close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Патент BY 10886

код для вставкиСкачать
ОПИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ПАТЕНТУ
РЕСПУБЛИКА БЕЛАРУСЬ
(46) 2008.08.30
(12)
(51) МПК (2006)
НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР
ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ
СОБСТВЕННОСТИ
(54)
BY (11) 10886
(13) C1
(19)
C 12N 1/20
ШТАММ ESCHERICHIA COLI КМИЭВ-39А - ШТАММ-АНТИГЕН
(21) Номер заявки: a 20051314
(22) 2005.12.28
(43) 2007.08.30
(71) Заявитель: Республиканское научноисследовательское дочернее унитарное предприятие "Институт экспериментальной ветеринарии имени
С.Н.Вышелесского" (BY)
(72) Авторы: Ломако Юрий Васильевич;
Андросик Николай Николаевич; Карпович Валентина Константиновна
(BY)
(73) Патентообладатель: Республиканское
научно-исследовательское дочернее
унитарное предприятие "Институт экспериментальной ветеринарии имени
С.Н.Вышелесского" (BY)
(56) Ломако Ю.В. Ветеринарная наука - производству. Научные труды. Вып. 36. Мн.: Хата, 2002. - С. 91-95.
Пирожков М.К. Биологические препараты для специфической профилактики и терапии эшерихиоза животных:
Автореф. дис. - М., 2002. - С. 6-43.
RU 2222591 C2, 2004.
RU 2232189 C1, 2004.
BY 10886 C1 2008.08.30
(57)
Штамм Escherichia coli КМИЭВ-39А - штамм-антиген.
Изобретение относится к ветеринарной микробиологии, в частности к биотехнологии,
и касается штамма, выделенного от телят, больных колибактериозом, обладающего антигенной активностью, и может быть использовано для конструирования диагностических и
профилактических препаратов при данном заболевании.
Известно, что традиционные штаммы бактерий вида Escherichia coli населяют желудочно-кишечный тракт животных и человека [1, 2].
Известны штаммы Escherichia coli O157 : H7 (или Н), продуцирующие веротоксин и
вызывающие у человека диарею, геморрагический колит до гемолитико-уремического
синдрома (ГУС), диарею и дизентерийно-подобную инфекцию у телят, отечную болезнь
свиней [3].
Известны доминирующие микроорганизмы при острых желудочно-кишечных заболеваниях телят, выделяемые из патологического материала от больных и павших телят в хозяйствах Республики Беларусь [4].
Все штаммы Escherichia coli обладают идентичными культурально-морфологическими
и биохимическими свойствами. Вместе с тем проявляют вариабельность в чувствительности к антибиотикам, вирулентности, иммуногенности.
Эти бактерии растут на всех простых питательных средах. На мясо-пептонном агаре
кишечная палочка образует сочные серо-белые колонии, а при росте на бульоне дает интенсивное помутнение, с образованием на дне обильного серо-белого осадка. На среде
Эндо бактерии образуют колонии красного цвета с металлическим блеском с более интенсивно окрашенным центром.
BY 10886 C1 2008.08.30
Штаммы Escherichia coli проявляют широкую вариабельность биохимических свойств
в отношении многих углеводов и многоатомных спиртов. При сбраживании углеводов образуется пируват, превращающийся в молочную, уксусную и муравьиную кислоты. Глюкоза, лактоза, маннит сбраживаются с образованием кислоты и газа. Сахароза и дульцит
ферментируются непостоянно. Большинство штаммов сбраживает лактозу.
Палочка Escherichia coli не усваивает цитраты, не разжижает желатину, выделяет индол
и не образует сероводород, дает положительную реакцию с метилротом и отрицательную
реакцию Фогес-Проскауэра, редуцирует нитраты в нитриты, непостоянно декарбоксилирует лизин и орнитин, дегидродизирует аргинин. Она не обладает феланилаланиндезаминазой и цитохромоксидазой, являющейся окислительным ферментом. Не растет на средах
с цианистым калием [5].
По морфологическим, ферментативным свойствам разновидности Escherichia coli не
отличаются друг от друга, поэтому решающую роль в идентификации патогенных штаммов Escherichia coli играет определение ее антигенной структуры, в частности фимбриальных адгезинов.
Известны штаммы Escherichia coli, содержащие фимбрии К99. Эти антигены спиралевидной формы с диаметром волокна 4,8 нм имеют изоэлектрическую точку 9,7. Число на
одной клетке - более 100. Состоят из одинаковых повторяющихся белковых субъединиц с
молекулярной массой 18500-19500 [6, 7, 8].
Кроме того, известны фимбриальные адгезины штамма Escherichia coli F41. Белковые
субъединицы этих фимбрий построены из 226 аминокислотных остатков, ее молекулярная
масса 29500 кДа, изоэлектрическая точка 4,6. На поверхности бактериальной клетки фимбрии F41 образуют нитевидные структуры с диаметром волокон 3,2 нм [9].
Опубликованы результаты электронно-микроскопических исследований фимбрий у
штаммов Escherichia coli X93, Y93, Z93, которые подтвердили их наличие и показали, что
они располагаются на поверхности бактериальной клетки перетрихиально в количестве:
Х93 - 100-150 штук, Y93 - 150-200 штук; Z93 - 200-300 штук, а диаметр Х93 - 7-8 нм; Y93 2-3 нм; Z93 - 3-4 нм. Основным структурным компонентом этих фимбриальных адгезинов
являлся белок, содержание его было от 5 до 37,5 г/л (в зависимости от типа). Белок фимбрий различался по молекулярной массе (от 32,0 до 35,0 кДа) и изоэлектрическим точкам
(от 3,0 до 4,3), что обусловлено разным аминокислотным составом и последовательностью в полипептидной цепи [10, 11].
Кроме вышеперечисленных адгезивных фимбриальных антигенов у Escherichia coli
обнаружены новые адгезины CS 1541, CS 31А или AFA, F 165, Att III, F 1987, 2134 Р,
Av24, 20 KB, C1209, F42, F18, отличающихся молекулярной массой субъединиц, их длиной, диаметром, аминокислотным составом, участвующие в патогенезе колибактериоза
животных [12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20].
Известны штаммы Escherichia coli, содержащие фактор патогенности - фимбриальный
адгезин Escherichia coli, описанный как антиген К88 (F4) [21]. С помощью фимбриального
адгезина К88 бактерии прикрепляются к изолированным клеткам кишечника свиньи и человека. Этот штамм способен у кроликов индуцировать выработку антител на 28 день после вакцинации в титре 1 : 121±24,9 [22].
К недостаткам штаммов, содержащих эти антигены, и к недостаткам прототипа следует отнести тот фактор, что в антигенной структуре их содержится узкий спектр специфических белков, комплиментарных возбудителям колибактериоза животных, циркулирующим в определенном регионе Республики Беларусь, что не позволяет использовать их
для конструирования профилактических препаратов, т.к. они не способны в силу отсутствия специфических антигенов, обладающих высокими иммуногенными свойствами, полностью защитить животных от поражения инфекцией - колибактериозом животных,
одним из возбудителей которой является Escherichia coli с адгезивным антигеном Att25.
2
BY 10886 C1 2008.08.30
Задачей, на решение которой направлено заявляемое изобретение, является получение
штамма, пригодного для конструирования диагностических и профилактических препаратов, обладающего высокой иммуногенностью, содержащего в антигенной структуре адгезивный антиген, комплиментарный антигену бактерий Escherichia coli, выделяемых из
патологического материала, т.е. циркулирующего в Республике Беларусь возбудителя колибактериоза животных.
Поставленная задача достигалась тем, что выделили в 1999 году из слизистой тонкого
кишечника десятидневного больного колибактериозом теленка, принадлежавшего колхозу
им. Карла Маркса Светлогорского района Гомельской области, штамм E. coli Att25-A20. В
результате отбора и проведения исследований был селекционирован штамм Escherichia
coli Att25-A20 (КМИЭВ-39А), отличающийся наличием в антигенной структуре адгезивного антигена Att25, идентичного адгезивным антигенам возбудителей колибактериоза
телят в Республике Беларусь.
Наличие этого антигена установлено с помощью реакции агглютинации на стекле с
агглютинирующими антиадгезивными коли-сыворотками.
Штамм бактерий Escherichia coli Att25-A20 (КМИЭВ-39А) - штамм-антиген, депонирован в коллекции РНИУП «Институт экспериментальной ветеринарии им. С.Н.Вышелесского Национальной академии наук Беларуси», и ему присвоен номер КМИЭВ-39А.
Использование штамма Escherichia coli Att25-A20 (КМИЭВ-39А) - штамма-антигена для получения монорецепторной диагностической сыворотки или в качестве составной
части противоколибактериозной вакцины позволяет применять его в комплексе мер по
профилактике колибактериоза (эшерихиоза) телят.
Таксонометрическая принадлежность. Согласно определителю бактерий Берджи
Escherichia coli относится к 5-й группе факультативно анаэробных грамотрицательных палочек, подгруппе 1 - семейство Enterobacteriасеае, роду Escherichia, виду Escherichia coli.
Тинкториальные признаки. Данный микроорганизм в мазках, приготовленных
из бульонных и агаровых культур, при окраске по Граму имеет вид тонких коротких
(0,2-0,7×2-4 мкм) грамотрицательных палочек.
Культурально-морфологические признаки. Факультативный анаэроб. Растет в
МПБ, в бульоне на основе перевара Хоттингера с интенсивным помутнением среды и образованием на дне пробирки осадка, легко разбивающегося при встряхивании. Культура
на плотных питательных средах формирует круглые блестящие выпуклые колонии с приподнятым более оптически плотным центром. На среде Эндо бактерия образует колонии
красного цвета с металлическим блеском размером от 0,2 до 0,5 см с более интенсивно
окрашенным центром.
Физиолого-биохимические свойства. На средах, содержащих углеводы и многоатомные спирты, штамм бактерий Escherichia coli Att25-A20 (КМИЭВ-39А) - штаммантиген - ферментирует глюкозу, лактозу, маннит, сорбит, арабинозу, мальтозу, ксилозу,
манозу, дульцит с образованием кислоты и газа, продуцирует индол, не образует сероводород, не разжижает желатину, не утилизирует цитраты, дает отрицательную реакцию
Фогес-Проскауэра, неподвижен.
Антигенный состав. Имеет в своем составе антиген Att25, О-антигены, не типируемые коммерческим набором O-сывороток, Н-антиген.
Чувствительность к антибиотикам. Штамм Escherichia coli Att25-А20 (КМИЭВ39А) - штамм-антиген - чувствителен к канамицину, флюмеквину, спектиномицину (спектаму), мономицину, умеренно устойчив к стрептомицину, устойчив к ампициллину (амписуру), эритромицину (галлимицину), доксициклину, пенициллину, карбенициллину,
олеандомицину, метицилину, линкомицину, кобактану, амоксициллину (ветримоксину),
тетрациклину, левомицетину, гентамицину, окситетрациклину, ристомицину.
3
BY 10886 C1 2008.08.30
Вирулентность, иммуногенность. Штамм Escherichia coli Att25-A20 (КМИЭВ-39А) штамм-антиген - патогенен. При внутрибрюшинном введении 0,5 мл суточной бульонной
культуры вызывает гибель белых мышей массой 14-16 г. Иммуногенность штамма Escherichia coli Att25-A20 (КМИЭВ-39А) - штамма-антигена - составляет 100 %, антигенность - 8,65 ± 0,56 log2.
Условия хранения. Штамм Escherichia coli Att25-A20 (КМИЭВ-39А) - штамм-антиген хранится при + 2…+ 4 °С после лиофильного высушивания в ампулах в течение 2-3 лет, а
также в течение 3-6 месяцев на 0,3 % ПЖА под слоем стерильного вазелинового масла.
Жизнеспособность его поддерживается путем пересева на питательные среды (МПБ и
МПА на основе перевара Хоттингера) 1-2 раза в месяц, при условии хранения при
+ 2…+ 4 °С.
1. Пример выделения. Штамм Escherichia coli Att25-A20 (КМИЭВ-39А) - штаммантиген - патологический материал засевали в пробирки с МПБ. на плотную предварительно подсушенную дифференциально-диагностическую среду Эндо и МПА в чашках
Петри. Для получения скарификата слизистой тонкого отдела кишечника предварительно
удаляли содержимое, скарифицировали концом пастеровской пипетки и растирали шпателем по поверхности среды Эндо следующего состава:
дистиллированная вода
1000,0 мл
питательный агар, сухой
26,5 г
ЭКДА
1,22 г
фуксин основной
0,23 г
сахар молочный (лактоза)
10,7 г
динатрий фосфат
0,48 г
сульфит натрия безводный
0,83 г
натрий углекислый
0,03 г.
pH 7,2 ± 0,2.
Оптимальная температура инкубирования 37 °С.
На элективной среде Эндо через 24 ч образуются круглые средних, иногда мелких
размеров колонии (диаметром 2-4 мм), выпуклые или слегка приподнятые в центре, с
гладкой поверхностью, ровными краями, красного или малинового цвета на агаре Эндо с
наличием или отсутствием металлического блеска.
2. Пример первичной идентификации. Выращенную культуру проверяют на чистоту
роста микроскопией мазков. Культура должна иметь типичный рост на питательных средах и морфологию бактериальных клеток, характерную для E. coli (в мазках).
3. Пример серологической идентификации. Штамм Escherichia coli Att25-A20
(КМИЭВ-39А) - штамм-антиген - применяют РА на стекле с агглютинирующими антиадгезивными коли-сыворотками, вначале с комплексной, а при наличии положительной реакции - с моновалентными сыворотками. Антиген для серологических реакций готовят по
следующей методике: испытуемую культуру, выращенную на скошенном МПА или среде
Минка при температуре 37 °С в течение 18-20 ч, смывают 2-5 мл физиологического раствора. Постановка реакции: каплю диагностической сыворотки наносят на стекло, стерильной пипеткой добавляют каплю испытуемой культуры Escherichia coli Att25-A20
(КМИЭВ-39А) - штамм-антиген, выращенной на скошенном МПА или среды Минка.
Культуры, выросшие в чашках Петри, берут бактериологической петлей и тщательно растирают с сывороткой. Реакцию учитывают визуально при легком покачивании стекла при
температуре 18-28 °С.
При появлении мелкозернистого осадка или хлопьев различной величины с полным
или частичным просветлением сыворотки реакция считается положительной.
Контроли антигена:
а) стабильность - антиген + изотонический раствор натрия хлорида. Реакция отрицательная;
б) специфичность - антиген + нормальная (отрицательная) кроличья сыворотка. Реакция отрицательная.
4
BY 10886 C1 2008.08.30
Культура на МПА или среде Минка, давшая положительную реакцию агглютинации с
моновалентной антиадгезивной сывороткой и имеющая типичные для Escherichia coli
морфологические, тинкториальные и культуральные свойства, считается возбудителем
колибактериоза с антигеном Att25.
4. Пример определения иммуногенных свойств. Штамм Escherichia coli Att25-A20
(КМИЭВ-39А) - штамм-антиген. Штамм культивировали на агаровой питательной среде,
далее смывали стерильным физраствором, доводя до концентрации 10 млрд. микробных
клеток в 1 мл. Инактивировали формалином в конечной концентрации 0,4 %, в качестве
адъюванта добавляли 10 %-ные алюмокалиевые квасцы в количестве 10 % к объему. Далее двукратно, с интервалом 7 дней, иммунизировали белых мышей. Для этого 10 белым
мышам штамм-антиген вводили подкожно в дозе 0,3 мл. Напряженность иммунитета проверяли через 10-14 дней после повторной вакцинации путем внутрибрюшинного заражения 10 вакцинированных и 10 контрольных животных 18-часовой смесью бульонной
культуры штамма Escherichia coli Att25-A20 (КМИЭВ-39А) - штамма-антигена - в тестдозе 0,5 мл. Штамм-антиген считали иммуногенным, если в опытной группе в живых оставалось не менее 70 % животных, при гибели контрольных 90 % и более животных в
течение 10 суток после заражения.
5. Пример определения антигенной активности. Препаратом из штамма Escherichia
coli Att25-A20 (КМИЭВ-39А) - штамма-антигена - иммунизировали по 3 кролика двукратно, с интервалом 10 дней в дозе 5 мл с последующим определением титров специфических антител в РА на полистироловых планшетах.
Таким образом, получен штамм Escherichia coli Att25-A20 (КМИЭВ-39А) - штаммантиген, пригодный для конструирования диагностических и профилактических препаратов, обладающий высокой иммуногенностью 100 %, а в прототипе - 85 % и антигенностью
8,99±0,56 log2, а в прототипе - 6,8 log2. С наличием в антигенной структуре адгезивного
антигена Att25, комплиментарного антигену циркулирующих в Республике Беларусь возбудителей колибактериоза животных, и таким образом способного защитить животных от
поражения инфекцией - колибактериозом, обусловленной Escherichia coli с адгезивным
антигеном Att25.
Источники информации:
1. Определитель бактерий Берджи / Под ред. Дж. Хоулта.- М.: Мир, 1997.- Т. 1. С. 185.
2. Петровская В.Г., Бондаренко В.М. Адгезины энтеротоксигенных кишечных палочек: роль в патогенезе диарей и генетический контроль // ЖМЭИ. - 1990. - № 5. - С. 110117.
3. Куликовский А.В., Панин А.Н., Соснина В.В. Токсигенные эшерихии - актуальная
проблема ветеринарии и медицины // Ветеринария. - 1997. - № 3. - С. 25-27.
4. Курлович Д.В., Карпович В.К. Доминирующие микроорганизмы при острых желудочно-кишечных заболеваниях телят. Ветеринарная наука - производству: Науч. тр. /
БелНИИЭВ.- Мн., 1999. Вып. 34. - С. 146-150.
5. Гутковский А.А., Дворкин Г.Л. Колибактериоз телят и поросят. - Мн.: Ураджай,
1989. - С. 4-6.
6. De Graaf F.K., Klemm P., Gaastra W. Purification characterization and partial covalent
structure of E. coli adhesive antigen K99 // Infect. and Immun. - 1981. - Vol. 33. - P. 877-883.
7. Gaastra W., de Graaf F.K. Host specific fimbrial adhesions of noninvasive enterotoxigenic
E. coli strains // Microbiol. Rev. -1982. - Vol. 46. - № 2. - P. 129-161.
8. Isaacson R.E., Colmenero J., Richter P. E. coli K99 pili ere composed of one Subunit species // FEMS Microbiol. Letters. - 1981. - № 12. - P. 229-232.
5
BY 10886 C1 2008.08.30
9. Капурдова М., Петков М. Получаване, пречиставане и имунохимична характеристика на фимбриален антиген F41 отентерепатогенен щам E. coli. Вет. Сб, 1988. Т. 86,
бр. 6. - С. 34-35.
10. Головко А.Н. Фимбриальные адгезины энтеротоксигенных эшерихий // Ветеринария. - 1993. - № 9. - С. 31-32.
11. Головко А.Н. Способы диагностики и специфической профилактики колибактериоза телят на основе факторов патогенности возбудителя: Дис. д-ра….вет.наук: 16.00.03.Харьков, 1996. - 272 с.
12. A monoclonal antibody identified 2134P fimbriae as adhesins on enterotoxigenic Escherichia coli isolated from postweaning pigs. E.A. Dean-Nystrom, T.A. Casey, R.A. Schneider
e.a. // Vet. Microbiol. - 1993. - Vol. 37. - № 1-2. - P. 101-114.
13. Characterized and uncharacterized adhesins from Escherichia coli isolated from cases of
diarrhoea in calves. P. Pohl, K. van-Muylen, P. Lintermans e.a. // Ann. de-Med. Vet. (Belgium). 1992. - Vol. 136. - № 7. - P. 479-481.
14. Fairbrother J.M., Lariviere S., Johnson W.M. Prevalence of fimbrial antigens and enterotoxins in nonclassical serogroups of Escherichia coli isolated from newborn pigs with diarrhea //
Am. J. Vet. Res. - 1988. - Vol. 49. - № 8. - P. 1325-1328.
15. Isolation and characterization of a new antigen (CS1541) from a porcine enterotoxigenic
Escherichia coli O8:KX105 strain. A. Broes, J.M. Fairbrother, M. Jacques et al. // FEMS Microbiol. Letters. - 1988. - Vol. 55. - № 3. - P. 341-347.
16. Kennan R., Soderlind О., Conway P. Presence of F107, 2134P and Av24 fimbriae on
strains of Escherichia coli isolated from Swedish piglets with diarrhoea // Vet. Microbiol. - 1995. Vol. 43. - № 2-3. - P. 123-129.
17. Korth M.J., Schneider R.A., Moseley S.L. An F41-K88-related genetic determinant of
bovine septicemic Escherichia coli mediates expression of CS31A fimbriae and adherence to
epithelial cells // Infect. Immun. - 1991. - Vol. 59. - № 7. - P. 2333-2340.
18. Nagy B. Vaccination of cows with a K99 extract to protect newborn calves against experimental enterotoxic colibacillosis // Infect. and Immun. - 1980. - Vol. 27, № 1. - P. 21-24.
19. Research note: Avidity of chicken yolk antibodies to enterotoxigenic Escherichia coli
fimbriae. Y. Ikemori, R.C. Peralta, M. Kuroki e.a. // Poultry. Sc. - 1993. - Vol. 72. - № 12. P. 2361-2365.
20. Sequence analysis of the clpG gene, which codes for surface antigen CS31A subunit:
evidence of an evolutionary relationship between CS31A, K88 and F41 subunit genes.
J.P. Girardeau, Y. Bertin, C. Martin e.a. // J. Bacteriol – 1991. - Vol. 173. - № 23. - P. 76737683.
21. Osek J., Truszczynski J. ELISA test for identification of K88 fimbriae in Escherichia coli
strains // Med. Weterynar. - 1995. - Vol. 51. - № 6. - P. 337-340.
22. Пирожков М.К. Биологические препараты для специфической профилактики и терапии эшерихиоза животных: Автореферат дис. д-ра… вет.наук: 16.00.03. - М: ООО «Техполиграфцентр», 2002. - С. 30 (прототип).
Национальный центр интеллектуальной собственности.
220034, г. Минск, ул. Козлова, 20.
6
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
0
Размер файла
112 Кб
Теги
10886, патент
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа