close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Патент BY 05899

код для вставкиСкачать
ОПИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ПАТЕНТУ
РЕСПУБЛИКА БЕЛАРУСЬ
BY (11) 5899
(13) C1
(19)
7
(51) C 12N 1/14
(12)
НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР
ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ
СОБСТВЕННОСТИ
(54)
ШТАММ ГРИБА AUREOBASIDIUM (PULLULARIA) PULLULANS
БМП-97 - ПРОДУЦЕНТ ПОЛИСАХАРИДА ПУЛЛУЛАНА
(21) Номер заявки: a 20000105
(22) 2000.02.03
(46) 2004.03.30
(71) Заявитель: Открытое акционерное
общество "Белмедпрепараты" (BY)
(72) Авторы: Петров Петр Тимофеевич;
Царенков Валерий Минович; Лапковский Михаил Павлович; Тюрин Виталий Иванович; Шингель Кирилл Игоревич; Скрипко Анна Дмитриевна; Гриневич Людмила Николаевна (BY)
(73) Патентообладатель: Открытое акционерное общество "Белмедпрепараты" (BY)
(57)
Штамм гриба Aureobasidium (Pullularia) pullulans БМП-97 (КПМКБ Д-23-1) - продуцент полисахарида пуллулана.
BY 5899 C1
(56)
Имшенецкий А.А. и др. Микробиология, 1985. - Т. 54. - Вып. 6. - C. 927-929.
SU 1559717 А1, 1994.
SU 1559718 А1, 1994.
JP 63283593 A, 1988.
JP 05328988 A, 1993.
ЕР 0812919 А1, 1997.
ЕР 0538049 A1, 1993.
Изобретение относится к фармацевтической и пищевой промышленности, в частности, к производству полисахаридов, используемых в качестве субстанции при производстве плазмозамещающих инфузионных растворов и других лекарственных средств, и
касается продуцента пуллулана.
Полисахарид пуллулан обладает целым рядом преимуществ перед декстраном, применяемым в настоящее время для получения кровезаменителей гемодинамического и реологического действия.
Способностью синтезировать внеклеточный полисахарид пуллулан в количествах, имеющих практическое задание, характеризуются грибы из рода Aureobasidium (Pullularia) [1].
Известна гаплоидная культура Aureobasidium pullulans F-1125, депонированная во
Всесоюзной коллекции микроорганизмов [2].
Производительность культуры по пуллулану - 6 г в литре культуральной жидкости на
120 ч ферментации.
Из-за невысокой производительности процесса биосинтеза и достаточно длительного
цикла ферментации штамм не нашел промышленного применения.
BY 5899 C1
В результате действия на конидии культуры Aureobasidium pullulans F-1125 паров
аценафтена получен более производительный диплоидный штамм Aureobasidium pullulans
1125413 [3].
Штамм аэроб, оптимальная температура синтеза пуллулана 29 ± 1 °С, способен усваивать различные соединения углерода: пентозы, глюкозы, дисахара, крахмал, гемицеллюлозы, спирты, соли органических кислот и др.
В клеточных стенках накапливается пигмент, придающий культуре темную окраску.
Изменяя состав среды можно регулировать интенсивность пигмента. Так, пигмент не образуется на среде, не содержащей аспарагин и ацетат аммония.
Клетки культуры за 72 часа роста образуют на минеральной среде с мелассой 23,18 г
пуллулана в литре культуральной жидкости при содержании сахаров в среде 8,17 %, однако выход пуллулана от потребленного сахара составляет 28,4 %.
Это объясняется тем, что культура синтезирует гетерогенный продукт, в состав которого кроме пуллулана входят несколько отличающихся по составу и структуре полисахаридов и пигментов, что значительно усложняет процесс выделения и очистки целевого
продукта.
Задачей изобретения является получение высокопродуктивного штамма продуцента
пуллулана с заданными свойствами. Эта задача решена за счет создания штамма Aureobasidium (Pullularia) pullulans БМП-97.
Штамм получен естественной селекцией штамма 1125413 путем многоступенчатого
отбора вариантов по признакам пуллуланобразующей способности и гомогенности полисахарида.
Гриб Aureobasidium относится к классу несовершенных грибов (Fungi imperfecti), порядку Moniliales, семейству Dematiaceae.
Цитология и химический состав клеток штамма Aureobasidium pullulans БМП-97.
Клетки культуры окружены толстой полисахаридной капсулой. Цитоплазматическая
мембрана плотно прилегает к клеточной стенке. Ядро клеток диаметром 1,3 + 3,0 мкм окружено двухслойной мембраной. Большинство ядер имеет ядрышко.
Клетки штамма содержат около 40 % общего белка, около 15 % липидов, примерно
35 % редуцирующих веществ, ДНК, РНК, витамины (тиамин, пиридоксин, никотиновая
кислота).
Культурально-морфологические особенности культуры.
Штамм Aureobasidium pullulans БМП-97 в жидкой минеральной среде растет в виде
дрожжеподобных конидий, размножающихся почкованием. Размер конидий 5,24 × 9,00
мкм. На плотных средах культура развивается в виде мицелия с образующимися на нем
бластоспорами.
У гриба не найдено совершенных стадий развития полового процесса и спорообразования. Вегетативный рост сопровождается изменениями в морфологии.
Молодые колонии культуры на твердых питательных средах напоминают по виду колонии дрожжей - гладкие, блестящие, обычно светлые, иногда розоватые, затем темнеющие.
При культивировании штамма на чашках Петри с сусло-агаром при температуре 25 °С
десятисуточные колонии достигают 28 мм в диаметре, округлой формы с матовой поверхностью, в центре светлобежевого цвета (диаметр 17 мм), по краю белого. Выделения пигмента в среду нет. Профиль бугристый, край ворсинчатый.
На крахмальном агаре культура растет в виде мицелия бежево-серого цвета. На ломтиках моркови гриб образует мицелий бежево-розового цвета.
На пивном сусле культура образует толстую слизистую пленку, сначала розоватокремового цвета, а затем постепенно темнеющую.
Физиолого-биохимические признаки.
2
BY 5899 C1
Штамм Aureobasidium pullulans БМП-97 по типу дыхания облигатный аэроб. Способен
расти в интервале температур от 4 °С до 32 °С. Оптимальная температура для роста культуры 26 °С, для биосинтеза пуллулана 24 °С. Высоко устойчив к летальному действию
УФ-лучей и мутагенному действию.
В жидкой минеральной среде данный штамм образует экстрацеллюлярный пуллулан.
Культура ассимилирует D-глюкозу, D(+)-ксилозу, D(+)-галактозу, D(+)-мальтозу, Lарабинозу, L-рамнозу, D-лактозу, сахарозу, крахмал. Не усваивает декстран.
Штамм усваивает азотнокислый натрий, азотнокислый калий, сернокислый аммоний,
мочевину, глицин, D-L-аланин, D-L-лейцин, D-L-лизин, L-аспарагин, D-L-аспарагиновую
кислоту, L-глутаминовую кислоту, D-L-метионин, гуанин, пептон. Желатин не разжижает.
Молоко коагулирует. Антибиотической активности не имеет. Патогенными свойствами не
обладает. Культура сохраняет жизнеспособность и продуктивность в лиофилизированном
состоянии в течение двух лет.
Результатом изобретения явилось получение штамма с высокой производительностью
процесса биосинтеза и создание технологии производства пуллулана.
Изобретение поясняется примером.
Пример.
В две пробирки с 48-часовой культурой Aureobasidium pullulans БМП-97 на сусло-агаре
вносят по 5 мл стерильной воды и микробиологической петлей готовят суспензию клеток,
которой засевают 100 мл стерильной посевной среды в колбе Эрленмейера.
Состав посевной среды:
1. Сахар
50,0 г
2. Источник белкового азота 1,25 г (в пересчете на белок)
3. NaNO3
1,6 г
4. Na2HPO4
2,4 г
5. KCL
0,35 г
6. MgSO4 7H2O
0,4 г
7. Na2SO4
0,5 г
8. Вода дистиллированная
до 1000 мл.
Компоненты растворяют в подогретой дистиллированной воде в порядке, указанном в
прописи, после чего доводят объем среды водой до 1,0 л. Проверяют рН (должен быть
6,7 ± 0,1). Приготовленную среду фильтруют через двойной бумажный фильтр и разливают по 100 мл в стерильные колбы Эрленмейера вместимостью 750 мл. Колбы со средой
стерилизуют в автоклаве 30 мин при температуре 120 °С. После стерилизации среда прозрачная, с небольшим осадком, рН = 6,4, содержание Сахаров - 4,9 %. Приготовленную
среду выдерживают последовательно по трое суток при температурах 37 °С и 24 °С для
проверки стерильности.
Выращивают культуры при температуре 26 °С на качалке с числом оборотов 280 мин-1 в
течение 72 ч, после чего инокулятом в объеме 10 % засевают колбы со стерильной ферментационной средой.
Сосав ферментационной среды:
1. Сахар
100,0 г
2. Источник белкового азота 2,5 г (в пересчете на белок)
3. (NH4)2SO4
0,6 г
4. КН2РО4
5,0
5. NaCl
1,0
6. MgSO47H2O
0,4
7. Вода дистиллированная
до 1000 мл
рН среды
6,7.
Порядок приготовления ферментационной среды аналогичен описанному выше для
посевной среды.
3
BY 5899 C1
Биосинтез пуллулана ведут при температуре 24 °С на качалке с числом оборотов
280 мин-1 в течение 48 ч, после чего в пробе культуральной жидкости определяют содержание пуллулана весовым или поляриметрическим методом после двукратного осаждения
спиртом этиловым. Содержание пуллулана, полученного в соответствии с примером, составляет 55 г в литре культуральной жидкости или 55 % от содержания сахара в среде.
Гомогенность полученного полисахарида составляет 98 %.
По окончании процесса ферментации культуральную жидкость освобождают от клеток микроорганизма центрифугированием. Пуллулан осаждают из центрифугата этиловым
спиртом в соотношении 1 : 1 по объему, осадок отделяют, растворяют в дистиллированной
воде до концентрации 6-10 %, затем повторно переосаждают этиловым спиртом и высушивают на лиофильной или распылительной сушилках.
Пуллулан, синтезируемый грибом Aureobasidium pullulans БМП-97, представляет собой полимер, состоящий из мальтотриозных остатков, соединенных между собой α(1→6)
связями. Мальтотриозные остатки состоят из α-D-глюкозных остатков, соединенных
α(1→4) связями. Соотношение α(1→4) и α(1→6) связей - 2,2 : 1.
Пуллулан используется как субстанция при производстве плазмозамещающих препаратов и других лекарственных средств, в пищевой промышленности как составная часть
диетического питания, в производстве эмульсий, мазей, кремов, в качестве пленкообразующего полимера.
Штамм Aureobasidium (Pullularia) Pullulans БМП-97 депонирован в коллекции промышленных микроорганизмов концерна "Белбиофарм", регистрационный номер Д 23-1.
Источники информации:
1. "Encyclopedia of polymer science and engineering". - Vol. 13,2nd edn, Wiley, Toronto,
1998. - PP. 650-660.
2. Имшенецкий А.А., Т.Ф. Кондратьева. Микробиология, 1977. - Т. 46. - Вып. 6.
3. Имшенецкий А.А. и др. Микробиология, 1985. - Т. 54. - Вып. 6. - С. 927-929.
Национальный центр интеллектуальной собственности.
220034, г. Минск, ул. Козлова, 20.
4
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
0
Размер файла
155 Кб
Теги
патент, 05899
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа