close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Патент BY 04621

код для вставкиСкачать
ОПИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ПАТЕНТУ
РЕСПУБЛИКА БЕЛАРУСЬ
(19)
BY (11) 4621
(13)
C1
(51)
(12)
7
G 01N 33/50,
G 01N 33/53
НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР
ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ
СОБСТВЕННОСТИ
(54)
СПОСОБ ОЦЕНКИ ИММУНОМОДУЛИРУЮЩЕЙ АКТИВНОСТИ
ХИМИЧЕСКИХ И ФИЗИЧЕСКИХ СРЕДСТВ
(21) Номер заявки: a 19980256
(22) 1998.03.17
(46) 2002.09.30
(71) Заявитель:
Витебский
государственный
медицинский институт (BY)
(72) Автор: Новикова И.А. (BY)
(73) Патентообладатель:
Витебский
государственный медицинский институт (BY)
(56)
SU 1704084 A1, 1992, WO 93/08470 A1, 1993, EP 0539610 A1, 1993.
(57)
Изобретение относится к области медицины, точнее к клинической иммунофармакологии, и может быть
использовано в экспериментальной и клинической медицине для поиска иммуноактивных агентов и подбора
средств для иммуномодулирующей терапии.
Предлагаемый способ существенно повышает чувствительность, информативность и точность определения иммуноактивных свойств препаратов.
Отличительным признаком предлагаемого способа является обработка тестируемым средством не всей
суспензии лейкоцитов, а 1/5 части, с последующим удалением иммуномодулятора и оценкой его отсроченного эффекта на иммунологические параметры в условиях сокультивирования обработанных иммуномодулятором и интактных клеток по сравнению с клетками, культивированными в среде.
Изобретение относится к медицине, точнее к клинической иммунофармакологии, и может быть использовано в экспериментальной и клинической медицине для поиска иммуноактивных средств и подбора иммуномодулирующей терапии.
Известны способы тестирования иммуномодулирующей активности химических и фармакотерапевтических средств, использующие в качестве тест-системы культуру лимфоцитов или лейкоцитов крови, которые
обрабатывают тестируемым препаратом определенный промежуток времени и оценивают их непосредственную реакцию на испытуемое средство [1, 2].
В зависимости от направления обнаруживаемого эффекта препарат квалифицируется как иммуностимулятор или иммунодепрессант. Недостатком использования такой модельной системы является ее значительная условность. Во-первых, такой способ позволяет определять лишь эффект препарата на отдельное звено
иммунологической реактивности, но не учитывает сложную систему межклеточных взаимодействий, а следовательно не позволяет судить о конечном эффекте препарата. В итоге эффект in vitro не совпадает с таковым in vivo, а применение выбранного препарата может усилить дисбаланс иммунной системы. Во-вторых, в
данной модели не учитывается, что препарат может не оказывать непосредственного немедленного эффекта,
но выступать индуктором синтеза цитокинов (или их антагонистов), приводя к определенным изменениям
всей популяции клеток.
Предполагаемое изобретение устраняет вышеуказанные недостатки, существенно повышает чувствительность, информативность и точность определения иммуноактивных свойств препаратов.
Предлагаемый способ оценки иммуномодулирующей активности предусматривает, что обработке иммуномодулятором подвергается не вся клеточная культура, а лишь 1/5 часть ее (так называемые модифицированные клетки), а затем, после удаления иммуномодулятора, производится совместное культивирование
модифицированных и интактных лимфоцитов в аутологичной смешанной культуре. После инкубации не менее 2 ч сравнивают выбранные (любые) параметры клеток в опытной культуре по сравнению с контрольной
(инкубация клеток в среде), и по их изменению судят об эффекте иммуномодулятора.
BY 4621 C1
Обоснованием использования подобной клеточной модельной системы является гипотеза, смысл которой
состоит в том, что для оптимального проявления эффекта препаратов в культуре обязательно должны присутствовать как регулирующие (модифицированные), так и отвечающие клетки.
Установлены факты, что иммуномодулирующие фармакотерапевтические (преднизолон, пирогенал, эуфиллин, тималин и др.) и физические (низкоинтенсивный гелий-неоновый лазер, волны миллиметрового
диапазона) средства часто не оказывали эффекта в клеточной системе при сравнении опыта (обработанные
клетки) с контролем (необработанные). В то же время, при использовании в качестве опытной - смеси обработанных и необработанных клеток, а в контроле - необработанных клеток, проявлялся выраженный эффект.
Способ осуществляется следующим образом.
Мононуклеарные клетки периферической крови выделяют из гепаринизированной венозной крови (10 ЕД
гепарина на 1 мл крови) на градиенте плотности фиколла- верографина или используют смесь лейкоцитов,
полученную из крови путем отстаивания. Клетки отмывают от плазмы трижды питательной средой. Готовую
клеточную суспензию разводят до плотности клеток 2,5×106/мл. Исследуемые препараты растворяют накануне в изотоническом растворе хлористого натрия. Готовят несколько разведений препаратов в рабочих
концентрациях, которые подбирают предварительно в реакции лейколизиса на клетках здоровых лиц. В качестве рабочей концентрации используют наименьшее разведение препарата, не оказывающее повреждающего
действия на клетки (жизнеспособность не менее 95 %). На 1 этапе производят обработку клеток иммуномодуляторами, для чего смешивают в лунках планшет для иммунологических реакций 0,2 мл суспензии лимфоцитов с 0,2 мл тестируемого препарата в рабочей концентрации (или с 0,1 мл культуральной среды контроль). Смесь инкубируют в термостате при 37 °С в течение 30 мин. После инкубации клетки отмывают
трижды средой. Осадок клеток разводят в свежей питательной среде до первоначального объема (0,2 мл). На
II этапе приготавливают аутологичную смешанную культуру из обработанных иммуномодулятором (модифицированных) и необработанных (интактных) клеток. Для этого в отдельной пробирке смешивают: в опыте
- 0,1 мл преинкубированных с иммуномодулятором лимфоцитов с 0,4 мл свежих аутоклеток; в контроле - 0,1
мл лимфоцитов, преинкубированных в среде, с 0,4 мл свежих лимфоцитов. Полученную культуру клеток инкубируют не менее 2 ч при 37 °С, а затем используют в иммунологических реакциях, определяя изменение
экспрессии рецепторов, пролиферативной активности лимфоцитов в ответ на митогены (удлиняя срок инкубации до 3 суток) или синтез цитокинов в опытной культуре по сравнению с контрольной.
При этом принцип оценки иммуномодуляторных свойств может быть любым - по изменению экспрессии
рецепторов клеток, их функциональных свойств, синтеза цитокинов и т.д. Основным условием и отличительным признаком предлагаемого метода является оценка отсроченного эффекта тестируемых иммуномодулирующих агентов в условиях взаимодействия (сокультивирования) обработанных иммуномодулятором и
интактных клеток по сравнению с клетками, культивированными в среде.
Пример 1.
Оценка иммуномодуляторного эффекта гелий-неонового лазера и фармакотерапевтических средств по
изменению экспрессии рецепторов лимфоцитов.
У 3 здоровых лиц брали 7-10 мл крови с гепарином (10 ЕД/мл), выделяли из нее мононуклеары по
стандартной методике на фиколл-верографине. Клетки отмывали от плазмы в среде 199 и разводили до рабочей концентрации 2,5×109/л. Для получения модифицированных клеток часть свежевыделенных лимфоцитов обрабатывали иммуномодуляторами в рабочих концентрациях или подвергали воздействию лазерного
облучения (аппарат ЛГН-111, мощность излучения на конце световода 2,6 мВт/см2) в течение 30 мин в бессывороточной среде (контроль - инкубация в среде в аналогичных условиях), а затем трижды отмывали средой 199 и разводили до первоначального объема. Прекультивированные клетки смешивали в соотношении
1:4 с необработанными (интактными) аутологичными клетками. Культуру инкубировали 2 ча при 37 °С.
Сравнивали экспрессию рецепторов к эритроцитам барана и HLA-DR антигенов в смешанной культуре модифицированных и интактных клеток по сравнению с контрольными сокультивированными клетками (инкубация в среде). Экспрессию рецепторов к эритроцитам барана определяли в реакции розеткообразования
общепринятым способом, а экспрессию HLA-DR антигенов оценивали в реакции непрямой иммунофлуоресценции с моноклональными антителами серии ИКО-1. Все варианты опытов ставили в 3 повторностях. Данные по 3 параллелям усредняли. Достоверность различий оценивали по критерию t Стьюдента.
Полученные данные приведены в табл. 1, где также представлены результаты, полученные при использовании известной модельной системы.
2
BY 4621 C1
Таблица 1
Иммуномодулирующий эффект гелий-неонового лазера и фармакотерапевтических средств
на экспрессию рецепторов лимфоцитов в различных тест-системах
Иммуномодулятор
Тималин
(100мкг/мл)
Стафилококковый
анатоксин (10-3)
Преднизолон
(50 мкг/мл)
He-Ne лазер
(2,6 мВт\см2)
Показатель
Контроль
Предлагаемая тест-система
Известная тест-система
Е-РОК
HLA-DR
Е-РОК
HLA-DR
Е-РОК
HLA-DR
Е-РОК
HLA-DR
22,0±2,6
2,8±0,4
19,0±2,5
2,4±0,2
25,0±2,1
2,3±0,7
21,0±1,9
2,4±0,4
44,0±2,1*
2,7±0,3
42,0±5,0*
4,1±0,2*
29,0±3,2
2,8±0,6
35,0±2,5*
5,2±0,2*
25,0±3,1
2,7±0,5
32,0±1,3*
3,2±0,3
24,0±1,4
2,9±0,5
28,0±1,8
3,8±0,2*
Примечание: * - достоверность различий при Р<0,05.
Представленные в таблице данные указывают на наличие иммуностимулирующих свойств у тималина,
стафилококкового анатоксина и гелий-неонового лазера, причем степень изменения изучаемых показателей
в предлагаемой тест-системе значительно выше, чем в известной.
Пример 2.
Оценка иммуномодулирующих свойств препарата при индивидуальном подборе для проведения иммуномодулирующей терапии у больных гнойной хирургической инфекцией.
Получали периферическую кровь больных в количестве 5 мл с гепарином из расчета 10 ЕД/мл крови. Выделяли лейкоциты путем отстаивания крови в термостате в течение 45 мин или чистую популяцию мононуклеаров разделением на градиенте плотности фиколл-верографин. Клетки отмывали от белков плазмы путем
центрифугирования в среде 199 при 1000 об/мин в течение 5 мин. Процедуру повторяли трижды. Готовили
рабочее разведение клеток 2-2,5×109/л в питательной среде. Часть клеток обрабатывали тестируемыми иммуномодуляторами в рабочих концентрациях в течение 30 мин при 37 °С, отмывали от препарата, разводили
до первоначального объема питательной средой и соединяли в соотношении 1:4 с необработанными клетками. В контрольных культурах смешивали клетки, преинкубированные в среде с неинкубированными лимфоцитами (т.н. контроль сокультивированных клеток). Смешанную культуру инкубировали в течение 2 ч при
37 °С, а затем оценивали изменение экспрессии рецепторов. Вычисляли среднюю из 3 параллельных определений. Вычисляли индекс изменения показателя (ИИП) по формуле:
усредненный показатель опыта - показатель контроля
ИИП =
100 %
усредненный показатель контроля
За значимое изменение показателя принимали изменение индекса на 50 % в сторону снижения или увеличения.
Таблица 2
Оценка иммуномодулирующих свойств препаратов для индивидуального подбора
иммунокорректоров у больных гнойной инфекцией
Больные
Тестируемый иммуномодулятор
К.
стафилококковый анатоксин
тималин
Т-активин
стафилококковый анатоксин
тималин
Т-активин
С.
Изменение параметров лимфоцитов экспрессия
Е-РОК экспрессия HLA-DR
стимуляция 84 %
стимуляция 54 %
стимуляция 28 %
стимуляция 30 %
стимуляция 32 %
стимуляция 25 %
стимуляция 12 %
стимуляция 5 %
стимуляция 56 %
стимуляция 59 %
стимуляция 60 %
стимуляция 40 %
Результаты тестирования показывают выраженный стимулирующий эффект стафилококкового анатоксина у больного К., тималина и Т-активина (но не стафилококкового анатоксина) у больного С. Пробное лечение показало высокую эффективность терапии выбранным иммуномодулятором.
Из представленных данных видно, что оценка иммуноактивных свойств иммуномодулятора в предлагаемой нами модельной системе позволяет произвести максимально эффективный и точный подбор регуляторов иммунитета, оценивая изменение любых клеточных параметров.
3
BY 4621 C1
Источники информации:
1. А.с. СССР 1704084, МПК G 01N 33/53, 1989.
2. Методические материалы по экспериментальному (фармакологическому) и клиническому испытанию
иммуномодулирующего действия фармакологических средств. - М., 1984.
Способ оценки иммуномодулирующей активности химических и физических средств путем определения
эффекта их воздействия in vitro на лейкоциты крови, отличающийся тем, что предварительно обрабатывают
тестируемым средством часть суспензии лейкоцитов в течение 30 мин при температуре 37 °С, затем отмывают их физиологическим раствором и смешивают в соотношении 1:4 с аутологичными необработанными
клетками, инкубируют полученную смешанную культуру не менее 2 ч при температуре 37 °С и оценивают
изменение иммунологических параметров клеток в аутологичной смешанной культуре, содержащей обработанные указанным средством и необработанные клетки, по сравнению с иммунологическими параметрами
клеток, культивированных в среде.
Национальный центр интеллектуальной собственности.
220072, г. Минск, проспект Ф. Скорины, 66.
4
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
0
Размер файла
138 Кб
Теги
04621, патент
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа