close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

bd000103584

код для вставкиСкачать
На правах рукописи
Мохамед Хашсм Мохамед Ахмед
БИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ ЗАЩИТЫ ЯРОВОЙ
ПШЕНИЦЫ ОТ ФУЗАРИОЗА КОЛОСА
Специальности: 06. 01. 11 - Зашита растений
03. 00. 07 - Микробиология
Автореферат
диссертации на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
МОСКВА 2000
Работа выполнена в Московской сельскохозяйственной
академии имени К. А. Тимирязева на кафедрах фитопатологии
и микробиологии
Научные руководители - доктор биологических наук, профессор
В. Л . Шкаликов; доктор биологических наук, прюфессор
В. К. Шильникова
Официальные оппоненты - доктор биологических наук В. В.
Мазин; кандидат биологических наук И. Н . Скворцова
Ведущее предприятие - Центральный Н И И агрохимического
обслуживания (ЦИНАО).
Защита диссертации состоится « . (..»
в ./-2/ ч. на заседании диссертационного совета Д 120.35.09
в Московской сельскохозяйственной академии имени К.
Тимирязева.
Адрес: 127550, Москва, Тимирязевская ул., 49.
Ученый совет М С Х А .
С диссертацией можно ознакомиться в ЦНБ М С Х А .
Автореферат разослан «*/~.» . .<^.^^. .2000 г.
Ученый секретарь
диссертационного совета профессор
ул
rdy^^
А.
'"■^-^ е . В. Исаичев
f§y0-
о^^о^/ё
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность работы: Биологический метод борьбы - наиболее
перспективная альтернатива химическим приемам защиты растений В
частности, это относится к предупреждению и борьбе со "злаковым
фузариумом" Fusarium graminearum Schwabe, поражаюпшм в период цветения
и налива зерна колос пшеницы. Борьба с F. graminearum затрудняется тем, что
он способен существовать в сапротрофной и паратрофной формах, и имеет
особую половую стадию (Gibberella zeae), способен использовать в качестве
источников питания разнообразные органические соединения (Билай, 1977).
Все эти особенности обусловливают его высокую пластичность и высокую
метаболическую активность в различных условиях окружающей среды и в
конечном итоге определяют широту его распространения во всем мире.
В последние десятилетия биологический метод все больше привлекает
внимание исследователей, хотя занимает еще небольшое место в комплексе
мер борьбы с почвенными патогенами. Этот метод позволяет избирательно
воздействовать на численность популяции и активность паразитов, безопасен
для человека и вызывает минимальные нарушения структуры биоценозов
(Сидорова 1980; Lindemian et al.,1983; Великанов с соавт., 1988).
В обычные по эпифитотийности годы патогенные, среднепатогенные и
непатогенные штаммы в популяциях агробиоценозов соотносятся как 1:3:1
(Клечковская с соавт., 1996). Однако в последние годы ситуация изменилась:
резко возросла вредоносность F. graminearum. Причинами распространения
фузариоза колоса и зерна в период созревания и уборки, очевидно, стало
отсутствие
специфических
фунгицидов,
подавляющих
возбудителей
фузариоза, снижение доли сортов пшеницы, устойчивых к фузариозу, а также
погодные условия и перенасыщение севооборотов зерновыми культурами.
Вместе с тем возрастающее антропогенное воздействие на окружающую
среду диктует необходимость вместо химических средств защиты растений
использовать биопрепараты, работающие в природных условиях: они более
избирательны, менее стойки и опасны для человека, вызывают минимальные
иаруидения структуры биоценозов и в то же время не менее активны чем
химические.
F. graminearum, вызывающий фузариоз колоса и зерна пшеницы,
активно продуцирует крайне опасные для здоровья человека и животных
фузариотоксины, в частности дезоксиниваленол и его ацетильное
производное. Последнее может достигать 4,0 мкг/растение (Сидоров с соавт.,
1996). Его роли в патогенезе, специфике и интенсивности токсиногенности
штаммов, создании
устойчивых сортов растений и другим вопросам
посвящено большое количество работ (Львова с соавт., 1990; 1997; Чкаников с
соавт, 1997; Монастырский с соавт., 1997; Терехов с соавт., 1998)
Цель работы: Изучение возможности применения биоагентов Fusarium
sp. ( A F - 967), Trichoderma lignorum и биологически активных веществ Ф - 760
РОС. НАЦИОНАЛЬНАЯ
БИБЛИОТЕКА
/'СПетервург
20CI0PK
и строма в защите ярювой пшеницы от основного возбудителя фузариоза
колоса - Fusarium graminearum.
В соответствии с поставленной целью предусматривалось решить
следующие задачи:
- Изучить морфолого-культуральные признаки штаммов патогена F.
graminearum, изолятов - антагонистов Р. sp. (AF - 967), Т. lignorum, их
скорость роста на питательных средах, распространение фитопатогснов и их
антагонистов на семенах пшеницы;
- Определить антагонистическую активность F. sp. (AF - 967) к F.
graminearum и выживаемость гриба F. sp. (AF - 967) в дерново-подзолистой
почве;
- Установить биохимическую природу метаболитов F. sp. (AF - 967),
антагонистических в отношении F. graminearum;
- Оценить токсиногенность штаммов F. graminearum;
- Определить микопаразитическую активность Trichoderma lignorum в
отношении F. graminearum;
- Определить влияние биоагентов [F. sp. ( A F - 967) и Т. lignorum],
биологически активных веществ ( Ф - 760, Ф - 1153 и строма) на возбудителя
фузариоза колоса F. graminearum в лабораторных и полевых условиях.
Научная новизна: Впервые изучено влияние биоагентов [Fusarium sp.
( A F - 967) и Trichoderma lignorum] и биоцидов ( Ф - 760, Ф - 1153 и стромом)
на Fusarium graminearum - возбудителя фузариоза колоса пшег1ицы.
Биоагенты и сочетание биоцидов существенно снижали степень развития
болезни и повышали урожай пшеницы. Впервые в длительном (свыше 8-ми
месяцев) опыте установлена сохраняемость гриба на внесенном высоком (10*
КОЕ/г) уровне в течение 3-х зимних месяцев и постепенное последующее
снижение в летний период, независимо от присутствия других грибов.
Результаты опыта дают основание считать, что гриб может рассматриваться
потенциальным интродуцентом в почву.
Впервые сделана попытка
определить прирюду фитотоксических метаболитов Fusarium sp. ( A F - 967)
в
отношении
F.
graminearum
при
последовательном
разделении
культурального фильтрата на высокомолекулярную и низкомолекулярную
фракции при разных рН (рН 4.0; 6.0; 8.6) с последующей экстракцией
этилацетатом
и
лиофилизацией
водного
экстракта.
Отсутствие
фитотоксичности у полученных фракций и экстрактов, возможно, связано с
тем, что фитотоксичные метаболиты образуются грибом-антагонистом только
в присутствии соответствующей мишени.
Практическая ценность работы: Результаты исследований указывают
на возможность применения биоагентов F. sp. (AF - 967), Т. lignorum и
сочетаний биологически активных веществ ( Ф - 760 и строма) в защите
пшеницы от фузариоза колоса. Оздоравливающее влияние обработок
проявляется в период созревания семян новой репродукции и после их
хранения в неблагоприятных температурных условиях (при низких
температурах). Это показано при использовании модифицированного
экспресс - метода Вейцонга (Weizhong et al., 1997)
Апробация работы: Основные положения диссертации доложены на
июньской и декабрьской конференциях М С Х А им. К. А. Тимирязева в 1999 г.
Публикации: По материалам диссертации опубликованы 5 работ.
Структура и объем работы: Диссертация состоит из введения, обзора
литературы, экспериментальной части (7 глав), выводов и списка литературы.
Материал изложен на 126 стр. машинописного текста, содержит 22 таблицы
и 30 рисунков. Список литературы включает 172 наименований, в том числе
89 иностранных источников.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
В главе 1 дан обзор литературы по рассматриваемой проблеме.
В главе 2 обсуждаются объекты и методы исследований. Исследованы
15 штаммов Fusarium graminearum, выделенных из зерна пшеницы,
пораженной фузариозом колоса в годы эпифитотий
и в обычные годы
(предоставлены сотрудниками лаборатории микологии В Н И И зерна), а также
8 штаммов Trichoderma lignorum, выделенные из почв Удмуртии и
Московской области (кафедра фитопатологии), и 6 изолятов Fusarium sp. (AF967), проявивших высокую эффективность на растениях пшеницы,
пораженных корневыми гаилями.
Все культуры выращивали на картофельно-глюкозном агаре ( К Г А )
(Стройкой с соавт., 1987), рН 4. ..7. Для подавления сапротрофных бактерий в
среду вносили 1 % стрептомицина (Хохряков, 1979) и молочную или
лимонную кислоту (Билай, 1982). Признаки культур оценивали визуально и
под микроскопом. Конидии измеряли окуляр - микрометром (Кирай с соавт.,
1974). Грибы идентифицировали с помощью определителей (Билай, 1955;
1970; Литвинов, 1967; Rifai, 1969; Helgard, 1980;). Для определения
интенсивности спороношения использовали счетную камеру Горяева.
Токсиногенность штаммов F. graminearum определяли по содержанию
4-дезоксиниваленола (ДОН) и его ацетильного производного (АсДОН) в
фильтратах культуральной жидкости после 7 суток инкубации на роторной
качалке при 220 об/мин и 26 "С, на среде с сахарозой и глицерином.
Методом
двойных
культур
(Hamang,
1977)
оценивали
антагонистическую активность Fusarium sp. (AF-967) к F. graminearum. Для
определения природы метаболитов, обусловливающих антагонистический
эффект F. sp. (AF - 967) получали последовательно его культуральный
фильтрат на 5-е сутки, затем осаждали высокомолекулярные компоненты,
центрифугировали, из надосадочной жидкости получали этилацетатную и
водную фракции и изучали их свойства (рис. 1).
При определении микопаразитической активности Trichoderma lignorum
в отношении F. graminearum степень микопаразитизма классифицировали по 4
классам : О - нет микопаразитизма, (проверяемые организмы стыкуются); + наблюдается слабый микопаразитизм. (5...25 % колонии F gramincarum
охвачены мицелием Т. lignorum); ++ -наблюдается сильный микопаразитизм
(25...50 % колонии F. gramincarum занято мицелием Т. lignonim) и +++ наблюдается очень сильный микопаразитизм (50 100 % колонии Р.
gramincarum оплетены мицелием Т. lignorum)
К У Л Ь Т У Р Л Л Ь Н Ы И Ф И Л Ы Р Л 1 1иьигшп1чр.
рИбО
же 1Р,лкция э т л \iu.i Л гом
рИЫ)
рН8 6
р114 0
р11 8 6
plUO
упаривание этилацстата
Эл-К
иодныи (н г чиж
РИЛИ
рН S6
|<11 4 1)
лиофил1п:1Ция
1) Н
П-1Ц
БИОТЕСТИРОВАНИЕ
Рис. 1. Схема изучения фунгитоксических свойств культурального
фильтрата фиба Fusarium sp. ( A F - 967).
Примечание: Э А - этилацетатные экстракты,
В - водные экстракты, Н - рН 6,0; Щ - рН 8,6, К - рН 4,0
Взаимодействие F. grammearum с биоцидом (стромом) и небиоцидами
(Ф-760 и Ф-1153), изучали в лабораторных условиях на К Г А в чашках Петри
(оценивали рюст изолятов F. grammearum и их спорулирующую способность).
Выживаемость F. sp. (AF - 967) определяли в дерново - подзолистой
почве отдельно и в сочетании с другими фибами в лабораторных условиях с
января 1999 г до августа 1999 г. Грибы вносили в виде суспензии спор в
концентрации Ю' клеток в 1мл Анализ проводили ежемесячно, определяя
КОЕ в 1 г почвы (Теппер с соавт., 1993)
Полевые опыты проводили в 1998... 1999 гг на станции защиты
растений М С Х А ; лабораторные - на кафедрах микробиологии и
фитопатологии М С Х А им. Тимирязева. Почва дерново - подзолистая, легко
суглинистая на моренном суглинке, характеризуется средним плодородием;
рН 5,5. Содержание гумуса - З...3,5 % от массы пахотного слоя, подвижных
форм (мг/ЮОг почвы): легко гидролизуемого азота (по Тюрину и Кононовой)
4,7...4,9;Р205 (по Кирсанову) 25...30; К20(поМасловой) 12...17.
Площадь делянок 2 м^, повторность 4-кратная, размещение вариантов
рендомизированное. Подготовку почвы, расчет доз и внесение удобрений
проводили по общепринятой методике для данной зоны. Пшеницу
выращивали на одном и том же участке в монокультуре. На каждый 1 м^
высевали 600 всхожих семян.
Схема опыта: 1- контроль (без инокуляции); 2 - обработка посевов F.
graminearum, штамм 2 1 ; 3 - обработка посевов F. graminearum, шт. 20; 4обработка Р. graminearum 21 + F. sp. (AF-967); 5 - обработка F. graminearum
20 + F. sp. (AF-967); 6 - обработка посевов F. graminearum 21 + T. lignorum; 7 обработка F. graminearum 20 + T. lignorum; 8 - обработка F. graminearum 21 +
тилт-пр)емиум; 9 - обработка F. graminearum 20 + тилт-премиум; 10 обработка посевов F. graminearum 21 + Ф-760 + стром; 11 - обработка F.
graminearum 20 + Ф - 760 + стром; 12- обработка F. graminearum 21 + Ф - 760;
13 - обработка F. graminearum 20 + Ф - 760.
Посевы
яровой пшеницы (сорт Энита) заражали штаммами F.
graminearum в фазу цветения. Титр суспензии 10* спор/мл, норма расхода 25мл/м^. Через 2 дня посевы инокулировали в соответствии с вариантами
опыта: суспензией F. sp. (AF -967) и Т. lignorum (по Ю" спор/мл), растворами
Ф - 760, Ф - 760 + стром в концентрации, соответственно 1,4 и 5 % , при норме
расхода жидкости 25 мл/ м^. Урожай учитывали методом пробного снопа в
г/м^, определяли длину и количество колосков в колосе, массу 1000 семян,
общую массу зерна с учетной делянки всех вариантов. При определении
последействия биологически активных веществ и биоагентов на уровень
пораженности семян возбудителем фузариоза колоса,
использовали
модифицированную методику Weizhong et al (1997).
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Морофолого-культуральным признакам всех изученных культур Р. sp.
( A F - 967), F. graminearum и Т. lignorum посвящена глава 3, в которой
представлены характеристики всех 29 штаммов (и изолятов).
В главе 4 рассматривается скорость рюста грибов как показатель
заселения субстрата, распространения и выживаемости в природе.
По скорости роста рассматриваемые грибы всех родов в плане
репродуктивной стратегии относятся к г-стратегам, однако по отношению
друг к другу, особенно в первые часы их роста F. sp. ( A F - 967) отнесен к к-
стратегам (Звягинцев, 1987). Это наблюдалось как на питательных средах, так
и при распространении грибов по семенам пшеницы.
При оценке выживаемости грибов в дерново-подзолистой почве было
установлено, что количество внесенного F. sp. (AF - 967) во всех вариантах (в
момент внесения инокулюма) колебалось в пределах 5... 10 . 10 КОЕ / г
почвы. Общая тенденция для этого гриба во всех вариантах - сохранение
внесенного уровня в течение января...марта; начиная с апреля постепенное
снижение в летние месяцы, независимо от присутствия других грибов. К
летним месяцам несколько увеличилась, в июле достигла максимума
численность грибов рода Penicillium (рис. 2). Динамика развития грибов в
вариантах, где с F. sp. (АР - 967) были внесены Р. graminearum (разные
штаммы) почти повторяла закономерности варианта, где интродуцирован был
только гриб Р. sp. Особенно это касалось грибов Penicillium sp., количество
которых летом при наименьших численностях фузариумов (и патогенных и
непатогенного) резко увеличивалось. О доминировании грибов рода
Penicillium в сообществе микромицетов (до 90 % обилия) пишет В. Ю.
Шахназарова (2000). Судя по нашим данным, пенициллиумы достаточно
агрессивны в отношении фузариумов, особенно фузариума, используемого
нами в качестве антагониста корневых гнилей и фузариоза колоса.
Подавления развития грибов рода F. graminearum (штаммы 20 и 21) и
Bipolaris sorokiniana биоагентом Р. sp.(AF - 967) также не было отмечено.
Совсем иная картина наблюдалась при внесении Т. lignorum совместно
с биоагентом с Р. sp. (АР - 967) и высокоинфекционными фитопатогенами. Т.
lignorum сохраняется в течение всего периода инкубации на высоком уровне,
причем численность ее периодически резко возрастает, достигая к апрелю и к
августу 25000...27000 К О Е / г почвы.
F зр (AF-967)
Т
spp
MPspp
ЕЗдругие грибы
Рис. 2. Динамика развития Р. sp. (АР - 967) в нестерильной почве
К тому же можно отметить, что Т. lignorum доминирует в почве,
подавляя развитие всех других грибов, и что особенно следует отметить -
пенициллов, проявлявших антагонистические свойства по отношению к
фузариумам. Они тоже не выдержали агрессии со стороны триходермы. Это
еще раз подтверждает, что триходерма - одна из лучших биоинтродуцентов.
К сожалению, однако, она также снижает и уровень F. sp. (АР - 967).
Вместе с тем наиболее важный вывод из этого опыта - то, что Fusarium
sp. ( A F - 967) сохраняется в почве на достаточно высоком уровне (несколько
снижается, правда) в течение 3...4 мес. Это дает основание считать, что гриб
может рассматриваться как потенциальный интродуцент в почву. И хотя в
этом опыте не проявилось антагонистической активности F. sp. в отношении
грибов-возбудителей гнилей и фузариоза, очевидно, это можно объяснить тем,
что он в большей степени корнеобитаемый патоген, чем почвенный.
В главе 5 дана характеристика взаимодействия биоагентов (Fusarium
sp. и Т. lignorum) с возбудителем фузариоза колоса Fusarium graminearum.
Первичная оценка штаммов F. graminearum (табл. 1) показала, что
самыми сильными продуцентами (по суммарной концентрации) ДОН и
АсДОН, являются штаммы F20 из Канады и F24 из Краснодарского края, они
продуцировали значительно больше микотоксинов, чем другие штаммы,
выделенные не в эпифитотийные годы. Все штаммы F. graminearum
подразделены на 3 группы по токсиногенности (табл. 1)
Токсиногенность штаммов Fusarium gramineanim
Штаммы
Биомасса
гриба, г/л
F. gram. 20
6.8
F. gram. 24
9.7
Концентрация, мг/л
Сумма
Д011+
ДОИ
ЛсДОН
ЛсДОН
41.8
438.7
480.5
398.1
38.8
F. gram. 25
12.8
98
F. gram. 19
13.1
32.3
323.1
J
247.7
F. gram. 1
8.2
13.5
2.06.4
F. gram. 23
10.0
7.5
190.7
F. gram. 3
7.3
5.9
96.9
F. gram. 21
8.9
0.0
30.7
F. gram. 2
11.8
0.3
9.6
F. gram. 22
10.4
0.4
3.2
F. gram. 4
11.1
0.0
F. gram. 5
6.8
0.0
F. gram. 26
6.9
0.0
Таблица
Сумма токсинов
мг/г гриба
70.7
436.9
45.0
332.9
26 0
280.0
21 4
219.9
26 8
198.2
19.8
102.8
14.1
30.7
3.4
9.9
0.8
3.6
0.3
2.6
2.6
0.2
2.3
2.3
2.1
0.3
2.1
0.3
1. Самые сильные (мг/г): F20 (70.7), F24 (45); 2. Средней токсиногенности:
F25 (26). F19 (21.4). F1 (26.8), F23 (19.8), F3 (14.1); 3. Слабой
токсиногенности: F21 (3.4), F2 (0.8), F22 (0.3), F5 (0.3), F26 (0.3), F4 (0.2).
Следует заметить, что АсДОН накапливалось значительно больше, чем
ДОН.
При изучении взаимодействия Т. lignorum и F. graminearum методом
встречных культур наиболее сильным микопаразитическим эффектом
характеризовался штамм триходермы Т8. В пяти случаях мицелий
фузариумов (штаммы F3, F 2 1 , F22, F25, F26) полностью был покрыт
мицелием триходермы, в 4-х наполовину ( F 1 , F2, F4, F20), в остальных эффект
паразитизма был незначительным. Способность паразитирования Т. lignorum
на гифах F. graminearum на 10-е сутки показана в табл. 2.
Менее сильным микопаразитическим эффектом обладали штаммы
триходермы Т13, Т14 и Т9, ещё меньше остальные. Наиболее сильно был
угнетен триходермой штамм средней токсиногенности F3 (полностью на нем
паразитировали два штамма Т8 и Т13 и наполовину - четыре Т7, Т11, Т12 и
Т14). На рис. 3 показана степень антагонистического действия Т. lignorum в
отношении F. graminearum. Последние стадии гибели фиба F. graminearum
под действием Т. lignorum видны на рис. 4, 5.
Таблица 2
Микопаразитизм штаммов Trichoderma lignorum в отношении
Fusarium graminearum па 10-е сутки
Штаммы
F. gram. 1
F. gram. 2
F. gram. 3
F. gram. 4
F. gram. 5
F. gram. 19
F. gram. 20
F. gram. 21
F. gram. 22
F. gram. 23
F. gram. 24
F. gram. 25
F. gram. 26
Tr7
0
++
++
++
+
+
++
+
+
0
++
+
++
Tr8 T r 9 Trio T r l l Tr 12
++ ++
+
+
+
++
+
+
+
+
+++ +
0
++
+
++ +++ +
0
0
+
++ ++
+
+
+
+
+
+
0
4++ +++ + + ++
+++ +
+
0
0
+++ ++ ++ ++ + +
+
+
++
+
+
+
++
+
+
+
+++ +
+
+
+
++ + ++
+
0
+
Tr 13 T r l 4
+
+
+
+
+++ ++
+ + ++ + +
++ + +
+
+
++ +++
+
++
++
+
+
+
+
+
++
+
+
++
Примечание: +++ - сильный микопаразитизм (штамм триходермы полностью
покрывает штаммы фузариума) ++ - штаммы фузариума покрыты наполовину;
+ - незначительный микопаразитизм; О- микопаразитизма нет - колонии
фибов смыкаются при встрече.
Сильный продуцент микотоксииов F20 оказался менее стойким к
триходерме, чем F24 (штамм из Краснодарского края). Поскольку штаммы
фузариумов разной степени токсиногенности (F20, F22, F5, F2, F25, F24 и F6)
испытывали достаточно сильное угнетение со стороны различных штаммов
триходермы, можно предполагать, что штаммовые особенности как биоагента
так и биомишени, играют важную роль во взаимодействии, их необходимо
учитывать при создании биопрепарата. Возможно следует принять путь
создания мультибиопрепарата на основе ассоциации живых культур
биоагента, поскольку это обеспечит ему более широкие адаптационные
возможности в природных условиях, чем монокультура.
В о встречных культурах на К Г А на 7-е сутки установлено, что штаммы
F. gramineanim развиваются быстрее, чем F. sp. ( A F -967). Что касается
антагонистического влияния разных изолятов F. sp. на штаммы F. gramineanim
на 7-е сутки, можно сделать заключение, что наибольшей активностью
характеризовался исходный изолят F. sp. а в отношении практически всех
штаммов F. gramineanim - размер зоны подавления варьировал в пределах
2,7...4,7мм. Изоляты F. sp. d, F. sp. e, и F. sp. f были либо индифферентны по
отношению к ряду F. gramineanim (F. gr.3, 4, 20, 1, 2, 5, 23), либо занимали
среднее положение (табл. 3).
Таблица 3
Антагонистическая активность изолятов гриба Fusarium sp.(AF - 967)
по отношению к штаммам Fusarium graminearum (средний размер зоны
подавления на 7-е сутки, мм)
Штаммы
F. gram. 1
F. gram. 2
F. gram. 3
F. gram. 4
F. gram. 5
F. gram. 19
F. gram. 20
F. gram. 21
F. gram. 22
F. gram. 23
F. gram. 24
F. gram. 25
F. gram. 26
F. sp. a
3,3
3,7
3.3
2,7
3,7
3.3
2.7
4,7
2,7
3,7
3,3
2,7
4.3
F. sp .b
2,0
2.7
1,3
1.0
2,0
1,0
1,3
1,7
1,7
2,0
1,3
2.3
2,7
F. sp .c
2.0
3.3
1,3
0,0
2,0
1,7
3,0
2,3
1,7
2,3
1,0
1,7
1,7
F. sp. d
2.3
1.7
0.0
0,0
1,7
2,6
0,0
1,7
1,3
2,3
2,0
1,7
2,7
F. sp. E
0,0
0,0
1,0
1,3
0,0
1,7
1,7
2,0
1,7
0,0
1.0
2,0
1.3
F. sp.f
1.3
1,7
1,7
1,0
1,3
2,0
0,0
1,7
2,0
1,7
1,0
2,0
1,0
Поскольку доминирующую роль во всех случаях играли штаммовые
особенности микопартнеров, надо полагать, что интродуцируемые популяции
антагониста, в первую очередь, должны быть гетерогенными, поскольку они
практически заново устанавливают трофические связи в уже сложившихся
экосистемах и должны обладать высокой конкурентной и адаптивной
способностями, чтобы занять соответствующую экологическую нишу
+++
Рис. 3. Характер взаимодействия Tnchoderma lignorum и Fusarium
graminearum:
О - отсутствие взаимовлияния,
+ - слабый микопаразитизм,
++ - сильный микопаразитизм,
+++ - очень сильный микопаразитизм
Рис 4 Микопаразигизм Т. Irgnorum на гифах F graminearum
Четко видно, что гифы Т. lignorum оплетают i и([)ы
F. graminearum (х 400)
10
Рис. 5. Гифы Т lignorum полностью лизируют гифы F graminearum,
оплетая его мицелий (х 1200)
В
главе
6
обсуждаются
результаты
выявления
природы
фунгитоксических метаболитов F sp (AF - 967) в отношении F graminearum
Поскольку
грибы
на
питательных
средах
могут
выделять
экстрацеллюляриые
вещества высокомолекуляргюй и низкомолекулярные
природы сначала была проведена их проверка на фунгитоксичность
Результаты были отрицательными. Далее мы применили схему (рис I)
выделения возможного активного вещества из культурального фильтрата
(КФ).
Согласно этой схеме К Ф - жидкость бледно-розовою цвета (рН 7,5 Убыл
разделен на 4 образца по 250 мл в каждый. Первый образец - ко11Т[юль был
лиофилизирован до сухого остатка Второй - доводили 6н 1ICI до р11 6 0
(раствор розово-желтого цвета), третий - подщелачивали 1н NaOH до рП 8 6
(раствор светло-фиолетового цвета), четвертый - подкисляли 6н HCI до рН
4 О (раствор желтого цвета) Все образны экстрагировали этилацстатом в
соотношении 1 1. Колбы с образцами инкубировали на качалке 18 ч при 4"С
Затем этилацетагный слой отделяли or водного делителыюн норочкой
(водный слой бесцветен) Для удаления остаточной влаги добавляли в колбу
прокаленный безводный Na2S04 Водные остатки ( В ) лиофшпиировали
Наблюдения за ростом фибов проводили ежедневно в течение 5 суток
В результате исследований установлено, что суммарный лиофилизат
кульгурального фильтрата
фиба
Fusarium sp и суммарная фракция
высокомолекулярных веществ культурального фильтрата фиба FLisaruim sp
фунгистатической активностью не обладали Этилацетатная
и водная
фракции культурального фильтрата фиба Fusarium sp при рН 4,0, 8,6 и 6,0
фунгистатической активностью не обладали
Можно предполагать, что экстрацеллюляриые вещества, образующие
зону антагонизма при совместном культивировании фиба Fiisanum sp и F
grammearum, выделяются только при тесном взаимодействии этих фибов и,
по-видимому, индуцируются метаболитами F, graminearum.
в главе 7 рассматриваются опыты совместного применения F. sp., Т.
lignorum и биологически активных веществ в отношении F. graminearum.
Изучаемые штаммы Р. gramineanmi на питательных средах, содержащих
различные биологически активные вещества, вели себя по-разному.
Наименьшей скоростью роста на средах с Ф-760 отличался изолят F.
graminearum 19. Скорость роста гриба во все дни учета в 1,6 раза была
меньше, чем штаммов F. graminearum (4,20,21,24).
Учёт спорулирующей способности штаммов F. graminearum на средах с
биологически активными веществами (табл. 4) свидетельствует о
значительном снижении спорообразования у всех штаммов. На сртдах, со
стромом и Ф - 760 количество спор у всех штаммов было в 3...5 раз меньше,
чем в контроле. Препарат Ф - 1153 оказывал меньшее влияние на
спорообразование. Логично предположить, что защитный эффект при
использовании биологически активных веществ (стром, Ф - 760 и Ф - 1153)
против фузариоза колоса может быть усилен способностью этих веществ
индуцировать устойчивость стимулирующим воздействием на иммунную
систему растений.
Таблица 4
Влияние биологически активных веществ на спорообразование (число
спор в мл) Fusarium graminearum (на 14-е сутки)
Штаммы
Контроль
F.
F.
F.
F.
F.
15.8x10'
6.3x10'
27.5 xlO'
21.0x10'
13.2x10'
gram. 4
gram. 19
gram. 21
gram. 24
gram. 20
Стром
50 г/л
5.4x10'
2.5 xlO'
5.3 xlO'
5.1 xlO'
4.3x10'
Ф-1153
14 г/л
ll.OxlO'
3.7x10'
11.0x10'
12.6x10'
9.0x10'
Ф-760
14 г/л
4.1 xlO'
2.4x10'
4.6x10''
4.5x10'
4.3x10'
Обнаруженные свойства препаратов, возможно, fienocpeflCTBcimo найдут
отражение в практической стороне защиты зерновых культур от вредоносной
болезни.
В полевых опытах реакция штаммов F. graminearum 20 и 21 на
биопрепараты [Т. lignorum и F. sp. (АР- 967)] была примерно одинаковой.
Снижение пораженности растений фузариозом
колоса в вариантах с
пггаммами F. graminearum 20 и Р. graminearum 21 от обработки зараженных
колосьев суспензиями спор грибов-антагонистов Trichoderma lignorum и F. sp.
(AF- 967), составляло соответственно, 6,5...10,2 % и 2,0...4,4 % . Равная
эффективность в снижении пораженности фузариозом колоса (штамм 20)
получена от применения биологически активных веществ Ф - 760 и Ф - 760 +
стром. Различия в пораженности больных растений в сравнении с
контрольным вариантом (заражение без обработки биоагентами) составили
5,5...7,2 % . В вариантах со штаммом F. graminearum 21 эти показатели
примерно в 2 раза были больше (14,1... 16,6 % ) . Следует отметить, что
полученная эффективность в защите яровой пшеницы от фузариоза колоса от
12
использования биоагентов и биологически активных веществ несколько ниже,
чем от применения пестицида (тилт-премиум), однако достигаемая при этом
защита окружающей среды от загрязнения несомненна. Применение
биологически активных веществ и биопрепаратов наряду с улучшением
фитосанитарного
состояния
посевов
способствовало
улучшению
структурных элементов и общей продуктивности растений яровой пшеницы.
В вариантах опыта, где посевы обрабатывали суспензий спор F. sp.(AF 967),Т. lignomm и стром + Ф - 760 показатели продуктивности : количество
колосков в колосе, масса 1000 семян и урожай достоверно превышали
аналогичные показатели варианта с заражением.
Применение фунгицида не снимает полностью проблемы фузариоза
колоса, хотя степень зараженности посевов болезнью была несколько меньше,
чем в вариантах с биопрепаратами и биологически активными веществами.
Продуктивность была выше по сравнению с контролем на 34,5...34,9[2|[табл. 5,
6).
Таблица 5
Эффективность применения биологически активных веществ и
биопрепаратов в защите яровой пшеницы (сорт Энита) от фузариоза колоса
(штамм F.graminearum-20) в мелкоделяночных полевых опытах.
Варианты
опыта
Контроль
(без
заражения)
Контроль(с
заражением)
F. gr.
штамм 20
F. gr.20
+ F.sp.
(AF-967)
F. gr.20
+
Т.F.
lignorum
gr.20
+ Ф-760
F. gr.20
+ стром
+ Ф-760
F. gr.20
+ ТШГГ
премиум
HCP
(0,05)
Степень
Длина Количество Масса
Прибавка урожая
Урожай,
развития колоса, колосков в
1000
г/и'
г/м^
%
см
болезни %
колосе
семян, г
11,6
8,3
15,7
35,4
301,0
-
-
27,0
7,9
14,4
32,4
287,0
0,0
0,0
22,6
8,7
15,1
33,6
396,0
109,0
38,0
16,8
8,7
16,1
33,7
388,0
101,0
35,2
21,5
7,9
14,4
33,0
340,0
53,0
18,5
19,8
8,5
15,2
34,5
344,0
57,0
20,0
5,4
8,6
16,0
35,3
387,0
100,0
34,9
3,13
0,56
0,74
1,63
14,95
23,5
5,72
13
Данные этих опытов позволяют считать штамм Р. graminearum 21 более
агрессивным по сравнению со штаммом Р. graminearum 20. Обработка
посевов яровой пшеницы в период цветения суспензиями спор Р. sp. ( А Р -760)
и Т. lignorum, а также биологически активными веществами Ф - 760 и Ф 760 + стрем существенно снижала пораженность посевов фузариозом колоса
(до 16,6 % ) по сравнению с контролем (с заражением). При этом
продуктивность растений увеличивалась на 18,5...38 % .
Таблица 6
Эффективность применения биологически активных веществ и
биопрепаратов в защите яровой пшеницы (сорт Энита) от фузариоза колоса
(штамм F.graminearum-21) в мелкоделяночных полевых опытах.
КоличестСтепень
развития
Варианты
Длина
колоса,
Прибавка у р о ж а я
Масса
во
1000
Урожай,
г/м^
%
301,0
-
-
31,6
250,0
0,0
0,0
15,2
32,9
319,0
69,0
27,6
8,6
14,7
35,6
324,0
74,0
29,6
19,6
8,3
15,0
32,3
310,0
60,0
24,0
17,1
8,5
15,3
34,1
316,0
66,0
26,5
+ ТИЛТ
11,0
8,2
15,1
33,5
336,0
86,0
34,5
НСР
3,13
0,54
1,08
2,29
19,63
18,8
8,18
болезни
Опыта
колосков
%
см
семян, г
11,6
8,3
15,7
35,9
33,7
7,8
13,5
31,7
8,9
27,2
Г/м^
в колосе
Контроль
(без
заражения)
Контроль (с
заражением)?
■gr
штамм 21
Fgr.21
+ Fsp
(AF-967)
F gr 21
+ T lignorum
F gr. 21
+ Ф-760
Fgr 21
+ стром
+ ф-760
Fgr 21
премиум
(0,05)
При
биоагентов
фузариоза
Вейцонга
оценке последействия
биологически активных веществ и
на уровень пораженности семян новой репродукции возбудителем
колоса,
проведенной в лабораторных условиях по методу
(Weizhong et al, 1997) в нашей модификации, было проведено
14
тестирование степени пораженности семян пшеницы новой репро^1укции
штаммами F. graminearum 20 и 21. Степень пораженности мы разделили на 3
условных класса, к которым и соотносили результаты опыта. Наибольшей
степенью пораженности характеризовался класс III (51... 100 % ) , класс II
включал 11.. .50 % пораженных семян, класс I всего от О до 1 0 % .
В контроле (без заражения F. graminearum) [и в I классе] в случае
заражения штаммами 21 (табл. 7) и 20 (табл. 8) в основном, преобладали
здоровые семена. Практически не было пораженных семян и при обработке
фунгицидом (тилт-премиум) после обработки возбудителями фузариоза.
Данные, представленные в табл. 7 показывают, что обработка посевов
антагонистами F. sp. (AF - 967), Т. lignorum, биологически активными
веществами и фунгицидом после заражения F. graminearum (21) снижала
пораженность поверхности семян во всех вариантах опыта.
В табл. 7 и 8 показано, что искусственная инокуляция пшеницы в фазе
цветения штаммом F. graminearum 20 и штаммом 21 вызывала увеличение
степени пораженности семян новой репродукции возбудителем фузариоза
колоса. В зависимости от условно принятого класса пораженности по
отношению к числу пораженных семян контроля число пораженных семян
увеличивалось в 1,3... 3,0 раза.
Таблица 7
Влияние обработки посевов грибами - антагонистами, биологически
активными вешествами и фунгицидом на степень пораженности семян F.
graminearum (штамм 21)
Пораженные семена, %
0...10%
11...50%
51...100%
класс 1
класс II
класс III
Варианты
опыта
Здоровые
семена, %
Контроль (без
заражения)
70
5
15
10
F. gram. 21 (i)
40
15
20
25
i + F. sp.
(AF-967)
65
10
16
9
i+
T. lignorum
75
7
12
6
i+
ТИЛТ - премиум
77
4
11
8
i + CTpOM
+ Ф-760
65
8
16
11
i + Ф-760
60
9
17
14
15
Таблица 8
'Влияние обработки посевов грибами - антагонистами, биологически
активными веществами и фунгицидом на степень пораженности семян
F.graminearum (щтамм 20)
Пораженные семена, %
0...10%
11...50% 51...100%
класс I
класс II
класс III
Варианты опыта
Здоровые
семена, %
Контроль (без
заражения)
70
5
15
10
F. gram. 20 (ii)
47
10
13
30
60
9
20
11
65
6
19
10
62
7
19
12
60
7
20
13
59
9
17
15
ii + F. sp.
(AF-967)
u+
T. lignorum
ii +
тилт- премиум
ii+ стром
+ Ф-760
ii + Ф-760
Итак, этот опыт показал, что применение биоагентов и биологически
активных веществ оказывает оздоравливающее
влияние на растение не
только в период их созревания, но и на семена новой репродукции
Проверка этого эффекта экспресс-методом Вейцонга дает возможность
отобрать лучшие биоагенты и их сочетания для рекомендации в практику.
При определении всхожести семян установлено, что обработка посевов
антагонистами F. sp. (AF- 967) и Т. lignorum, а также
биологически
активными веществами после заражения посевов F. graminearum (21 и 20)
существенно повышала процент всхожести семян (табл. 9).
Самый высокий процент всхожести был получен при обработке Т.
lignorum (95 % ) в случае заражения F. graminearum (штамм 21) и фунгицидом
(95 % ) в случае заражения F. graminearum (штамм 20). Наименьшая всхожесть
(88,3 % ) получена в варианте с применением Ф - 760. Практически различий
между вариантами опыта не выявлено. Средняя масса надземной части
всходов существенно превышала соогвегстнующии показатель контрольного
варианта с заражением F. graminearum (штаммы 20 и 21).
16
Таблица 9
Влияние последействия антагонистов, биологически активных веществ и
фунгицида используемых в защите от возбудителей фузариоза колоса, на
всхожесть семян и среднюю массу надземной части всходов
F. graminearum(21)
Средняя масса
надземной
Варианты опыта Всхожесть
части всходов,
(%)
г/10 шт.
Контроль (без
98,0
2,5
заражения)
F. graminearum
2,0
75,8
(контроль с
заражением)
+ F. sp.(AF-967)
94,2
2,1
F. graminearum(20)
Средняя масса
Всхожесть
надземной
части всходов,
(%)
г/10 шт.
98,0
2,8
86,5
2,5
90,0
2,6
+ Т. lignorum
95,0
2,4
92,5
2,8
+ тилт - премиум
93,3
2,3
95,0
3,0
+ Стром + Ф-760
92,5
2,1
89,6
2,6
+ Ф-760
88,3
2,1
88,3
2,5
НСР 0,05
6,0
0,24
6,25
0,27
ВЫВОДЫ
Приведена характеристика морфолого-культуральных
признаков и
структур (микро- и макроконидии, хламидоспоры) популяций 15-ти
штаммов F. graminearum, 6-ти изолятов Fusarium sp. (AF - 967) и 8-ми Trichoderma lignorum.
Дана оценка скорости роста грибов на питательных средах и
распространения фитопатогенов и их антагонистов на семенах пшеницы. В
плане репродуктивной стратегии F. sp. (AF - 967) отнесен к к-стратегам по
сравнению с г-стратегами - грибами других родов и видов.
Интрюдуцируемый в почву F. sp. (AF - 967) сохраняется на высоком
уровне в течение 3 мес. Это позволяет рассматривать его как
потенциальный интродуцент.
Установлено, что штаммы F. graminearum различны по степени
токсиногенности. Наибольшее количество 4-дезоксинивале11ола (ДОН) и
его ацетильного производного (АсДОН)
синамнровали штаммы,
выделенные из зерна, выращенного в Канаде и Краснодарском крае п голы
эпифитотии.
17
5. Для Т. lignorum в отношении грибов F. graminearum обнаружено 3 вида
микопаразитизма: слабый, сильный и очень сильный микопаразитизм.
Штамм
триходермы
Т8
характеризовался
наиболее
сильным
микопаразитическим эффектом и наиболее широким спектром действия.
6. Среди изолятов F. sp. ( A F - 967) наибольшую антагонистическую
активность в отношении F. graminearum проявил исходный изолят "а". На
7-е сутки инкубации размер зоны подавления варьировал в пределах
2,7...4,7 мм практически для всех штаммов патогена.
7. При выявлении природы фунгитоксических метаболитов F. sp. ( A F - 967) в
отношении F. graminearum оказалось, что суммарный лиофилизат
культурального фильтрата ( К Ф ) гриба F. sp. (AF - 967) и суммарная
фракция высокомолекулярных веществ К Ф этого гриба фунгистатической
активностью не обладала. Не обнаружена фунгистатическая активность и у
этилацетатной и водной фракции К Ф гриба F. sp. при рН 4,0, рН 6,0 и рН
8,6. По видимому, экстрацеллюлярные вещества, образующие зоны
антагонизма при совместном культивировании F. sp. и F. graminearum
выделяются только при взаимодействии этих грибов и индуцируются
метаболитами последнего.
8. При изучении взаимодействия биологически активных веществ (строма, Ф
- 760, Ф - 1153) с возбудителем фузариоза колоса F. graminearum в
лабораторных условиях установлено, что стром и Ф-1153 обладали
небольшим фунгитоксическим эффектом, снижая скорость роста гриба на
20...25 % . Стром и Ф -760 ингибировали процесс спорообразования F.
graminearum (количество спор у всех штаммов снижалось в 3...5 раз).
9 Биологически активные вещества и биопрепараты обеспечивали защиту
яровой пшеницы от фузариоза колоса (снижение зараженности составляло
до 10,2 % ) и прибавку урожая на 38 % . Наилучший эффект получен от
применения Т. lignorum, F. sp. (AF - 967) и тилт-премиума (фунгицида).
10. Обработка
посевов
биологически
активными
веществами
и
биопрепаратами оказывала оздоравливающее влияние на растения не
только в период их онтогенеза, но и на семена новой репродукции.
Показатели
всхожести
и
массы
надземной
части
растений
соответствующих вариантов превосходили показатели контрольною
варианта с заражением F. graminearum: 88,3 ...95,0 % против 75,8 % в
зараженном контроле.
11 Наибольший эффект снижения пораженности посевов яровой пшеницы
фузариозом колоса достигнут при обработке посевов в период цветения
суспензиями спор Т. lignorum, F. sp. (AF - 967), сочетанием строма и Ф 760 и особенно при применении фунгицида тилт-премиума. Однако
преимуществом биоагентов и биологически активных веществ перед
фунгицидом является их биологическая природа.
18
По теме диссертации опубликованы следующие работы:
1. Хашем М., Шильникова В. К., Шкаликов В. А., Соколова Г. Д., Львова Л .
С. Взаимодействие некоторых биоагентов с возбудителем фузариоза
колоса// Известия Т С Х А , 1999, вып. 4, с. 116... 122.
2. Хашем М. Влияние биологически активных веществ на рост и споруляцию
изолятов Fusarimn graminearum// Деп. Рукопись, объем 4 стр., № 116/28 вс 1999.
3. Хашем М . Биологические связи гриба Fusarium graminearum Schwabe с
Fusarium sp. (FA - 967) и Trichoderma lignorum// Деп. Рукопись, объем 6
стр., №116/29 ВС-1999.
4. Хашем М . Использование биометода в защите пшеницы от фузариоза
колоса// Науч. конф. декабрь 1999, М., изд. М С Х А .
5. Чернышов Р. В., Хашем М. Антагонизм гриба Trichoderma lignorum к
Fusarium graminearum// В сб. студ. научн. работ, вып. 5, М., изд. М С Х А ,
1999. с. 76...79.
19
Объем /i2Sпеч. л.
Зак. 3Z0
Тираж 100 экз.
Типография Издательства М С Х А
127550, Москва, Тимирязевская ул., 44
РНБ Русский фонд
2006-4
25101
Рос
^^^^>^^^ыыяя
*»виюгем
I
tHerepPyjjfg /
го
э
(*
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
0
Размер файла
882 Кб
Теги
bd000103584
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа