close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Патент BY 14270

код для вставкиСкачать
ОПИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ПАТЕНТУ
РЕСПУБЛИКА БЕЛАРУСЬ
(46) 2011.04.30
(12)
(51) МПК (2009)
НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР
ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ
СОБСТВЕННОСТИ
(54)
G 01N 33/48
A 61B 5/00
СПОСОБ ДНК-ДИАГНОСТИКИ
ГЕНОМНОЙ НЕСТАБИЛЬНОСТИ У ПАЦИЕНТА ПОТЕНЦИАЛЬНОГО ГЕТЕРОЗИГОТНОГО НОСИТЕЛЯ
МУТАЦИИ, ОТВЕТСТВЕННОЙ ЗА СИНДРОМ НИЙМЕГЕН
(21) Номер заявки: a 20081146
(22) 2008.12.10
(43) 2010.08.30
(71) Заявитель: Государственное научное
учреждение "Институт генетики и
цитологии Национальной академии
наук Беларуси" (BY)
(72) Авторы: Гончарова Роза Иосифовна; Кужир Татьяна Дановна; Савина
Наталья Викторовна; Смаль Маргарита Петровна; Политыко Анна
Дмитриевна (BY)
BY 14270 C1 2011.04.30
BY (11) 14270
(13) C1
(19)
(73) Патентообладатель: Государственное
научное учреждение "Институт генетики и цитологии Национальной академии наук Беларуси" (BY)
(56) RU 2295130 С1, 2007.
RU 2213782 С2, 2003.
Применение метода щелочного гельэлектрофореза изолированных клеток
для оценки генотоксических свойств
природных и синтетических соединений. Методические рекомендации. Москва, 2006. - С. 6-27.
АРУТЮНЯН Р.М. и др. // Вестник Российской академии медицинских наук. 2001. - № 10. - С. 84-88.
(57)
Способ ДНК-диагностики геномной нестабильности у пациента - потенциального гетерозиготного носителя мутации, ответственной за синдром Ниймеген, заключающийся в
том, что определяют методом ДНК-комет в лимфоцитах периферической крови пациента
уровни эндогенных и индуцированных мутагеном повреждений ДНК на 180-й минуте инкубации лимфоцитов в среде RPMI-1640, содержащей 10 % телячьей сыворотки, сравнивают с уровнями аналогичных повреждений, полученными для стабильного генома, и при
выявлении в лимфоцитах повышенных не менее чем в полтора раза уровней эндогенных и
индуцированных повреждений ДНК по сравнению со стабильным геномом диагностируют геномную нестабильность.
BY 14270 C1 2011.04.30
Изобретение относится к медицине, в частности к наследственным болезням, предназначено для диагностики геномной нестабильности, указывающей на гетерозиготное носительство мутации у родственников больного ребенка с клиническими проявлениями
синдрома Ниймеген (СН).
Моногенное рецессивное заболевание, называемое синдромом хромосомных поломок
Ниймеген (Nijmegen Breakage Syndrom), обусловлено мутацией (657del5) в гене NBS1, который кодирует белок нибрин, участвующий в регуляции клеточного цикла и восстановлении разрывов двухцепочечной ДНК [1]. Мутация наиболее распространена в Восточной
Европе (среди славянского населения Чехии, Польши, Украины), где регистрируется с частотой 1 на 177 новорожденных. Убедительно доказано, что данная мутация в гетерозиготном состоянии увеличивает склонность к канцерогенезу [2]. Гетерозиготное
носительство этой мутации встречается достоверно чаще среди педиатрического контингента со спорадическим лимфоидным раком по сравнению со здоровым населением [3].
Все это позволяет отнести таких лиц к группе онкологического риска. При рождаемости в
Беларуси около 90000/год можно ожидать, что примерно 500 новорожденных будет иметь
данную мутацию и связанную с ней предрасположенность к онкопатологии, а при переходе мутации в гомозиготное состояние - выраженный синдром Ниймеген со всеми неблагоприятными последствиями для здоровья и жизни ребенка. Выявление геномной
нестабильности имеет большое значение для членов семьи детей с синдромом Ниймеген
(СН), так как может указывать на гетерозиготное носительство соответствующей мутации
и использоваться при генетическом консультировании для планирования деторождения и
прогноза их собственного здоровья.
Наиболее близким по технической сущности к заявленному изобретению является
способ определения нестабильности генома у детей с детским церебральным параличом
[4]. В отличие от заявляемого способа, он предназначен для выявления геномной нестабильности при ненаследственной патологии, относится к детской неврологии и предусматривает анализ цитогенетического статуса по частоте аберраций хромосом в
лимфоцитах периферической крови после их 72-часового культивирования (без конкретизации типа перестроек) и частоте микроядер в эритроцитах по данным анализа не менее
20000 эритроцитов на каждом препарате. Оба используемых цитогенетических метода
позволяют обнаружить дестабилизацию генома на хромосомном уровне, а сам способ
учитывает в качестве критерия геномной нестабильности только повышение фоновой частоты цитогенетических нарушений.
Задачей заявляемого изобретения является разработка способа диагностики геномной
нестабильности у потенциальных гетерозиготных носителей мутации, ответственной за
СН. Задача достигается путем использования метода ДНК-комет для определения параметров стабильного и нестабильного генома и выявления нарушений в состоянии генома у
родителей и других родственников детей с клиническими проявлениями СН по комплексу
критериев геномной нестабильности.
По сравнению с рутинными цитогенетическими методами, оценивающими состояние
хромосом, метод ДНК-комет (гель-электрофорез единичных клеток) выявляет повреждения молекулы ДНК [5], что определяет принципиально иной подход к оценке нестабильности генома на молекулярном уровне. Этот метод применяется для идентификации
мутагенных факторов среды [6], а также для оценки мутагенных воздействий в различных
группах населения [7]. Однако в доступной литературе не обнаружено сведений, касающихся анализа с помощью данного метода геномной нестабильности у потенциальных носителей мутации, ответственной за СН. Преимуществом метода ДНК-комет по сравнению
с цитогенетическим анализом является возможность идентифицировать широкий спектр
первичных повреждений ДНК, использовать неделящиеся клетки, избегать этапа культивирования и связанных с ним неблагоприятных эффектов in vitro, что повышает точность
изучаемых параметров, существенно упрощает условия работы с клетками и сокращает
сроки анализа.
2
BY 14270 C1 2011.04.30
Предлагаемый нами способ основан на комплексном подходе, который учитывает известные критерии геномной нестабильности, а именно:
1) повышенную чувствительность генома к эндогенным повреждениям;
2) повышенную чувствительность генома к экзогенным повреждениям,
по сравнению с аналогичными показателями у здоровых лиц. Обнаруженные у пациента потенциального гетерозиготного носителя мутации, ответственной за СН, статистически
значимые изменения отдельных параметров стабильного генома или их сочетания указывают на геномную нестабильность.
Сущность способа состоит в определении методом ДНК-комет параметров, указывающих на нестабильность генома, на образцах периферической венозной крови у родителей и других родственников детей с клиническими проявлениями СН. Авторами заявки
установлено, что показатели геномной нестабильности, получаемые с помощью предлагаемого способа, тесно коррелируют с данными стандартного цитогенетического анализа,
который до настоящего времени служил основным лабораторным методом оценки стабильности генома.
Способ выполняется следующим образом. После забора венозной крови (в количестве
не более 1-2 мл) проводят выделение лимфоцитов центрифугированием в градиенте Histopaque-1077 (ICN) в течение 30 мин. Выделенные лимфоциты инкубируют при 37 °С в среде RPMI-1640 с добавлением инактивированной телячьей сыворотки (10 %) в течение 3
часов. В качестве модельного мутагена используют пероксид водорода (H2O2) в дозе 100
мкМ. Обработку клеток проводят при оптимальных условиях с последующей отмывкой мутагена.
Для определения уровня повреждений ДНК используют метод ДНК-комет (щелочную
версию) [5]. Процедура включает следующие этапы:
1) приготовление микропрепаратов, для чего суспензию лимфоцитов смешивают с
низкоплавкой агарозой и наносят на заранее подготовленные предметные стекла;
2) лизис клеток, в процессе которого происходит разрушение клеточных структур и
высвобождение ДНК;
3) щелочная денатурация, в ходе которой щелоче-лабильные сайты ДНК реализуются
в однонитевые разрывы;
4) электрофорез, в ходе которого фрагменты ДНК под влиянием электрического поля
мигрируют к аноду, формируя хвост кометы, тогда как ядро представлено неповрежденной ДНК;
5) нейтрализация препаратов;
6) фиксация и высушивание препаратов;
7) анализ препаратов выполняют с использованием флуоресцентного микроскопа, при
этом на стекле просчитывают 100 клеток. Кометы распределяют на 5 классов; среднее количество повреждений ДНК в условных единицах a.u. (arbitrary units) рассчитывают по
известной формуле [8].
Для исследования чувствительности генома к эндогенным повреждениям все указанные процедуры проводят на образцах интактных (необработанных) лимфоцитов; уровень
эндогенных повреждений ДНК регистрируют на 180-й мин инкубации клеток.
Для исследования чувствительности генома к экзогенным повреждениям, вызванным
окислительным стрессом, указанные процедуры проводят на лимфоцитах, обработанных
in vitro H2O2. Остаточный уровень индуцированных повреждений ДНК также регистрируют в конце инкубации клеток (180-я мин).
Статистический анализ данных и их графическое представление производят с помощью стандартных средств Microsoft Office (программа Excel).
На основании проведенных исследований в контрольной группе здоровых лиц (выборка 40 человек), не имеющих контактов с мутагенными факторами, выявлены следующие параметры стабильного состояния генома на 180-й мин инкубации лимфоцитов:
3
BY 14270 C1 2011.04.30
а) уровень эндогенных повреждений ДНК равен 12,08±1,09 a.u.; б) остаточный уровень
повреждений, индуцированных in vitro пероксидом водорода, составляет 15,9±1,44 a.u.
Статистически значимые изменения в сторону увеличения этих параметров свидетельствуют о геномной нестабильности.
Исследование образцов крови родителей пациентов с СН позволило определить следующие параметры состояния генома на 180-й мин инкубации лимфоцитов: а) средний
уровень эндогенных повреждений составляет 30,33±3,48 a.u., что более чем в 2 раза превышает этот показатель в группе здоровых лиц (t = 2,78; P<0,01); б) средний остаточный
уровень индуцированных повреждений ДНК составляет 24,5±2,9 a.u., что также достоверно выше, чем в контрольной группе (t = 5,01; P<0,01). Фигура свидетельствует о повышенной чувствительности генома как к эндогенным, так и экзогенным повреждениях ДНК
у обследованных родителей больных детей по сравнению со здоровыми лицами. Таким
образом, геномная нестабильность в группе родителей и других родственников детей с
клиническими проявлениями СН выявляется по уровню эндогенных повреждений ДНК и
остаточному уровню индуцированных повреждений ДНК на 180-й мин инкубации интактных и обработанных пероксидом водорода лимфоцитов соответственно. Наличие геномной
нестабильности у родителей (или других родственников) детей с предполагаемым диагнозом СН указывает на высокую вероятность гетерозиготного носительства мутации - вызывающей СН, и определенный риск ее передачи потомству.
Таким образом, наиболее показательными для диагностики геномной нестабильности
у пациента - потенциального гетерозиготного носителя соответствующей мутации - являются следующие параметры состояния генома:
1) повышенный уровень эндогенных повреждений ДНК (кратность увеличения этого
параметра по отношению к аналогичному параметру стабильного генома составляет не
менее полутора раз);
2) повышенный остаточный уровень индуцированных повреждений ДНК (кратность
увеличения этого параметра по отношению к аналогичному параметру стабильного генома составляет не менее полутора раз).
Способ подтверждается следующими примерами.
1. Мать пациента Т. с преполагаемым диагнозом СН, клинически здорова, однако метод
ДНК-комет выявил геномную нестабильность по уровню эндогенных повреждений ДНК
(31 a.u.; кратность увеличения 2,6) и остаточному уровню индуцированных повреждений
ДНК (23 a.u., кратность увеличения 1,45) относительно параметров стабильного генома.
Выявленные признаки геномной нестабильности коррелируют с данными цитогенетического анализа, т.к. у обследуемой клинически здоровой женщины обнаружен повышенный фоновый уровень аберраций хромосом (8 % по сравнению с 2,5 % в контроле),
половина из которых относилась к перестройкам хромосомного типа. Наличие геномной
нестабильности указывает на возможное гетерозиготное носительство мутации, ответственной за СН.
2. Мать пациента К. с предполагаемым диагнозом СН, клинически здорова, однако
метод ДНК-комет выявил геномную нестабильность по уровню эндогенных повреждений
ДНК (24 a.u., кратность увеличения 2) и остаточному уровню индуцированных повреждений ДНК (32 a.u., кратность увеличения 2) относительно параметров стабильного генома.
Выявленные признаки геномной нестабильности коррелируют с данными цитогенетического анализа, т.к. у обследуемой клинически здоровой женщины обнаружен повышенный фоновый уровень аберраций хромосом (5 % по сравнению с 2,5 % в контроле).
Наличие геномной нестабильности указывает на возможное гетерозиготное носительство
мутации, ответственной за СН.
Предложенный способ определения геномной нестабильности с помощью метода
ДНК-комет, не требует культивирования лимфоцитов, упрощает условия работы с клетками, повышает точность и сокращает сроки проведения анализа. Выявление геномной
4
BY 14270 C1 2011.04.30
нестабильности данным способом у пациента - потенциального гетерозиготного носителя
мутации, ответственной за синдром Ниймеген, способствует адекватной оценке генетического и онкологического риска в семьях, имеющих ребенка с клиническими проявлениями
синдрома Ниймеген.
Источники информации:
1. Kobayashi J., Antoccia A., Tauchi H., et al. NBS1 and its functional role in the DNA
damage response // DNA Repair (Amst). - 2004. - Vol.3, № 8-9. - P. 855-861.
2. Dumon-Jones V., Frappart P.O., Tong W.M., Sajithlal G., Hulla W., Schmid G., Herceg Z.,
Digweed M., Wang Z.Q. Nbn heterozygosity renders mice susceptible to tumor formation and
ionizing radiation-induced tumorigenesis // Cancer Res. - 2003. - Vol. 63, № 21. - P. 7263-7269.
3. Chrzanowska K.H., Piekutowska-Abramczuk D., Popowska E., et al. Carrier frequency of
mutation 657del5 in the NBS1 gene in a population of Polish pediatric patients with sporadic
lymphoid malignancies // Int. J. Cancer. - 2006 - Vol. 118, № 5. - P. 1269-1274.
4. Патент РФ. Способ определения нестабильности генома у детей с детским церебральным параличом / Д.Д.Гайнетдинова, В.В.Семенов (RU), (11) 2295130, (13) С1, (51)
МПК G 01N 33/48. - 2006.01.
5. Collins A.R. The comet assay for DNA damage and repair: principles, applications, and
limitations // Mol. Biothechnology. - 2004. - Vol. 26. - 249-261.
6. Дурнев А.Д. Применение метода щелочного гель-электрофореза изолированных
клеток для оценки генотоксических свойств природных и синтетических соединений. Методические рекомендации. - Москва, 2006. - 27 с.
7. Арутюнян P.M., Оганесян Г.Г., Нерсесян А.К. Применение метода ДНК-комет для
оценки генотоксических эффектов в группах риска // Вестник РАМН. - 2001. - № 10. - С. 84-88.
8. Collins A.R., Fleming I.M., Gedik C.M. In vitro repair of oxidative and ultravioletinduced DNA damage in supercoiled nucleoid DNA by human cell extract // Biochim. Biophys.
Acta. - 1994. - Vol. 1219, № 3. - P. 724-727.
Национальный центр интеллектуальной собственности.
220034, г. Минск, ул. Козлова, 20.
5
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
0
Размер файла
98 Кб
Теги
14270, патент
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа