close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Патент BY 13283

код для вставкиСкачать
ОПИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ПАТЕНТУ
РЕСПУБЛИКА БЕЛАРУСЬ
(46) 2010.06.30
(12)
(51) МПК (2009)
НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР
ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ
СОБСТВЕННОСТИ
(54)
BY (11) 13283
(13) C1
(19)
A 61K 31/13
A 31K 31/56
A 61P 31/00
СПОСОБ ПОДАВЛЕНИЯ РЕПРОДУКЦИИ ВИРУСА ГРИППА
В КУЛЬТУРЕ КЛЕТОК
(21) Номер заявки: a 20081013
(22) 2008.07.30
(43) 2010.04.30
(71) Заявитель: Государственное учреждение "Республиканский научнопрактический центр эпидемиологии
и микробиологии" (BY)
(72) Авторы: Бореко Евгений Иванович
(BY); Савинова Ольга Владимировна (BY); Павлова Наталья Ильинична (BY); Казакова Оксана Борисовна (RU)
(73) Патентообладатель: Государственное
учреждение "Республиканский научно-практический центр эпидемиологии и микробиологии" (BY)
(56) БОРЕКО Е.И. и др. Медицинские новости. - 1999. - № 3. - С. 20-25.
BY 7811 С1, 2006.
BY 7601 С1, 2005.
BY 7809 C1, 2006.
SU 677298, 1981.
БОРЕКО Е.И. и др. Теория и практика
медицины. Вып. 2. - Минск, 2000. С. 28-29.
БОРЕКО Е.И. и др. Вопросы вирусологии. - 1999. - Т. 44. - № 3. - С. 115119.
BY 13283 C1 2010.06.30
(57)
Способ подавления репродукции вируса гриппа в культуре клеток, отличающийся
тем, что на монослой инфицированных вирусом клеток наносят разведенные в среде 199
ремантадин в концентрации до 12,5 мкг/мл и 3β-O-ацетил-28-О-гемифталат бетулина в
концентрации до 50 мкг/мл.
Изобретение относится к области медицины, в частности вирусологии, и может быть
использовано для подавления размножения вирусов гриппа и редукции вызываемых ими
заболеваний.
Известен способ подавления репродукции вируса гриппа с использованием 3β-Oацетил-28-O-гемифталата бетулина [1]. Недостатком способа является относительно невысокая противовирусная активность.
Более интенсивное снижение репродукции вируса гриппа может быть достигнуто с
использованием ремантадина [2-4]. Недостатком такого способа ингибирования вируса в
отдельных случаях также является сниженная активность [4].
Задачей изобретения является расширение ассортимента средств, обладающих противовирусным действием.
Поставленная задача достигается в способе подавления репродукции вируса гриппа в
культуре клеток. На монослой инфицированных вирусом клеток наносят разведенные в
среде 199 ремантадин в концентрации до 12,5 мкг/мл и 3β-O-ацетил-28-O-гемифталат бетулина в концентрации до 50 мкг/мл.
BY 13283 C1 2010.06.30
Авторами обнаружено неочевидное свойство, позволяющее применить 3β-O-ацетил28-O-гемифталат бетулина и ремантадин для увеличения противовирусного действия.
Сущность изобретения иллюстрируется примерами.
Пример 1.
Токсическое действие 3β-O-ацетил-28-O-гемифталата бетулина для культуры клеток.
Токсические свойства определяют по способности вызывать цитодеструктивные изменения клеток спустя 72 ч инкубации. Монослойные культуры клеток первичнотрипсинизированных фибробластов эмбрионов кур (ФЭК) отмывают от ростовой среды и
наносят разведения 3β-O-ацетил-28-O-гемифталата бетулина на среде поддержки (среда
199) с концентрацией 800 мкг/мл и менее. 3β-O-ацетил-28-O-гемифталат бетулина предварительно растворяют в 10 % этаноле (маточный раствор). По истечении указанного срока неокрашенные культуры просматривают при малом увеличении микроскопа (объектив
×10). Максимальной переносимой концентрацией (МПК) принимают наивысшую концентрацию вещества, не вызывающую указанных изменений. Устанавливают, что в диапазоне
концентраций от 200 мкг/мл и более низких 3β-O-ацетил-28-O-гемифталат бетулина не
обладает способностью вызывать цитодеструкцию клеток.
Пример 2.
Токсическое действие ремантадина для культуры клеток.
Исследование, описанное в примере 1, выполняют с ремантадином. Устанавливают,
что в диапазоне концентраций от 12,5 мкг/мл и более низких ремантадин не обладает способностью вызывать цитодеструкцию клеток.
Пример 3.
Противовирусное действие 3β-O-ацетил-28-O-гемифталата бетулина. Исследование
проводят методом редукции количества бляшек под агаровым покрытием. Монослойную
культуру ФЭК, выращенную во флаконах, отмывают от ростовой среды, инфицируют различными разведениями вируса гриппа A/Rostock/34 (H7N1) в пределах 0,01-0,00001
БОЕ/клетка путем нанесения вируссодержащей суспензии в объеме 0,1 мл на 1 ч при
37 °С. Затем жидкость удаляют и клетки покрывают расплавом питательного покрытия на
основе концентрата среды 199 с добавлением 1 % бактагара и 0,005 % нейтрального красного (все реактивы Sigma) и различных концентраций исследуемого соединения. 3β-Oацетил-28-O-гемифталат бетулина предварительно растворяют в 10 % этаноле (маточный
раствор). После застывания покрытия флаконы помещают в термостат на 36 ч и затем
подсчитывают количество бляшек, видимых благодаря присутствию в покрытии витального красителя. На основе количества бляшек вычисляют титр вируса. Критерием противовирусного действия считают наличие различий в сравнении с контролем вируса.
Вычисляют также концентрацию 50 % подавления размножения вируса (среднеэффективная концентрация, ЕС50) и отношение МПК к ЕС50.
Полученные результаты приведены в таблице. ЕС50 3β-O-ацетил-28-O-гемифталата
бетулина составляет 9,2 (10,5÷8,1) мкг/мл, отношение МПК/ЕС50 - 22.
Пример 4.
Противовирусное действие ремантадина. Исследование, описанное в примере 3, выполняют с ремантадином. Полученные результаты приведены в таблице. ЕС50 ремантадина составляет 0,003 (0,01÷0,0009) мкг/мл, отношение МПК/ЕС50 - 4 167.
Пример 5.
Противовирусное действие 3β-O-ацетил-28-O-гемифталата бетулина и ремантадина
при совместном использовании. Исследование, описанное в примере 3, выполняют с различными концентрациями 3β-O-ацетил-28-O-гемифталата бетулина и 0,1 мкг/мл ремантадина. Полученные результаты приведены в таблице. ЕС50 3β-O-ацетил-28-O-гемифталата
бетулина в присутствии ремантадина составляет 3,0 (3,8÷2,4) мкг/мл, отношение
МПК/ЕС50 - 67.
2
BY 13283 C1 2010.06.30
Подавление репродукции вируса гриппа в культуре клеток ФЭК в присутствии
3β
β-O-ацетил-28-O-гемифталата бетулина (I), ремантадина (Re) и их сочетаний
Титр
Разность с конШифр Концентрация,
вируса ± Sx, lg тролем, lg
ЕС50 (I95), мкг/мл МПК/ЕС50
вещества
мкг/мл
БОЕ/мл
БОЕ/мл
50
<4,0
>2,35
25
<4,0
>2,35
9,2
12,5
5,26±0,05
1,09
I
22
6,25
6,35±0,03
0
(10,5÷8,1)
3,0
6,39±0,07
-0,04
0
6,35±0,04
12,5
6,45±0,03
0,25
6,25
5,99±0,12
0,71
3,12
5,9±0,12
0,8
1,5
5,48±0,1
1,22
0,003
0,78
5,42±0,02
1,28
Re
4 167
0,39
5,42±0,16
1,28
(0,01÷0,0009)
0,19
5,44±0,03
1,26
0,1
5,23±0,07
1,47
0,01
6,16±0,09
0,54
0
6,7±0,02
50
<4,0
>2,35
25
<4,0
>2,35
12,5
5,24±0,06
1,11
3,0
I + Re 0,l
67
6,25
5,49±0,01
0,86
(3,8÷2,4)
3,0
5,61±0,07
0,74
1,5
6,34±0,07
0,01
0
6,35±0,04
12,5
<4,0
>2,7
6,25
<4,0
>2,7
3,12
5,26±0,07
1,44
1,5
5,65±0,02
1,05
0,78
5,7±0,04
1,0
0,00009
Re + I 6,0
138 888
0,39
5,73±0,06
0,97
(0,01÷0,0000007)
0,19
5,82±0,03
0,88
0,1
5,58±0,08
1,12
0,01
5,79±0,01
0,91
0,05
6,33±0,05
0,37
0
6,7±0,02
Пример 6.
Противовирусное действие ремантадина и 3β-O-ацетил-28-O-гемифталата бетулина
при совместном использовании. Исследование, описанное в примере 3, выполняют с различными концентрациями ремантадина и 6,0 мкг/мл 3β-O-ацетил-28-O-гемифталата бетулина. Полученные результаты приведены в таблице. ЕС50 ремантадина в присутствии 3βO-ацетил-28-O-гемифталата бетулина составляет 0,00009 (0,01÷0,0000007) мкг/мл, отношение МПК/ЕС50 - 138 888.
Таким образом, заявляемое решение позволяет решить поставленную задачу. При совместном использовании 3β-O-ацетил-28-O-гемифталата бетулина и ремантадина удается
3
BY 13283 C1 2010.06.30
получить увеличение ингибирования репродукции вируса гриппа в культуре клеток в
сравнении с индивидуальным применением веществ. При оценке по среднеэффективной
концентрации или по отношению МПК/EC50 активность 3β-O-ацетил-28-O-гемифталата
бетулина увеличивается в 3 раза, ремантадина - в 33 раза. Значение фракционального индекса ингибирования (ФИИ), рассчитанное по формуле: ФИИ = ЕС50 в-ва "А" в комбинации/ЕС50 в-ва "А" в отдельности + ЕС50 в-ва "Б" в комбинации/ЕС50 в-ва "Б" в отдельности
(Janz С, Wigand R., 1982) [5], составляет 0,33. Оно свидетельствует о синергизме комбинированного использования препаратов.
Заявляемое решение может быть непосредственно в настоящий момент использовано
в исследовательской лабораторной практике для подавления репродукции вируса гриппа и
редукции вызываемых им заболеваний.
Источники информации:
1. Boreko E.I., Pavlova N.I., Savinova O.V., Nikolaeva S.N., Flechter O.B., Phyzhova N.S.,
Nikandrov V.N. Inhibition of virus reproduction and proteinase activity by lupane and some
other terpenes. News of Biomed. Sci. Becцi HAH Беларусь. Сер. мед.-биол. навук. - 2002. No 3. - P. 86-90.
2. Патент США 3,352,912, МПК C 07D 295/00; C 07D 295/03; C 07C 49/00;
C 07C 49/323, 2006.
3. Патент США 3,592,934, МПК C 07D 295/03; C 07D 295/00, 2006.
4. Бореко Е.И., Павлова Н.И. Амантадин и ремантадин в профилактике и лечении
гриппа // Медицинские новости. - 1999. - № 3(47). - С. 20-25.
5. Janz С., Wigand R. Combined interaction of antiherpes substances and interferon beta on
the multiplication of herpes simplex virus // Arch. Virol. - 1982. - Vol. 73. - P. 135-143.
Национальный центр интеллектуальной собственности.
220034, г. Минск, ул. Козлова, 20.
4
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
0
Размер файла
90 Кб
Теги
патент, 13283
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа