close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Патент BY 15575

код для вставкиСкачать
ОПИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ПАТЕНТУ
РЕСПУБЛИКА БЕЛАРУСЬ
(46) 2012.02.28
(12)
(51) МПК
НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР
ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ
СОБСТВЕННОСТИ
(54)
G 01N 33/50 (2006.01)
СПОСОБ ОЦЕНКИ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ ОПУХОЛИ К
ХИМИОТЕРАПИИ У БОЛЬНОЙ МЕТАСТАТИЧЕСКИМ РАКОМ
МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ
(21) Номер заявки: a 20100194
(22) 2010.02.10
(43) 2011.10.30
(71) Заявитель: Государственное учреждение "Республиканский научно-практический центр онкологии и медицинской радиологии им. Н.Н.Александрова" (BY)
(72) Авторы: Жаврид Эдвард Антонович; Антоненкова Нина Николаевна; Прохорова Виолетта Игоревна;
Лаппо Светлана Владимировна (BY)
(73) Патентообладатель: Государственное учреждение "Республиканский
научно-практический центр онкологии и медицинской радиологии
им. Н.Н.Александрова" (BY)
BY 15575 C1 2012.02.28
BY (11) 15575
(13) C1
(19)
(56) Минимальные клинические рекомендации европейского общества медицинской онкологии (ESMO). - Москва,
2008. - С. 25-37.
ШЕВЦОВА Г.Н. Морфо-биологические маркеры (sFas, интерлейкин-6,
VGEF, Ki-67) при раке молочной железы и их связь с прогнозом заболевания:
Автореферат
диссертации.
Москва, 2002. - С. 10-12, 29-39.
КИМ Е.А. и др. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2008. - Т. 145, № 2. - С. 206-209.
КИМ Е.А. и др. // Вопросы онкологии. 2008. - Т. 54, № 3. - С. 287-293.
СЕМЕНОВА Н.А. и др. // Бюллетень
экспериментальной биологии и медицины. - 2000. - Т. 130, № 7. - С. 102-105.
RU 2341198 C2, 2008.
RU 2094802 C1, 1997.
RU 2099703 C1, 1997.
(57)
Способ оценки чувствительности опухоли к химиотерапии у больной метастатическим раком молочной железы, отличающийся тем, что до и после двух курсов химиотерапии определяют концентрацию сосудистого эндотелиального фактора роста VEGF в
сыворотке крови и по значению концентрации VEGF оценивают чувствительность опухоли к химиотерапии, при этом повышение концентрации VEGF после химиотерапии более
чем на 20 пг/мл указывает на прогрессирование опухолевого процесса, снижение концентрации VEGF более чем на 20 пг/мл - на регрессию опухолевого процесса, а отсутствие
изменений концентрации VEGF - на стабилизацию опухолевого процесса.
Изобретение относится к области медицины, а именно к онкомаммологии, и может
быть использовано для оценки чувствительности опухоли к химиотерапии у больной метастатическим раком молочной железы (РМЖ).
В клинической практике чувствительность опухоли к проводимому лечению у больной раком молочной железы оценивается по данным маммографии, ультразвукового исследования, рентгенографии, компьютерной, магниторезонансной томографии,
BY 15575 C1 2012.02.28
остеосцинтиграфии и др. Вышеперечисленные способы не всегда высокоинформативны,
поскольку не позволяют оценить изменения, происходящие в организме.
В настоящее время определение уровней опухолевых маркеров широко используется в
диагностике, при мониторинге состояния онкологических больных и для доклинического
выявления рецидивов заболевания. К опухолевым маркерам относится большая группа
биологически активных веществ, концентрация которых в сыворотке зависит от развития
злокачественного процесса. Они представляют собой макромолекулы, в основном белки с
углеводными или липидными компонентами. Часть опухолевых маркеров секретируется в
кровь, благодаря чему их концентрацию можно определить с помощью иммуноферментного анализа. В настоящее время известно около 200 соединений, относящихся к опухолевым маркерам при различных локализациях рака, однако диагностическую значимость
имеют только несколько онкопротеинов.
Наиболее диагностически значимыми являются простат-специфический антиген при
раке предстательной железы, раково-эмбриональный антиген при раке толстой кишки,
карбогидратный антиген СА-153 при раке молочной железы, CA-125 при раке яичников,
β-хорионический гонадотропин при хорионкарциноме и альфа-фетопротеин при герминогенных опухолях.
Учитывая, что важную роль в развитии злокачественных новообразований играют
факторы роста, стимулирующие развитие новых сосудов в опухоли, внимание в последние годы уделяют исследованию содержания сосудистого эндотелиального фактора роста
(VEGF) в биологических средах.
VEGF - один из членов семейства структурно близких между собой белков, которые
являются лигандами для семейства рецепторов VEGF. Сосудистый эндотелиальный фактор роста влияет на развитие новых кровеносных сосудов (ангиогенез) и выживание незрелых кровеносных сосудов, связываясь с двумя близкими по строению мембранными
тирозинкиназными рецепторами (рецептором-1 VEGF и рецептором-2 VEGF) и активируя
их. Эти рецепторы экспрессируются эндотелиальными клетками кровеносных сосудов.
Связывание VEGF с этими рецепторами запускает сигнальный каскад, который в конечном итоге стимулирует рост клеток эндотелия сосуда, их пролиферацию. Эндотелиальные
клетки участвуют в таких разнообразных процессах, как вазоконстрикция и вазодилатация, презентация антигенов, а также служат очень важными элементами всех кровеносных
сосудов (капилляров, вен и артерий). Таким образом, стимулируя эндотелиальные клетки,
VEGF играет центральную роль в процессе ангиогенеза.
Экспрессия VEGF стимулируется множеством проангиогенных факторов, включая
эпидермальный фактор роста, основной фибробластный фактор роста, тромбоцитарный
фактор роста и интерлейкин-1β. Кроме того, уровни VEGF непосредственно регулируются
такими факторами окружающей среды, как pH, давление и концентрация кислорода. Общее влияние этих различных факторов заключается в опосредованной через VEGF стимуляции важных для ангиогенеза факторов, включая антиапоптотические белки, молекулы
клеточной адгезии и металлопротеиназы.
Все эти процессы потенциально важны для патогенеза злокачественных новообразований.
В отсутствие сосудистой сети опухоли остаются мелкими (1-2 мм). Злокачественные
опухоли подвергаются "ангиогенному переключению", что нарушает баланс между про- и
антиангиогенными факторами обычно благодаря усилению секреции факторов роста.
Многие онкопротеины, а также низкий pH и низкие концентрации кислорода, обнаруживающиеся в опухоли, стимулируют экспрессию VEGF, который затем активирует экспрессию других звеньев ангиогенеза, таких как металлопротеиназы и молекулы клеточной
адгезии. Тем самым VEGF действует как ключевой медиатор опухолевого ангиогенеза,
стимулируя рост новых кровеносных сосудов из близлежащих капилляров и давая опухо-
2
BY 15575 C1 2012.02.28
ли доступ к кислороду и питательным веществам, в которых она нуждается для своего роста и метастазирования.
При многих видах опухолей усиление экспрессии VEGF коррелирует с неблагоприятным прогнозом, в том числе с агрессивным ростом опухоли, рецидивами, метастазированием и уменьшением выживаемости больных. Кроме того, экспрессия VEGF коррелирует
с повышением плотности микрососудистой сети в опухоли, что само по себе служит индикатором прогноза при различных онкологических заболеваниях [1]. Однако следует отметить, что в литературе не встречалось работ, позволяющих оценить лечебный эффект в
динамике по определению концентрации VEGF. В этой связи актуальным остается поиск
высокочувствительных диагностических способов, которые позволят оценить чувствительность опухоли к химиотерапии у больных с метастатическим раком молочной железы.
Известен способ оценки чувствительности опухоли к химиотерапии у больной раком
молочной железы с помощью маммографии - рентгеновского исследования молочной железы [2]. Маммография позволяет определить наличие изменений в тканях молочной железы и оценить их размеры, характер, распространенность. Однако у больных, у которых
возврат болезни наступил после ранее проведенного радикального лечения, этот способ не
приемлем. Иногда при маммографическом исследовании опухолевые изменения не определяются в толще ткани железы. Такие результаты маммографии называются ложноотрицательными. В связи с этим для оценки чувствительности опухоли к проводимому
лечению необходимо сочетать маммографическое исследование с другими способами диагностики. Таким образом, маммография не является идеальным способом диагностики и
оценки лечебного эффекта при данной форме заболевания. Еще существенным недостатком данного способа является рентгеновское излучение, которое не безопасно для здоровья больной.
Известен способ оценки чувствительности опухоли к химиотерапии у больной раком
молочной железы с метастатическим поражением костей по результатам остеосцинтиграфии [3]. С помощью этого способа оценивают интенсивность деструктивно-репаративных
процессов в костной ткани. Сущность способа состоит в том, что больной раком молочной железы внутривенно вводят радиофармпрепарат - технеций. Этот изотоп обладает
свойством избирательно накапливаться в тканях (ткани, пораженные опухолью, накапливают препарат более интенсивно в сравнении со здоровыми). Однако данный способ также имеет недостатки: - не всегда информативен и для подтверждения метастического
поражения костей необходимо выполнение рентгенографии областей скелета, в которых
зафиксировано патологическое накопление радиофармпрепарата, - метод не безопасен для
здоровья больной при использовании его с целью оценки лечебного эффекта чаще 1 раза в
6 месяцев.
Наиболее близким к предлагаемому изобретению по технической сущности и достигаемому эффекту является способ оценки чувствительности опухоли к химиотерапии у пациенток, раком молочной железы по
уровню изменений концентраций
опухолеассоциированного антигена CA-153 [4]. Данный способ принят нами в качестве
прототипа.
Суть способа состоит в определении концентрации опухолеассоциированного антигена CA-153 в сыворотке крови больной раком молочной железы до начала лечения и в процессе химиотерапии. Исследование уровня в сыворотке крови данного онкопротеина
используют для мониторинга и эффективности химиотерапии. Два последовательных повышения концентраций маркера в сыворотке крови указывают на прогрессирование заболевания и служат основанием для прекращения проводимой терапии или ее изменения.
После начала химиотерапевтического лечения может отмечаться временное повышение
уровня CA -153 в сыворотке, достигающее пика и заканчивающееся в течение 6-12 недель
после начала терапии. Увеличивающаяся концентрация CA -153 в сыворотке крови может
3
BY 15575 C1 2012.02.28
указывать и на развитие отдаленных метастазов у больных раком молочной железы без
соответствующих клинических симптомов.
Вместе с тем прототип имеет следующие недостатки:
не существует единого мнения о клинически значимом повышении концентрации CA153 при раке молочной железы;
маркер CA-153 не является определяющим фактором при оценке чувствительности
опухоли к химиотерапии у больной раком молочной железы.
Задача: разработать высокоинформативный способ оценки чувствительности опухоли
к химиотерапии у больной метастатическим раком молочной железы.
Решение поставленной задачи достигают тем, что у пациентки, метастатическим раком молочной железы до начала проведения химиотерапии и после двух ее курсов определяют в сыворотке крови концентрации сосудистого эндотелиального фактора роста и по
его значению оценивают чувствительность опухоли к химиотерапии.
Способ осуществляют следующим образом.
У пациентки с РМЖ берут венозную кровь. Венозная кровь, полученная в пробирки
без антикоагулянтов (можно использовать вакуумные пробирки с красными крышками),
остается при комнатной температуре 15-25 °С в течение 30 минут до полного образования
сгустка. После ретракции сгустка пробы центрифугируют при 3000 об/мин в течение
15 минут при комнатной температуре 15-25 °С. После центрифугирования отбирают сыворотку крови. Образцы могут храниться в холодильнике при температуре +2 - + 8 °С не более суток. Для более длительного хранения образцы необходимо заморозить (–20 - –70 °С).
Чем больше срок хранения образца, тем ниже должна быть температура. Многократное
замораживание и оттаивание недопустимо. После оттаивания (t +37 °С в водяном термостате) пробирку с пробой нужно тщательно перемешать до достижения гомогенности раствора. Образцы не должны содержать видимых глазом включений, нитей, агрегатов; такие
образцы следует предварительно центрифугировать.
Исследование концентрации VEGF в сыворотке крови проводят с помощью стандартных наборов для иммуноферментного анализа в соответствии с инструкцией производителя. Принцип используемого способа основан на неконкурентном гетерогенном
иммуноферментном анализе для определения антител и антигенов методом "сэндвич".
При определении антител в качестве иммуносорбента выступает антиген.
На твердой поверхности пластиковой лунки (микропланшета) сорбированы антитела,
специфичные для определения VEGF. В лунку вносят сыворотку крови больной. Исследуемый антиген связывается в ходе инкубации с антителом, сорбированным на планшете.
Несвязывающиеся компоненты удаляют отмыванием. В лунку вносят конъюгат, который
представляет собой антитело, меченое ферментом. Если в ячейке имеются образовавшиеся на первой стадии процесса иммунные комплексы, то конъюгат соединяется с определенными антигенами и образуется тройной комплекс - "сэндвич". Несвязавшаяся часть
конъюгата остается в жидкой фазе и удаляется отмыванием. В лунку добавляют субстратно-хромогенный реагент, который под влиянием фермента конъюгата превращается в
окрашенный продукт реакции.
Количество тестируемых антигенов оценивают по измерению оптической плотности
окрашенного продукта реакции при длине волны 450 нм. Строят калибровочную зависимость и проводят определение концентрации тестируемых антигенов в крови больной.
Концентрация определяемого вещества прямо пропорциональна интенсивности окраски
пробы и, следовательно, измеренной оптической плотности.
Диапазон референтных значений по коммерческим наборам для VEGF составляет
40-500 пг/мл (среднее значение - 270 пг/мл). В соответствии с рекомендациями компаниипроизводителя каждая лаборатория устанавливает свои собственные референтные значения исследуемого показателя.
4
BY 15575 C1 2012.02.28
В РНПЦ OMP им. H.H. Александрова для исследования концентрации VEGF в сыворотке крови используют коммерческие наборы "Human VEGF ELISA" (DRG International,
Inc. USA). Измерения производят на автоматическом анализаторе Brio-Sirio "Seac". Определение концентрации VEGF проводят в динамике у больных РМЖ. Референтные значения содержания VEGF в сыворотке крови получены в результате обследования 30
клинически здоровых женщин в возрасте 30-65 лет. Стандартные образцы, образцы для
контроля качества, образцы сыворотки крови клинически здоровых лиц и больных РМЖ
до и после химиотерапии помещают в лунки микропланшета, на поверхности которых
сорбированы антитела, специфичные для определения VEGF. Инкубируют 2 часа при
комнатной температуре и постоянном встряхивании. Затем в лунки вносят биотилированные моноклональные антитела и стрептаведин пероксидазу хрена и вновь инкубируют 2
часа при комнатной температуре. После каждого этапа инкубации проводят 4-кратную
отмывку буфером. Ферментную активность пероксидазы измеряют в присутствии TMB
(Tetramethylbenzidine). Через 30 минут после добавления TMB реакцию останавливают
стоп-раствором. Измерение проводят на автоматическом ридере при длине волны 450 нм.
Расчет концентрации VEGF в сыворотке крови проводят по калибровочной кривой и выражают в пг/мл.
В результате проведенного нами исследования установлено, что диапазон референтных
значений для VEGF составляет от 12,2 до 350,0 пг/мл (среднее значение 141,0 ± 15,1 пг/мл).
У пациенток с метастатическом раком молочной железы исходный уровень VEGF в сыворотке крови составляет от 280 до 443,1 пг/мл.
После проведенных двух курсов химиотерапии у части больных концентрация VEGF
в сыворотке крови снижается, у других повышается или практически не изменяется. После проведенной математической обработки установлено, что о прогрессировании опухолевого процесса в процессе лечения свидетельствует повышение уровня VEGF более чем
на 20 пг/мл, уменьшение более чем на 20 пг/мл - о регрессии, неизменившаяся концентрация VEGF позволяет судить о стабилизации заболевания.
Основными отличительными признаками заявляемого способа являются:
простота способа позволяет использовать его в амбулаторных условиях, не требует
госпитализации больной;
для оценки чувствительности опухоли к химиотерапии у больной раком молочной железы используют биохимический онкопротеин VEGF.
Преимущества заявляемого способа:
отсутствие нежелательных побочных эффектов, которые встречаются при использовании других способов с целью оценки чувствительности опухоли к проводимому лечению;
способ информативен при применении у больной метастатическим раком молочной
железы.
Способ иллюстрируется следующими примерами.
Пример 1
Больная Ц.H.С., 1956 года рождения, амбулаторная карта № 5505/06. Находилась на
лечении в РНПЦ OMP им. Н.Н. Александрова в 2006 году с диагнозом рак правой молочной железы, субтотальное поражение, метастазы в подмышечных лимфатических узлах
справа pT4bN3M0 G2 IIIc стадия, состояние после комплексного лечения. В 2009 году диагностированы метастазы в левой молочной железе, подмышечных, надключичных лимфатических узлах слева, яичниках. Выполнена двусторонняя овариэктомия. Проведены 2
курса монохимиотерапии по схеме паклитаксел. По данным ультразвукового обследования размеры метастазов в молочной железе и лимфатических узлах незначительно
уменьшились.
Определена концентрация VEGF в сыворотке крови: 280 пг/мл. Проведено еще 2 курса химиотерапии по ранее проводимой схеме. По данным ультразвукового исследования
зарегистрировано увеличение размеров подмышечного лимфатического узла слева в 2 ра5
BY 15575 C1 2012.02.28
за (более чем на 25 %) в сравнении с исходными данными. Концентрация VEGF в сыворотке крови после проведенного лечения составила 331,3 пг/мл. Уровень VEGF в крови
больной метастатическим раком молочной железы увеличился на 51,3 пг/мл (прогрессирование).
Пример 2
Больная M.О.M., 1978 года рождения, амбулаторная карта № 802/07. В 2007 году на
базе онкомаммологического отделения РНПЦ OMP им. Н.Н. Александрова проведено
комплексное лечение по поводу рака левой молочной железы pT2N0M0 G2 IIа стадии. В
2009 году по данным компьютерной томографии диагностированы метастазы в мягких
тканях грудной клетки слева с врастанием в грудину, левое легкое, единичные метастазы
в легких.
Уровень VEGF до начала лечения по поводу метастатического процесса 443,1 пг/мл.
После проведенных двух курсов лечения по схеме паклитаксел + трастузумаб концентрация VEGF в сыворотке крови снизилась на 22,7 пг/мл и составила 420,4 пг/мл. По данным
компьютерной томографии зарегистрирована выраженная положительная динамика - размеры метастазов в мягких тканях грудной стенки и легких значительно (более чем на
50 %) уменьшились (регрессия).
Пример 3
Больная П.С.А., 1956 года рождения, амбулаторная карта № 10416/07. В 2007 году
проведено комплексное лечение по поводу местно-распространенного нерезектабельного
опухолевого процесса правой молочной железы с метастазами в подмышечных, шейных
лимфатических узлах справа pT2N1M0 G2 IV стадия, достигнута ремиссия. Затем в 2009
году рост опухоли в правой молочной железе возобновился.
Определена концентрация VEGF в сыворотке крови - 368 пг/мл. Проведено 2 курса
полихимиотерапии по схеме паклитексел + доксорубицин. По данным ультразвукового исследования при сравнении с предыдущими данными существенной динамики не отмечено.
Концентрация VEGF в процессе лечения практически не изменилась и составила
368,94 пг/мл (стабилизация).
Таким образом, с помощью заявленного способа представляется возможным оценить
чувствительность опухоли к химиотерапии у больной метастатическим раком молочной
железы.
Источники информации:
1. Medi.ru - подробно о лекарствах. Справочник лекарств для врачей [Электронный
ресурс]. - 2006. - Режим доступа: http://www.medi.ru/doc/2221202.htm. - Дата доступа:
14.12.2009.
2. Маммография - достоинства и недостатки // Европейское качество лечения [Электронный ресурс]. - 2008. - Режим доступа: http://mammalogy.eurodoctor.ru/mammography/ Дата доступа 14.12.2009.
3. Сцинтиграфия - сканирование костной системы // Европейское качество лечения
[Электронный ресурс]. - 2008. - Режим доступа: http://mammalogy.eurodoctor.ru/breastcancerdiagnostics/scanningbones/ - Дата доступа 14.12.2009.
4. Тюляндин А.С., Носов Д.А., Переводчикова Н.И. Минимальные клинические рекомендации Европейского Общества Медицинской Онкологии (ESMO). - М.: Издательская
группа РОНЦ им.Н.Н. Блохина, 2009. - С. 42 (прототип).
Национальный центр интеллектуальной собственности.
220034, г. Минск, ул. Козлова, 20.
6
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
0
Размер файла
111 Кб
Теги
15575, патент
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа