н со1П1альноыу развптгпо»
( 39--1000. Россия. г Воронеж , ул. Студенческая , д. Ю).
С диссертшпюГг можно о)паком(гться в 6n6fUioreKe Г О У ВПО «Воронежск:,ш
госуда1)ствега[ая медущтпсская академия им И Н Бу11дегпсо Федершгыюго
агентства по *дравоо\1)а11е»ппо п coinnuibiioMy paiBiiinio»
Автореферат pajocvian ) 9
нояб])я 2005 i
Ученый сек1)старь
Л11ссергш1по1п<ого совета
--> (^
У^
^__Д>[)уков М Л
1 ^
^^^^V5e
О Б Щ А Я ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы.
Отравления грибами или химическими соединениями, хирургический
сепсис
(полиорганная
недостаточность),
разлитые
перитониты
или
обширные ожоги несмотря на множество этиологических факторов и
разные пусковые механизмы, большинство из этих патологий
ведут к
нарушению функции печени, вплоть до развития острой печено'шой
недостаточности (Чудных С М . , Соловьев Н.Л., Иванов Ю.В.; 2000; Бельков
А.В., 2000; Блюгер А.Ф., Новицкий И.Н,,1984).
Коррекция печеночной недостаточности осуществляется применением
экстракорпоральной
детоксикации
(лимфо^фенаж,
лимфосорбция,
плазмаферез), гипербарической оксигенации, ультрафиолетового облучения
крови (Парфенов И.П., 2000).
Однако эффективность предложенных методов консервативного и
оперативного лечения ОПН невелика и поэтому летальность при
возникновении тяжелых форм достю ает 70-90% (Habibullah С М .,1992,
Шерлок Ш., Дули Дж., 2002).
Применение изолированных гепатоцитов ГЦ в коррекции печеночной
недостаточности еще недостаточно изучено (Рябинин В.Е., 2002).
Первые исследования по эффективности подключения цельной печени к
животным
и
больным,
страдающим
печеночной
недостаточностью
различного генеза и степени выраженности, показали, что несмотря на
обнадеживающие результаты, в донорской печени сложно обеспечить
щфкуляцию крови в течение необходимого периода. Это связано с быстро
наступающей
блокадой оттока, обусловленной гипоксическим отеком
паренхимы (Шумаков
В.И.,
и соавт.,
1995). В
дальнейшем были
предприняты попытки использования фрагментов и тонких срезов печени с
определенной долей успеха( Писаревский А. А. с соавт., 1980 ; 1Дыпин А.Б.
с соавт., 1984 , 1986, Маргулис М.С. с соавт., 1990 ; Шумаков В.И. с соавт..
1990; Eiseman В. et а!., 1976; Brems S. et ^.}>*тЩ/Ш1о((м(1Ш^яШепйпа%
БИВЛИОТСКА
I
3
Cn«ni*t^^ I
ayisie
Ь. М. et al., 1995 ; KoiKe М. et al., 1995; Miwa J et al., 1995 ; Myret FIcin J ,
1995).
Оценка функциональных свойств фрагментов печени (в инкубационной
системе) отчетливо показала их высокую метаболическую способность к
синтезу мочевины, аминокислот, катехоламинов и детоксикации; это
определило дальнейший путь развития проблемы
Примечательно, что в печени огромное количество функций выполняется
только одним типом - паренхиматозными клетками шги гепатоцитами. Они
составляют подавляющее большинство в весовом отнонюнии ( 90 - 95 % от
веса всех клеток печени ) и 2 / 3 общего объема всей клеточной популяции.
(Арзуманов В.С с соавт., 1988; Маргулис М.С с соавт, 1990; Шумаков
В.И., Арзуманов В.С, 1990; Пашков А Н
2003; Malschesky Р. S et al,
1988) Эта относительная морфологическая гомогенность печени, так же как
и связь гепатоцитов с органоспецифической
ее функцией, делаег очеьп.
выгодным использование паренхиматозных клеток в качесгве модельной
системы для исследования самых различных вопросов биохимического,
биофизического,
фармакологичекого
и
физиологического
профиля
(Арзуманов В.С с соавт., 1988; Маргулис М.С с соавт., 1990; Шумаков
В.И., Арзуманов B.C., Онищенко Н.А. и др., 1990; Malschesky Р. S et al.,
1988).
Функциональная
поддержка
печени
с
использова1шем
аллогенных
изо.1шрованных гепатоцитов вводимых в организм различными способами
в настоящее время начинает использоваться в некоторых клиниках при
коррекций
острой
печеночной
недостаточности
спровоцированной
различными заболеваниями (Тимербулатов В.М., 2005; Писаревский А.А.,
1985; Гальперин Э.И.,2003; Шиманко И. И., 1989; Шумаков В И. с соавт.,
1995; Nose Y.,1989.).
11,ель
исследования-
оценить
эффективность
коррекции
острого
токсического повреждения печени путем а/шотрансплантации выделенных
и изолированных гепатоцитов (ИГ)
Задачи исследования.
1. Разрабо1а1ь методику нолучения изолированных гепатоцитов из печени
крыс.
2. Основываясь на морфологических и биохимических тестах доказан,
жизнеспособность выделенных и изолированных гепатоцитов.
3. Разработать меюд аллотранснлантации И Г в брюшную нолосгь.
4. Сравнить и оценить биохимические изменения в организме
затравленного животного при острой печеночной недостаючности под
влиянием аллофансплантации культуры изолированных гепатоцитов и без
нее.
5. Выяснить закономерности и)мснения морфологической к а р т н ы печени
при остром токсическом повреждении в условиях аллотрансплангации
культуры изолированных ге17атоцитов и без нее.
Научная новизна.
1. Обоснованы оптимальные режимы выделения изолированных
гепатоцитов. Подвергая печень трехэтапной перфузии раствором
фосфатного буфера с лидазой, гепарином, хлоридом кальция, получаем И Г
общим количеством 500-800 млн. { количество клеток зависит от рашеров
перфузируемой печени).
2. Доказана жизнеспособность выделенных и изолированных гепатоциюв
на основании биохимических и морфологических тестов. Морфологический
контроль включая первый и вюрой морфо;югические тесты, пока и л , ч ю
изолированные интактные гепатоциты имели ту же ультраструктуру, что и
паренхиматозные клетки печени в организованной ткани. Они имели
округлую форму, с ценфальным ядром; четко ограниченную
плазматическую мембрану с микроворсинками, играющими сущеегненную
роль в гормональном ответе клетки; больнюе количество цитоплазмы,
насьпиенной хорошо сохраненными органеллами. Второй морфологический
тест показал способность клеток взаимодействоваiь с i ранулами
сефадекса, образуя комплексы клеток. Доказано, ч ю до 72 часов
гснатопиты способ1Пз1 осушествлять глюкозоутилизирующую и
дезинтоксикационную функции.
3. Впервые разработанная нами техника аллотрансплантапии
изолированных генатоцитов в брюшную полость, позволила сохранить
жизнеспособность гепатопитов в течении 24 суток . Трансплантация
выполнялась в искусственно созданнуво полость между брыжейкой тонкой
кипгки и сальником.
4. На основании морфо-функциоиальной оценки установлена
эффективность аллотрансплаьгтации выделенных и изолированных
1ена10ци10В для коррекции острой печеночной недос1аточнос1и в
начальный период. Это доказано морфологическими исследованиями печени в разные сроки от момента операции ( количество поврежде1шых
клеюк в I рунне прооперированных было значительно ме1п>ше, чем в
контрольной rpyFuie), биохимическими исследованиями - исследовался
уровень трапсамина» в разные сроки от момента затравки и операции.
5. Высказаны новые предположения о влиянии аллотрансплантироваппых
изолированных гепатоциов на дезиптоксикациопные и нролиферативные
процессы в печени при ее остром юксичсском повреждении Влияние на
нролиферативные процессЕ>1 п печени рассматривались через влияние
генатоцитов на систему кейлон-ангикейлон и стимуляции баллотирующею
пула.
Практическое значение работы.
Усоверп1енс1вована
методика
выделения
культуры
изолированных
гспаюциюв, позволяющая получа|ь материал с жизнеспособностью до 72
часов.
Предложен
новый
способ
алло1ра1ГСШ1антации
изолированных
1енатоцигов в брюшную полость. ( подана заявка на изобретение).
Разрабошна юхника аллотрапсплантации ИГ в брЕошную полость.
Уоановлепо
положи 1сльное
влияние
аллотранснлантировапных
гепагоци гон на начальный период острого поражения печени.
Апробация работы.
Материалы диссертации доложены на
заседании общестпа
хирурюв
(г,Воронеж 2005 г)., на Международной конференции хирурюв 1епатоло1ов
( г. Москва 2003 г)
Публикации.
По теме диссертации опубликовано 5 печатных работ. Подана заявка на
изобретение.
Положения выносимые на защиту.
1. Усовершенствование способа выделения изолированных генаюцитов
позволяет получить культуру клеток фувгкционируюших до 72 часов.
2. Аллотрансплантация выделенных и нзолировашплх гепатоцитов в
брюшную полость является способом коррекции острой печеночной
недостаточности на ранних этапах заболевания.
3. Введение культуры изолированных гепатоцитов способствуюг
«разгрузке печени», влияют на регенерацию поврежденного органа,
ускоряя пролиферацию клеток и стимулируя митоз клеток в пораженной
печени.
Структура и объем работы.
Диссертация состоит из введения, обзора литературы, главы о материалах и
методах
исследования,
главы
собственных
результатов,
заключения,
выводов, практических рекомеидагшй, указателя литературы.
Работа изложена на 115 страницах машинописного текста, иллюстрирована
4 таблицами и 50 рисунками. Библиография включас! 183 источника, из
них 66 отечественных и 117 иFюcтpaнllыx.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Материалы и методы исследования.
Методика выделения клеток
После обработки операционного поля раствором хлоргекседина
вскрывается брюишая, а чатем грудная полость. Подводяься две ли|а1уры
под v.portae, захватывая а. hepatica piopna
После выделения основных
сосудов V. cava ini'erioi, v. cava superioi , канюлируегся v poitae. И сразу же
пересекается v. cava nifenor, a после нскрьпия диафрагмы v. cava supeiior
для предупреждения набухания печени. Сразу после 1сап1о;7нрования печень
экстерпируется
и
вся
последующая
процедура
осуществляется
в
перфушониой камере, т.е. в условиях in vitio. На нервом этане печень
отмывается от крови, проводится частичное ослабление межклеточных
коп Iактов путем удаления кальция.
С лой целью пропускается бескальциевый раствор фосфатною буфера с
гепарином. На втором
лапе проводится перфузия печени раствором
фос(|)атного буфера с ферментом лидаза. Время перфузии составляет 10
минут, объем перфузата 350 мл. На третьем этапе печень подвергается
перфузии раствором фосфатно! о буфера с хлористым кальцием
После завершения [рех этапов перфузии ткань
печени ткань печени
находится в таком состоянии когда межклеточные связи максимально
разрушены.
Затем
удерживая
скальпсггм освобождают
печень
печень oi
за
круглую
капсулы
связку
пинцетом,
и связочного аппарата,
механически измельчают ткань печени.
Методика культивирования
Затем проводилась однократная отмывка клеток в растворе фосфатно!о
буфера с последуюпхим ресуспендировапием
(пипетирование). Выход
клеток составляет ЗОО-.бСЮ млн. Под микроскопом проводился первый
морфологический
тест
(мнкроскопирование
клеток
и
оценка
изолированности клеток друг от друга и це;юсгность мембраны клеток).
Полученные гепаюциты
ресуснендировались в культуральной жидкости
(среда Игла; 50 мл.) с пабухпшм сефадексом(тес11ит Q 50)(5 мл), коюрый
предварительно инкубировался при 17 С
в течение 1 часа После этого у
суспензии гепатоцитов с гранулами сефадскса
среда
(добавлялся свежий раствор среды Игла
менялась кульгуральиая
и
удалялась
часть
жидкости с неадсорбировавшимися клетками), и суспензия помещалась в
холодильную камеру при t = 0-+5 С. В последующем среда Игла менялась
каждые 12 часов.
После 2 часов нахождения в термостате
проводился
второй морфологический тест (способность гепатоцитов взаимодействовать
с гранулами набухшего сефадекса и окрашивание клеток трепановым
синим). Для проверки функциональных свойств , гепатоциты переносились
в колонку диаметром 1,5 см., высотой 50 с м , с поддерживаемой t=37 С
градусов. Жизнеспособность клеток сохранялась в течении 72 часов.
Методика определения функции клеток
Для
определения глюкозоутилизирующей
функции гепатоцитов
через
колонку пропускался раствор глюкозы с концентрацией 10 ммоль/л (20 мл).
Время прохождения раствора через колонку составляло 30 минут.
На
выходе из колонки отбиралась проба V=2 мл. Определялась концентрация
полученного раствора глюкозы. Раствор с данной концентрацией через 1
час снова пропускался
через суспензию
гепатоцитов. Данная
проба
проводилась до 8 раз в течении 48 часов(4 час,6,24,28,34,48 час).
Дезинтоксикационная функция гепатоцитов проверялась пропусканием 50
(мл ) раствора аммиака с концентрацией 1 ммоль/л. Время прохождения
раствора через колонку сбставляло 40
отбиралась
проба
V=2
мл.
минут.
Определялась
На выходе из колонки
концентрация
полученной
мочевины и креатинина. Раствор аммиака с данной концентрацией через 30
минут снова пропускался через суспензию гепатоцитов.
Данная проба
проводилась до 8 раз в течении 48 часов(4 час,6,24,28,34,48 час).
Методика гистологического исследования
На 4, 7, 14, 21,
сутки после пересадки изолированных гепатоцитов
оперированные животные забивались.( на 4 сутки -21 живofяыx, на 7 сутКи
21 животных, на 14 сутки -20 животных, на 21 сутки - 18 животных,'всего
80 животных). На 3, 7 , 10, 17, 24,
после затравки неопе^ировйнные
животные забивались ( на 3 сутки -6 животных, на 7 сутки il "животных, на
10 сутки -21 животных, на 17 сутки - 20 животных, на 24 сутки - 18
животных,
всего
86 животных)
гистологического
исследования
У
(у
них
всех
бралась
ткань
животных
печени
забор
для
материала
проводился из 4 сегмента правой доли). Полученные материалы находились
в растворе 10% формалина в течение 14 дней. После этого проводилось
окрашивание препаратов гематоксилин-эозином.
Исследование
полученных
препаратов
проводилось
на
микроскопе
«Elektron 234 Set»
Методика затравки животных C C L
Животных подготавливали к затравке отсаживанием их в отдельную клетку
на 2-3 суток ограничивая их в употреблении пищи, позволяя только пить
воду.
После положенного срока готовился ССЦ для затравки.
Количество ССЦ было из расчета 100 мг. на ЮОг веса каждого животного.
К раствору e c u добавлялось растительное масло в пропорции 1/3.
Данная смесь вводилась животному per os. Концентрация CCU вызывала
явление токсического гепатита, не вызывая гибели животного.
Методика трансплантации изолированных гепатоци^ов
Через 3 суток, от момента затравки,
производилась
аллотрансплантация
группе затравленных животных
изолированных
гепатоцитов
в
брюшную полость.
Под наркозом (кетамин), после обработки операционного поля раствором
96%спирта, производилась лапаротомия. Вскрывалась брюшная полость.
На салфетку в рану выводились сальник и кишечная аркада(тонкая кишка с
брыжейкой тонкой кишки) Отдельными узловыми швами формировалась
полость, между прядью большого сальника и кишечной аркадой(тонкая
кишка с брыжейкой тонкой кишки). В искусственно сформированную
полость
имплантировались
изолированные
гепатоциты
в
растворе
фосфатного буфера из расчета 2,5-3 млн. в 1 кубическоим миллилитре.
Общее количество имплантированных гепатоцитов составляло 7,5-8 млн.
10
клеток. Место введения гепатоцитов в полость ушивалось узловыми швами.
Для наложения швов на полость с гепатоцитами использовалась нить 4-0
TI-CRON.Брюшная полость промывалась раствором фурациллина водного. Рана послойно ушивалась.
Анатомические структуры использованные для создания полости были
выбраны исходя из их относительной прочности и достаточного
кровоснабжения.
Статистическая обработка полученных данных
Статистическая обработка полученных данных вьшолнена на
персональном компьютере P C / S E L E R O N 366 , с учетом стандартных
статистических программ и критериев по Стьюденту.
Результаты исследований.
Морфологические исследования выделенных гепатоцитов
В соответствии с задачами исследования, предстояло отработать методику
получения и трансплантации изолированных гепатоцитов; для оценки
эффективности получения изолированных гепатоцитов были
использованы такие критерии, как жизнеспособность клеток и оценка
функциональных свойств полученных гепатоцитов. Для этого
проводились первый и второй морфологические тесты.
Для оценки жизнеспособности клеток были выбраны часы исследования
4, 6, 24, 28 ,34, 48, 58, 68 , 72 -час от момента выделения клеток.
Оценивая полученные результаты можно заметить, что с 4 часа (рис.1) по
28 час (рис .2), изолированные гепатоциты начинают взаимодействовать с
гранулами сефадекса. Причем до 24 часа взаимодействие идет неактивно
(рис. 3).
Начиная с 28 часа
мембраны изолированных
гепатоцитов начинают
активно взаимодействовать с мембраной гранулы, вызывая как адгезию
изолированных гепатоцитов на сефадексе, так и адгезию фанул сефадекса
между собой (рис. 4).
И
Начиная
с
34
часа
изолированные
клетки
и
гранулы
сефадекса
взаимодействуют в максимальной степени. Гепатоциты располагаются по
всей поверхности гранулы, образую «плотное клеточное кольцо»( рис.5).
Гепатоциты, находясь в изолированном состоянии
48 часов начинают
взаимодействовать между собой то есть с теми клетками, которые уже
адсорбировались на фануле сефадекса (рис.6).
Группа этих клеток
образует «клеточный хвост» {рис.7), данная морфологическая картина
наблюдается с 48 по 58 час исследовании (рис.8).
Начиная
с
68
часа
исследования
адгезия
между
изолированными
гепатоцитами, гранулами сефадекса достигает максимального уровня
(рис.9).Клетки оказываются замкнутыми в пространство ограниченное
другими клетками и гранулами сефадекса. Таким образом мембраны
клеток могут только частично взаимодействовать с внешней средой, что
сказывается на снижение работоспособности клетки. «Так как важнейшую
роль в утрате специфических функций изолированных гепатоцитов могут
играть нарушения.,.,мембранных потенциалов»( В.И. Шумаков .,1994) В
микропрепарате на 72 часе в единичных полях, зрения сохранялись
изолированные клетки, которые и
сохраняли
свою морфологическую
целостность (рис. 10).
-^^'Йй-г-^^^^-'ЛУ-.- <У:
- ^^
Рис I Выделенные гепатоциты 4 час
Рис 2 Выделенные гепатоциты 6 час
от момента выделения Ув 40
от момента выделения Взаимодействие с
фанулам и сефадекса У в 10
12
•V
ш
Рис 1 Выделенные гепатоциты 24 час
Рис 4 Выделенные гспатогшты 28 мае
от момен га выделения Взаимодействие с
от момента выделения Втанм о действие с
гранулами ссфадекса Ув 10
гранулами ссфадскса Уо 40
р, О %
fMu
Рис 5 Выделенные гепатоциты ^4 час
Рис 6 Выделенные (спатоцила 48 час
от MOMCirra выдсложя Втаимодсйстпие с от момента выделения Втаимолействие с
гранулами сефалекса Ув iO
I >
iранулами ссфадскса У» 40
•? . Г »
Рис 7 Выделенные гепатоциты 58 час
Рис 8 Выделенные гепатоциты 58 час
от момента выделения В^аимолейстпис с от момента выделения Втанмодействие с
гранулами сефадекса Ув 10
(ранулами се(|>адскса Ув 40
13
■>• л
^^m^^lp'L'^
Щсс'.йУ'?^
>|^iv«&'"fi?^f?
*; ? . ' ? > ч > ' ' ' ' « Ч ' ■
^i^^^'^^v
■
'i .M^ufe^.vi'-*,ir', *Ч^.
Рис 9 Выделенные гепатоциты 68 час
Рис 10 Выделенные гсматоцнты 72'lac
от момента нылелення Вшимолейстние ит мимен га оылелення В^йНмодеПствис с
с грануламн ссфалскса Уб. 10 >
гранулами се^апскся Ун 40
Биохимические исследования выделенных гепатоцитов.
Анализируя
полученные
глюкозоутилизирующей
результаты
функции
было
(при
исследовании
замечено,
что
наиболее
интенсивно гепатоциты «работали» в промежутке с 4 по 34 час снижая
концентрацию от 10 ммоль/л до 7,6(+-0,2) ммоль/л , в промежутке от от 34
до 58 часов активность клеток снижалась, на 34 час концентрация
составляла 7,6(+-0,16) ммоль/л на 58 час 7,2(+-0,1) ммоль/л , с 58 по 68час
глюкозоутилизирующую
активность повышалась. Конценрация с 7,2(+-
0,1) ммоль/л на 58 час снижалась до 6,7(+-0,23) ммоль/л к 68 часу. До 72
часов концентрация снизилась до 6,5(+-0,17) ммоль/л . После 72 часов
изолированные гепатоциты не функционировали.
Анализируя
результаты
дезинтоксикационной
функции
клеток
видно, что наибольшее снижение концентрации мочевины идет от 4 до 24
часов. Концентрация мочевины снижается с 21 ммоль/л до 17,2(+-0,21)
ммоль/л.
В
интервале с 24 до 48 часов концентрация
мочевины
снижается
медленно с 17,2(+-0,21) ммоль/л до 15,5( +-0,12) ммоль/л.
Возврат активности
изолированных клеток приходится на интервал
между 48 и 58 часами, когда концентрация мочевины
15,5(+-0,12)до 14,4 (+-0,11) ммоль/л.
14
снижалась от
После 58 до 72
часов концентрация мочевины снижалась медленно с
14,4(+-0,11) до 12,9(+-0,2) ммоль/л.
Анализируя деятельность клеток по утилизации крсагинииа видно
что пик активности клеток приходится на интервал времени между 4 и 34
часами, когда концентрация
креатинина снижалась наиболее активно с
221,7 мкмоль/л до 180,9( f-0,1) мкмоль/л,
В интервале между 34 и 72 часами клетки функционировали медленно,
уменьшая концентрацию креатинина с 180,9(+-0,1) мкмоль/л. до 175,7(+0,06) мкмоль/л.
Таким образом исследуя все показатели функционирования клеток
видно, что пик активности
изолированных клеток приходится ,на
промежуток межу 4 и 34 часами.
Связывая
морфологию
жизнеспособности
клеток
с
изолированных
биохимическими
исследованиями
клеток, становится ясна
причина
снижения функционирования изолированных гепатоцитов к 72 часам от
момента выделения.
Моделирование острого воспаления печени
Исследования
по
недостаточности
моделированию
показали, что
у
животных
острой
печеночной
на 1 сутки от момента введения в
организм крысы CCU per os у животного развивались признаки острого
гепатита что было подтверждено биохимическими и морфологическими
исследованиями.
Биохимические
исследования
проводились' путем
ежесуточного моииторирования уровней АсАТ и АлАТ
Максимальный
пик уровней трансаминаз был на 3 сутки после зазравки и составлял
1,491(+-0,12) ммоль/л-АсАТ, 1,322(+-0,1) - А л А Т .
Значения
значений.
А с А Т иАлАТ
К
5 суткам
повышались в 6 раз от нормальных для крыс
от
момента
незначительно снижался (рис. 11)
15
затравки
уровень
трансаминаз
Проведеиные биохимические тесты позволили нам сделать вывод, ч ю 3
сутки от момента затравки являются тем временем, когда в ткани печени
происходят максимальные изменения.
Поэтому
нами
было
принято
рен1ение
производить
моделирова1Н10й острой печеночной недостаточности
коррекцию
на 3 сутки от
момента затравки.
Дальнейшие биохимические тесты проводились на 7 , 10 , 17 , 24 сутки о г
момен га зазравки.
2?^
W-
Z2L
^
z:
ZZZZSL
^
-♦ 1 АлЛТ
^*сг
-о-2 Ас AT
-л—N-AcAT в норме
-><~М1-АлАт в норме
^s^
s^^s=^
1
-ж рЗ<р2<р1<р<0,01
Г
дни исследования
Рис. 11. Динамика изменений трансаминаз у затравленных животных,
Морфологические исследования ткани печени крыс
Дальнейнже исследования в этот период работы сводились к амали!у
морфологических изменений печени оперировашюй и не оперированной
|'руппы животных.
в
печени
животных
трансплантации
оперированной
клеток
отмечали
группы
умеренные
на
4
сутки
после
гемодинамические
нарушения в виде гидропической и баллонной дистрофии единичных Г Ц
и мононуклеарной инфилырации таких участков. Балочное строение
печени сохранено
Размеры очаюв некроза, локализованных в центре
16
долек, сокращались Мелкоканельная жировая дистрофия печени во всех
микропрепарагах (рис.12).
У животных НС оперированной |рупги>1 наблюдалась кар1ина выраженных
деструктивных изменений. Синусоиды расширс1н.1, в них отмечается
скопление эритроцитов. Около некротически измененных генатоцитов
наблюдаются
скопления
нейгрофилов
и
лимфоцитов.
Ядра
роикулоэндотелиальных клеток значительно увеличены в объеме и часю
выступают
глыбчатый
в
нросвет
распад
капилляров.
ядер.
В
Во
многих
гепатоцитах
клетках
отмечается
преобладали
прИжаки
прогрессирующей жировой и гидропической дистрофии (рис.13).
Анализируя морфологическую картину печени в обеих группах и проводя
сравнение количества клеток с поврежденными и
непоирежденпыми
ядрами мы выявили, что на 3 сутки от момента затравки и первые сутки
после трансплантации генатоцитов количество поврежденных клеток
печени у животных второй группы значительно ме1П)П1е, чем у животных
контрольной группы.
Это
подтверждает
cooTHOiueiine
между
общим
количеством
ГЦ
и
количеством поврежденных клеток (таблица 1).
Таблица 1.
Соотношение поврежденных и неповрежденных клеток и препаратах
основной и контрольной групп на 4 сутки после операции.
Общее
Общее
Количес|во
КОЛНЧСС ГКО
К0ЛИЧСС1 во
количееi оо
[|0!11к'жле1111и\
110нрсл{ле1Ш1.1\
клеток
клеток
клеток
кле^юк
Группа i
1 руппа 2
Группа 1
Групп,! 2
м-21
п-21
п-21
11-21
344,4^'^"
31Ч~Г
124,4
13.2
1Х,54
12,5
456,3
320,4 »
12.5
13,23
пм"
17,3
17
^
1 ТО.гГ*"
11,2
741,2
15,9
Продолжение таблицы I
3
М
317,Х ••
290,1
180,2
144,1
17,3
11,1
15,3
17.2
2983 ^*
101,2
127,2
17,2
18,2
11,3
311,2
129,6 ♦
137,7
9,4
19,3
18,2
15,0
284,5 ♦
304,4
114,1 *»
154.2
11,3
10,2
12,6
8,4
М
324,«
301,2
140,1
160,9
13,2
12,8
19,2
13,8
М
307,9 ••
294,7
107,6
154,2
11,8
16,2
12,9
18,2
331,7
305,9 •
121,2
142,1 ••
12,4
8,4
9,15
14,5
М
2955,3
2745,5
1153,8
1332,2
П1
118.2
126,97
135,35
125,5
m
"^ ' Х " м
360,3 "
m
5
М
17,1
"^ 327.6
in
6
М
m
7
m
8
m
9
"" ^
М
m
•
Bcei 0
клеток
Условные обозначения: 1-группа оперированных животных ,2- группа не
оперирован1п>1х животных
*-р<0,05
**-р<0,01 к исходному уровню
На 7 су1ки от момента операции у оперированного животного сохраняются
признаки осфого воспаления.
В
печени
животных
оперированной
группы
отмечали
умеренные
гемодинамическис нарушения в виде гидропической дистрофии единичных
(спатоцитов и моно1гуклеарной инфильтрацией таких участков. Отмечается
сохранность гисгоархитектоники
печени
и сохранность
балочного
строения печени. Размеры очагов некроза, локализованных в центре долек
становились
незначительными, при этом сохранялась
мелкокапельная
жировая дистрофия печени. Объем сохраненных клеток превышал объем
поврежденных клеток (рис.14).
18
у животных не оперированной группы наблюдалась каржпа выраженных
деструктивных изменений
R частости
наруншние балочною сфосния
печени. Синусоиды раснжрепы Вокру! очаг он пскрот
ГЦ Р1аб]гк)дае1ся
крунпоклегочная вocпaлитeJП>иaя ипфилырапия Во мпо1их I Ц 01мечается
глыбчатый распад ядер (рис, 15).
Исследуя
соогношеиие
поврежденных
и
неповрежденных
клеюк
в
препаратах двух групп на 7 сутки после операции видно, что количество
неповрежденных клеток и общее количество клеток 6ojH,iiie в группе
оперированных животных (таблица 2).
Таблица 2.
Соотношение поврежденных и неповрежденных клеток в препаратах
основной и контрольной групп на 7 сутки после операции.
Поля
Общее
Общее
Количество
Количество
Зрения
количество
количество
понрежлеииых
попрежлеЕ11п<1х
Ув 63
клеюк
клеток
клеток
клеток
Группа 1
Группа 2
Группа 1
Группа 2
п=2|
п-21
п 21
281,2 *
226,34
101,3
"ufi"
9,2
1 М
т
2
М
т
3
М
m
4
М
m
5
124,4^'
18,1
12,5
16.4
12,3
290,7 ••
205,4
96,3
137^"^
11.8
17,4
11,2
12.54
287,3
Т2Т),7
120,2*
140,5"
301,1
197,5 •
112,3
12,4
17,3
14,6
10,2
М
250,8 •
201.Т
124,Г
162,3
ич-б
17.2
16.2
15,1
274.4
215,2
93,1"
15471
19,1
18,2
10,2
231,6
230,2"
107,3
9,3
17,6
6,4
250,2
218.1
121.4
lli.f
11,3
8,2
16.1
11,3
М
m
М
m
1\4,2*'
М
m
9
11,7
190,3 ••
9,3
М
8
11,3
18,12
m
7
13,2
264,9
18,3
m
й
п-21
19
12,3
ТоГ,Т*
13.23
Т7(7,2««"
9.29
Продолжение таблицы 2
Всего
клегок
,1
2432 2
129.1
190'1,84
990,2
1235,2
137,«2
112,1
10S,46
Условные обозначения l-ipynria оперированных животных ,2- ipynua
оперированных животных
*-р<0,05
не
**-р<0.01 к исходному уровню
К 14 суткам от момента операции уровень воспалительных изменений в
группе оперированных животных постепенно регрессирует.
В
печени животных
оперированной
группы па фоне
гидропической
дистрофии единичных гепагоцитов отмечапась сохранносгь балочного
строения печени Уменьшение очагов некроза, локализованных в цен iре
долек, при этом сохранялась мелкокапе.чьное ожирение печени. Объем
сохраненгплх клегок превыншл объем поврежденных клеюк (рис 16).
У животных не оперированной группы наблюдалась картина выраженных
деструктивных изменений. Выраженное нарушение балочного строения,
расширение сиЕ1усоидов. В некоторых
клетках отмечается глыбчатый
распад ядер. Многие клетки безъядерные (рис. 17).
На 14 сутки от момента операции объем сохраненнглх клеток значительно
превышал
обьем
поврежденных
клеюк.
Причем,
количес1во
повреждснш,1Х клеток у группы не оперироватилх животных значительно
iipcBbnuajm количество поврежденных клекж у фумпы онсрировашплх
животнь1х Необходимо oiMciHib, 410 количество неповрежденных клегок у
группы
оперированных
животных
было
больше,
чем
у
группы
неоперированных животных (таблица 3).
Таблица 3.
Соотношение поврежденных и неповрежденных клеток в препаратах
основной и контрольной групп на 14 сутки после операции.
Продолжение таблицы 3
Поля
Обшее
Обшее
Количество
Количество
Зрения
количество
количество
поврежденных
поврежденных
Ув 63
клеток
клеток
клеток
клеток
Группа 1
Группа 2
Группа 1
Группа 2
п=20
п»20
п=20
п-20
190,3
104,3
86,2 •
13,2
11,2
1
М
256,1
m
12,34
12,1
М
260,3
196,2
75,7
117,1 ••
m
11,6
14,1
16,1
12,2
211,4
78,1 ••
112,3 •
16,3
17,2
11,3
12,1
27 i,7
205,3
91,3
99.1
17,2
17,2
14,2
11,1
220,2
184,2
105,7
121,2
13,1
11,3
17,2
9,6
274,8 •*
201,2
114,2
125,3 •»
12,9
16,4
9,2
256,1
217,6
96,3
15,3
13,2
9,2
12,2
238,6
194,5
85,1
124,2
14,54
16,2
7,2
12,2
246,89
186,4
93,3
87,2
18,3
9,4
12,2
7.4
2
3
М
m
4
М
m
5
М
m
6
М
m
7
М
m
8
М
m
9
М
m
240,6
•
•
"
•
12,3
•
109,2 •
Всего
клеток
М
2265,29
1787,1
844
981,2
m
131,58
109,9
109,8
100,3
Условные обозначения. 1-группа оперированных животных ,2- группа не
оперированных животных
*- р<0,05
К 21 суткам от момента операции
**- р<'0,01 к исходному уровню
в группе оперированных животных
постепенно начинаются процессы регенерации.
Хотя в печени животных оперированной группы сохранялись нарушения в
виде гидропической дистрофии единичных гепатоцитов. Очаги некроза и
21
мелкокапельного
ожирения печени сокрап1ались
Объем
сохраненнь'х
клеток превышал объем поврежденных клеток (рис.! 8).
У животных неоперированной группы наблюдалась картина выраженных
деструктивных изменений (рис.19).
Сравнивая
соотношение
поврежденных
и неповрежденных
клеток в
препаратах двух групп на 21 сутки после операции видно, что количество
неповрежденных клеток и общее количество клеток значительно больше в
группе оперированных животных (таблица 4).
Таблица 4.
Соотношение поврежденных и неповрежденных клеток в препаратах
основной и контрольной групп на 21 сутки после операции.
Поля
Общее
Общее
Количество
Количество
Зрения
количество
количество
поврежденных
поврежденных
Ув 63
клеток
клеток
клеток
клеток
Группа 1
Группа 2
Группа 1
Группа 2
п=18
п=18
п=18
п=18
188,4
91,1 ••
99,2
16,12
2,4
8,3
1
2
М
254,1
m
11,2
•
*
М
252,5
181,3
62,6
111,1
m
14,3
9,4
5,4
4,2
244,2 ••
203,3
66,7
16,2
12,6
8,1
12,4
270,2
198,7 ••
73,3
93.3
11,8
16,2
1,1
11.3
235,8
172,8
95,1 ••
123,7 ••
17,6
11,9
5,5
17.4
200,5
102,1
119,4
3
М
m
4
М
m
5
М
m
6
М
m
7
12,1
17,4
М
263,3 ••
211,8
81,3
98,3
15,1
10,5
5,3
М
241,3
162,3
73,6
15,3
12,7
6,2
8,34
252,8
174,2 ••
81,2
94,3
11,7
18,2
12,12
6.3
М
m
*
118.4
16,1
m
9
•
•
19,2
m
8
255,4
*
22
•
6,7
*
96,3
••
*
Продолжение таблицы 4
Всего
клеток
М
2269,6
1693,3
727
954
m
132,4
123,72
58,22
74,94
Условные обозначения; 1-группа оперированных животных ,2- группа
неоперированных животных
*- р<0,05
**- р<0,01 к исходному
уровню.
Анализируя
соотношение количества поврежденных и неповрежденных
клеток в препаратах обеих групп, можно отметить, что начиная с 14 суток
от
момента
начинаются
клеток,
операции
процессы
количество
в
печени
животных
оперированной
регенерации, увеличивается
неповрежденных
клеток
общее
группы
количество
уменьшается,
в
группе
неоперированных животных, наблюдается устойчивое снижение общего
количества клеток. Проводя исследование
печени
крыс,
мы решили
морфологических
изменений
исследовать цитологическую картину
места
трансплантации изолированных гепатоцитов.
Первое исследование проводилось на 4 сутки от момента трансплантации.
Изолированные Г Ц имели округлую форму, с центральнорасположенным
ядром. Видно обилие диплоидных клеток. Плазматическая мембрана клеток
сохранялась
неповрежденной.
изолированные
гепатоциты
На
7
сутки
сохраняли
ту
от
же
момента
структуру,
операции
что
и
паренхиматозные клетки печени в организованной ткани. Увеличилось
количество
мембраной.
диплоидных
На
7
клеток
сутки
с
неповрежденной
изолированные
плазматической
гепатоциты
начинали
взаимодействовать друг с другом образуя « единичные комплексы клеток»
На 14 сутки от момента операции
изменений (рис.20).
изолированные Г Ц без видимых
На 21 сутки от момента операции
гепатоциты сохраняли ту же
ультраструктуру, что и
изолированные
паренхиматозные
клетки печени в организованной ткани. Они имели округлую форму, с
23
центральным
ядром
неповрежденной.
На
«взаимодействовали»
Плазматическая
21
сутки
мембрана
клеток
изолированные
гепатоциты
друг с другом образуя «комплексы
формированием балок (рис.21).
J ^ .
"'■•■r^V:*-
• '«* ^
ч - •- ♦ . ; . • •
• -•* ••.-••/Ti
. • . '
•
. . - -
• » , * ♦ .
-.^
■ » -
" •'•'_ ' ^
Рис 12 Ткань печени крыс на 7 сутки ОТ
момента затравки 4 суткн после операции
« - ' * • •
»,
>
"
,
«J
Рнс 13 Ткань печени крыс на 7 суткн от
момент? затравки Г р у т я неопернро&а|тых
Группа оперированных животных
животных Окраска гематоксилином н зозниом
Окраска гематоксилином н 3OIHHOM Ve 63
Ув 63
'• -т
'■У-'а
*^ - i .
в V
"'
*
,*
-в
•• _
•
9
••
-- V« »-*
,'v „ - • •
• ' - г , ' . % * .-г*
•,
.- . . . »
, • Э -.♦,
*■
' в
• ч'
- в , .^
.,.,.
• • » -•
V
- J
Pjtc 14 Ткань печени крыс на 10 сутки от
мимента затравки 7 сутки от мпмеитз
операции Группа оперированных животных
Окраска гематоксилином и эозином Ув 63
% *
' . - '
^
.
.
-
«
в
в
*
■
л"
V .»
.
» о
v;*'^«''® ..
Рис 15 Ткань печени крыс на 10 сутки от
момента затрзвкн Группа неопсрнрованных
животных Окраска гематоксилином и эозином
УвбЗ
^^рр^
эдйШ^^^^" Щт^^>
tdmW0
•■in' f ^ * •^К.Й'» % *
^«^^'''i^*?^'**^ Ч"^
Рис 16 Ткань печени крыс на 17 сутки от
момента затравки 14 сутки от моме1Гга
операции Группа оперированных животных
Окраска гематоксилином н эозином Ув 63
^^4М^Ж^,
>1Й4Ж"
Рис 17 Ткань печпт крмс из 17
сутки от момента -итравки
Группа неонерировзнных животных
Окраска гематоксилином н эозином Ув 63
24
сохранялась
активно
клеток», с
Рис 18 Ткань fic'teiiH крыс iia 24 cyiKH ui
Piic 19 Ткань twiemi крыс ш 24 су1кн
laipaDKii 21 cyiKti or «момента огкрнинн
or монета mi]uiHKii ( pyiiiia (коикрмронамимх
{pyriiM oiiepiijtoiiaMiiux жияотиых
жннощых Окраскя кмлюьсктиюм it
Окраски (гматоксилииом н ю ицшм Уи 63
KtiiiiiOM Ун (i1
p-7 ^ ' '
r^^-^fiu
Сне 20 Цитология Mixia rpitiicdJiiiinaitHM
Рис 21 I UiiojiortM места rpaiictuiainaiiiui
)|н!»ир«1яа||ных iciittTuiitrroR iij 14 сутки
HioanpoHaiiithix rciidioimioa иа2| сутки
OTMOMCHfaoiupaioili Окраска гематокснмипом
и 10 (ИНОМ Ув 6J
от момста операции Окраска icMaiOKCiiiiHIUiM
и И11И1М1М Ув 63
Биохимические исследования
Анализ биохимических изменений
двух групп жипопплх показал, что
наиболее устойчивое снижение уровня TpancaMnnaj начинается с 7 суюк oi
момента операции, aKiHBfree процесс снижения идет на уровне АлАТ, в ю
же время уровень АсЛТ тоже снижается, но не достаточно интенсивно,
В интервале между 11 и 21 сутками от момента операции снижение уровня
АлАТ и АсАТ идет интенсипнее чем в остальные дни исследования. Так
уровень АсАТ в ггом интервале снижается с 0,81 до 0,49 ммо;п>/л, уровень
АлАТ с 0,72 до 0,52 ммоль/л., что интенсивнее, чем в оста/1Ьмыелни.
На 21 сутки от момента операции уровень АсАТ оперированных живо|ных
лостмгает границ нормы. Уровень АлАТ несколько выше уровня АсАТ но
динамика снижения по- прежнему устойчивая.
Из представленных данных
динамики трансамииаз видно, что )начсния
АсАТ(рис.22) и АлАТ(рис 23) у животных с пересаженными (енатоцитами
!начительпо ниже, чем у контрольной группы. Из этого можно сделать
25
вывод, что пересаженные гепагоциты оказывают действие на клетки,
пораженной печени.
гZ
II
ч
О
1
2
-*-1 -опер группа
-о-2-неопер группа
3ES.
^ ^ S ^
rsi:
3
4
5
7
10
- 4 - N-KOH гр ipynna
-»-р1<р2<0,01
17
24
дна исследования
Рис .22.Динамика изменений трансаминаз ( А с А Т ) у затравленных
животных.
- - ^ 1 опер ipynna
- 0 - 2 неопер груп[|а
- Л - N -контр.группа
^(Н-р <р2<0,01
10
Рис.23. Динамика изменений 1рансаминаз(
оперированных животных .
26
17
24
Д л А Т ) у затравленных и
Выводы.
1.
Разработанный способ выделения изолированных генатоцитов путем
трехэтапной перфузии печени растворами оптимизационного состава
позволяет
получить
культуру
изолированных
гсиатоцитов
функционирующих до 72 часов.
2.
Функциональные свойства генатоцитов подтверждены первым и
вторым
морфологическими
тестами,
глюкозоутилизирующей
и
дезинтоксикационной функциями изолированных гепазоцитов.
3.
Разработанный способ трансплантации изолированных
в
брюшную полость, заключавшийся в создании закрытой .долости.
между
брыжейкой
тонкой
кишки
и
сальником,
генатоцигов
позволил-создать
оптимальные условия для трансплантации и функционирования клегок в
организме затравленного животного.
4.
i
Аллотрансплантация выделенных и изолированных гепа101(итов в
брюшную полость по разработанной методике обуславливает снижение
токсического эффекта у крыс с моделированной острой печеночной
недостаточностью, способствует снижению интенсивности
поврежденной
печени,
oKasFjeaeT
корригируюп1ее
ферментативную функцию печени, проявляющееся в
уровней АсАТ и АлАТ в крови затравленного животного.
цитолиза в
воздействие
на
нормализации
«
5. Саногенные механизмы аллотрансплантации культуры выделенных и
изолированных
гепатоцитов,
включают
дезинтоксикационный
и
ускоряющий процесс пролиферации клеток при остром токсическом
повреждении opiaHa. Морфологическим эквивалентом защитного эффекта
являются уменьшение отека печени, сохранность балочной структуры с
преобладанием
неповрежденш.1х
гепатоцитов,
сокращение
мелкокапельного ожирения печени, а также уменьшением количества
поврежденных клеток. Положительное
воздействие аллотрансплантации
гепатоцитов на поврежденную печень совпадает с эффектами per^siepaiHiH
27
печени, что обосновывает целесообрачность трансплантации культуры,
содержащей
выделенные
и
изолированные
гснагоцигы
и
создас!
предпосылки для использования ИГ в клинических условиях при ОПН
Практические рекомендации.
I
Для получения культуры изолированных гепагоциюв,
целесообразно применять комбинированный метод перфузии с введением
раствора лидазы, хлористо|-о кальция, гепарина в фосфатном буфере в
v.portae и последующим механическим измельчением материала вручную
под контролем зрения.
2.
Конечным этапом выделения клеток для последующей
зраисплангации является получение изолированных гепато[штов обншм
количеством 300-500 млн. Количество полученных клеток зависит ог
размеров печени.
3.
Оптимальным для перфузии клеток печени является среда с рН 7,4.
4.
Трансплантация
выделенных
генатоцитов
осу1цествлястся
в
изолированную полость, между прядью большого сальника и кишечной
аркадой (тонкая кишка с брыжейкой тонкой кишки). При формировании
полости
для имплантации генатоцитов
использовалась нить
4-0 TI-
CRON.
5.
В
сформированную
полость
имплантируется
изолировашпле
гепатоциты в среде Игла из расчета 2,5-3 млн в I кубическом миллилитре.
Общее количество имплантированных гена г о ц т о в составляет 7,5-8 млн
клеток.
6.
Результаты исследования позволяют рекомендовать
культуры выделенных и
применение
изолированных генатоцитов для коррекции
острой печеночной недостаточности в кли|гических условиях.
Список печатных работ.
1. Сапин, К.А. Методика культивирования клеток печени на
Искусс1вснной среде/ К.Л. Сатшн // Материалы межрегиональной
студенческой конференции - Воронеж, 2003.- С. 253-254.
28
2. Пашков, А.Н. Культивирование гепатоциюв на твердом носителе/
А.Н. Пашков, П.И Кошелев, К.А. Сапи»//Материалы Международной
конференции хирургов-гепаюло! ов.-М.,2003.-С.65.
3. Пашков, А.Н. Кссно|рансплантация изолированных генаюциговУ А.Н.
Пашков,
П.И.
Кошелев,
К.А.
Сапин//Магериалы
Международной
конференции хирургов-гепатологов.-Ташкент,2005.-С.З I.
4. Пашков, А.Н.
Пашков,
П.И.
Способ выделения изо;шрованных гепагоцигов/А.П.
Кошелев,
К.А.
Санин//Журнал
1соре1ичсской
и
практической медицины.-2005.- Т.З , JV» 4.-С. 426-432.
5. Пашков, А.Н.
целях
коррекции
Ксенотрансплаитация изолированных гепаюцитов в
острой
эксперименте/А.Н.Пашков,
П.И.
печеночной
Кошелев,
недос1аточнос1и
К.А.
Сапин
//Журнал
теоретической и практической медицины.-2005.-Т.З, №4.-0.417-425.
29
в
Лицензия и д № 00437 от 10.11.99
Форма! бумаги 60x84'/iri. Объем I п. л.
Тираж 100. Заказ № 755
Отпечатано е roiouoio оригинала-макета в 1ипографии В Г У
394000, г. Воронеж, ул. Пухикинская, 3
Р23128
РНБ Русский фонд
2006-4
24769
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
0
Размер файла
1 024 Кб
Теги
bd000103421
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа