close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Патент BY 12996

код для вставкиСкачать
ОПИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ПАТЕНТУ
РЕСПУБЛИКА БЕЛАРУСЬ
(46) 2010.04.30
(12)
(51) МПК (2009)
НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР
ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ
СОБСТВЕННОСТИ
(54)
G 01N 33/487
СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПОЛЯРНОСТИ ОКРУЖЕНИЯ 1АНИЛИНО-8-НАФТАЛИНСУЛЬФОНОВОЙ КИСЛОТЫ В
РАЗВЕДЕННОЙ СЫВОРОТКЕ КРОВИ
(21) Номер заявки: a 20071506
(22) 2007.12.06
(43) 2009.08.30
(71) Заявитель: Государственное учреждение "Республиканский научнопрактический центр гигиены" (BY)
(72) Автор: Ткачев Сергей Викторович
(BY)
BY 12996 C1 2010.04.30
BY (11) 12996
(13) C1
(19)
(73) Патентообладатель: Государственное
учреждение "Республиканский научно-практический центр гигиены" (BY)
(56) CHAO C. et al. Proc. Natl. Acad. Sci.
USA.- 1997.- V. 94.- P. 2969-2974.
RU 99113486 A, 2001.
КУДРЯШОВА Е.В. и др. Успехи биологической химии, 2002. Т. 42.- С.
257-272.
КОПЬЕВ П.С. и др. Письма в ЖЭТФ,
1990. Т. 51. Вып. 12.- С. 624-626.
(57)
Способ определения полярности окружения 1-анилино-8-нафталинсульфоновой кислоты (1,8-АНС) в разведенной сыворотке крови, заключающийся в том, что регистрируют стоксов сдвиг флуоресценции 30 мкМ-ного раствора 1,8-АНС в 0,1 %-ном растворе
сыворотки крови, приготовленном на водном 0,2М Tris-HCl буфере рН 7,4, в кювете с
длиной оптического пути 10 мм при размере щелей монохроматоров возбуждения и испускания 2 нм и температуре 21 °С и рассчитывают полярность окружения y в условных
единицах 1,8-АНС в разведенной сыворотке крови по формуле:
y = -0,00231 + 4,96⋅10-5x,
где х - значение стоксова сдвига, см-1.
Изобретение относится к биофизике и биохимии, в данном случае к разделам биофизики и биохимии белка, а также к разделу клинической-лабораторной диагностики.
Известен способ оценки полярности окружения 1-анилино-8-нафталинсульфоновой
кислоты (1,8-АНС), заключающийся в измерении сдвига максимума испускания флуоресцентного зонда - 1,8-АНС в зависимости от изменения полярности места его связывания
[1]. Указанный способ является прототипом по отношению к заявляемому. Общим признаком для заявляемого способа и прототипа является использование в оценке полярности
поверхности белков 1,8-АНС. Недостатком данного способа является то, что он обладает
низкой точностью и дает приблизительные значения изменения полярности белка.
Задачей заявляемого изобретения является повышение точности и чувствительности
за счет выявления зависимости между полярностью окружения зонда и стоксовым сдвигом его флуоресценции.
BY 12996 C1 2010.04.30
Поставленная задача достигается следующим образом: предложен способ определения
полярности окружения 1,8-АНС в разведенной сыворотке крови, заключающийся в том,
что регистрируют стоксов сдвиг флуоресценции 30-мкМ-ного раствора в 0,1 %-ном растворе сыворотки крови, приготовленном на водном 0,2М Tris-HCl буфере pH 7,4, в кювете
с длиной оптического пути 10 мм при размере щелей монохроматоров возбуждения и испускания 2 нм и температуре 21 °С и рассчитывают полярность окружения у в условных
единицах 1,8-АНС в разведенной сыворотке крови по формуле:
(1)
у = -0,00231 + 4,96×10-5х,
-1
где х - значения стоксова сдвига, см .
В основе разработанного метода лежит измерение стоксова сдвига флуоресценции в
органических растворителях различной полярности. В результате измерений, получаем
зависимость стоксова сдвига флуоресценции 1,8-АНС от полярности растворителя. Выявленная зависимость позволяет определить полярность неисследованного окружения 1,8АНС, поскольку спектральные характеристики зонда 1,8-АНС зависят от полярности его
окружения. Учитывая, что специфические взаимодействия (типа водородных связей) между растворителем и 1,8-АНС не оказывают существенного влияния на изменение спектральных
характеристик
хромофора,
эта
зависимость
будет
обусловлена
неспецифическими взаимодействиями между дипольным моментом 1,8-АНС и растворителем, влияющим на разность энергий основного и возбужденного состояний 1,8-АНС, и
она описывается уравнением Липперта [2]
2∆f µ∗ − µ
νa − νf =
+ const ,
hca 3
где h - постоянная Планка, с - скорость света, а - радиус полости, в которой находится
хромофор, νa и νf - волновые числа, отвечающие положению максимумов спектров по-
(
)
глощения и флуоресценции соответственно, µ∗ и µ - дипольные моменты молекулы флуорофора в возбужденном и основном состояниях соответственно. Параметр ∆f называется
ориентационная поляризуемость. Он связан с диэлектрической (ε) проницаемостью среды
и коэффициентом преломления (n) соотношением
ε −1
n2 −1
(1)
∆f =
.
− 2
2ε + 1 2n + 1
Основной вклад в спектральные сдвиги флуорофора вносит переориентация диполей
ε −1
. В
молекул растворителя, которая характеризуется первым членом уравнения (1)
2ε + 1
свою очередь полярность растворителя определяется величиной дипольного момента молекул растворителя: чем он больше, тем сильнее полярность. В табл. 1 приведены значения ε и ∆f для неполярного растворителя гексана и полярного растворителя метанола. Для
гексана, не имеющего дипольного момента, переориентации молекул растворителя относительно возбужденного флуорофора не происходит. В данном случае ориентационная
поляризуемость (∆f), как функция дипольного момента растворителя, будет иметь небольшое значение. В противоположность этому полярный растворитель, метанол, обладает более высоким значением ε и, как следствие, более высоким значением ∆f [2, 4].
Таблица 1
∆f
ε
Гексан
1,874
0,0011
Метанол
32,6
0,3083
Исходя из вышеизложенного, ориентационная поляризуемость (∆f) раствора может
быть рассмотрена как параметр, характеризующий полярность среды [2]. Таким образом,
Растворители
2
BY 12996 C1 2010.04.30
построение зависимости ∆v = f(∆f) может быть использовано для определения полярности
окружения зонда [2].
Пример 1.
В качестве растворителей с различной полярностью используют бутанол и метанол, а
также 5, 10, 50 и 80 % растворы метанола в бутаноле. Взаимодействие растворителей и
АНС оценивают с помощью графика Липперта, иллюстрирующего зависимость ∆v = f(∆f).
Для бутанола и метанола ε соответственно 17,7 и 32,6; n соответственно 1,397 и 1,329 [3].
Для растворов с различным содержанием компонентов ε и n рассчитывают по формулам:
(ν )
(ν )
ε = ∑ εi ωi
и n = ∑ n i ωi , где εi и ni соответственно диэлектрическая постоянная и поi
i
казатель преломления компонентов (i) раствора, a ωi (ν ) - их объемная доля в растворе.
Ориентационную поляризуемость растворов рассчитывают по формуле 1.
В работе используют аммониевую соль 1-анилино-8-нафталинсульфоновой кислоты
("Fluka", Германия) в конечной концентрации 30 мкМ, метанол и бутанол отечественного
производства классификации ЧДА. Спектры поглощения и испускания 1,8-АНС записывают на спектрофлуориметре СМ 2203 (ЗАО "Солар", РБ) в кварцевой кювете с длиной
оптического пути 10 мм, при постоянной температуре 21 °С, размер щелей монохроматора возбуждения и испускания - 2 нм.
В табл. 2 приведены значения стоксова сдвига флуоресценции 1,8-АНС в зависимости
от полярности среды. Как видно из данных таблицы, с увеличением полярности окружения 1,8-АНС, максимум испускания сдвигается в красную область, также увеличивается
стоксов сдвиг флуоресценции 1,8-АНС.
Таблица 2
Растворители
Стоксов сдвиг, см∆f
100 % бутанол
0,2647
5376
95 % бутанола + 5 % метанола
0,2675
5423
90 % бутанола + 10 % метанола
0,2702
5514
50 % бутанола + 50 % метанола
0,2889
5873
20 % бутанола + 80 % метанола
0,3008
6135
100 % метанол
0,3083
6221
Фигура иллюстрирует зависимость спектрального сдвига свечения 1,8-АНС от изменения полярности растворителя (график Липперта), где по горизонтали - стоксов сдвиг
для 1,8-АНС в растворах различной полярности, см-; по вертикали - значения ориентационной поляризуемости для метанола, бутанола и их растворов, усл.ед. Как видно из фигуры, полученная экспериментальная зависимость аппроксимируется линейной функцией и
может быть выражена уравнением линейной регрессии:
(1),
у = -0,00231 + 4,96×10-5х
где х - значения стоксова сдвига, полученное экспериментально, у - искомое значение полярности окружения зонда. Таким образом, зная стоксов сдвиг 1,8-АНС можно рассчитать
полярность его окружения. Например, экспериментально найденные значения стоксова
сдвига флуоресценции 1,8-АНС в сывороточных альбуминах человека и быка составляют
соответственно 5430 и 5450 см-, следовательно полярность окружения 1,8-АНС в этих
белках, рассчитанная по уравнению 1, составит соответственно 0,267 и 0,268 усл.ед.
Пример 2.
Настоящий пример иллюстрирует возможность применения описанного способа для
оценки полярности окружения 1,8-АНС в белке при изучении влияния алкидной эмали и
ее компонентов при их ингаляционном поступлении в организм крыс.
Используют беспородных крыс-самок массой 170-210 г. Ингаляционную затравку
крыс проводят паровоздушным аэрозолем пентафталевой эмали ПФ-115 и ее основных
компонентов - лака ПФ-060 и растворителя нефрас С4 150/200 на протяжении 4 часов
3
BY 12996 C1 2010.04.30
ежедневно, в течение 3 дней. После прекращения ингаляций крыс декапитируют под
эфирным наркозом. Собирают вытекающую из шейных сосудов кровь. Сыворотку крови
отделяют от форменных элементов путем центрифугирования (10 мин, 3000 об/мин). Все
измерения флуоресценции проводят при условиях (температура, длина оптического пути,
конечная концентрация 1,8-АНС), указанных в примере 1. Флуоресценцию 1,8-АНС регистрируют в 0,1 % растворе сыворотки крови. Растворы 1,8-АНС и сыворотки крови готовят на водном 0,2М TrisHCl буфере (pH - 7,4).
В табл. 3 приведены значения стоксова сдвига флуоресценции 1,8-АНС в зависимости
от степени полярности окружения, определяемого как ∆f. Как видно из данных таблицы, с
увеличением полярности окружения 1,8-АНС, максимум испускания сдвигается в красную область, также увеличивается стоксов сдвиг флуоресценции 1,8-АНС.
Таблица 3
Стоксов сдвиг 1,8-АНС в Значения ∆f рассчитанные
Экспериментальные группы
сыворотке крови крыс, смпо уравнению (1)
Интактные крысы
5376
0,2647
Крысы затравленные эмалью
5423
0,2675
ПФ-115
Крысы затравленные лаком
5514
0,2702
ПФ-060
Крысы затравленные нефрас
5873
0,2889
С4 150/200
На основании полученного уравнения линейной регрессии (пример 1) и спектральных
характеристик 1,8-АНС в сыворотке крови крыс можно рассчитать значения ∆f для окружения зонда в белках сыворотки крови. У интактных крыс значение ∆f составляет 0,2647,
для крыс, затравленных эмалью, лаком и растворителем - 0,2675, 0,2702 и 0,2889 соответственно, т.е. ингаляционное воздействие сопровождается изменением полярности окружения зонда на более гидрофобное.
Таким образом, достигаемый технический результат заявленного способа заключается
в возможности в принятых физико-химических терминах количественно оценить величину полярности неисследованного окружения 1,8-АНС по известному значению стоксова
сдвига флуоресценции 1,8-АНС, а также предсказать стоксов сдвиг флуоресценции 1,8АНС в известном растворителе по величине его полярности.
Данный способ расширяет возможности исследований структуры белка и дает дополнительный критерий оценки его физико-химического состояния. Способ может использоваться в научных лабораториях для оценки модификаций структуры белка, в том числе и
при патологических состояниях. Способ прост, не требует значительных финансовых затрат на его осуществление и позволяет повысить точность и качество исследований, что в
свою очередь сокращает финансовые расходы по контролю за качеством белоксодержащей продукции.
Источники информации:
1. Chao С., Ma Y., Stadtman E.R. Modification of protein surface hydrophobicity and methionine oxidation by oxidative systems // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 1997. - Vol. 94. - № 7. P. 2969-2974.
2. Лакович Дж. Основы флуоресцентной спектроскопии. - М.: Мир, 1986. - 496 с.
3. Рабинович В.А., Хавин З.Я. Краткий химический справочник. - Л.: Химия, 1978. 392 с.
4. Химическая энциклопедия. - М.: Советская энциклопедия: Гл. редактор И.Л. Кнунянц, 1988. - Т. 2, 4.
4
BY 12996 C1 2010.04.30
Национальный центр интеллектуальной собственности.
220034, г. Минск, ул. Козлова, 20.
5
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
0
Размер файла
120 Кб
Теги
12996, патент
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа