close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Патент BY 11555

код для вставкиСкачать
ОПИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ПАТЕНТУ
РЕСПУБЛИКА БЕЛАРУСЬ
(46) 2009.02.28
(12)
(51) МПК (2006)
НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР
ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ
СОБСТВЕННОСТИ
(54)
BY (11) 11555
(13) C1
(19)
C 12N 1/20
C 05F 11/08
A 01N 63/00
ШТАММ БАКТЕРИЙ ENTEROBACTER SP. БИМ В-402Д ДЛЯ
ПОВЫШЕНИЯ УРОЖАЙНОСТИ РАСТЕНИЙ
(21) Номер заявки: a 20061270
(22) 2006.12.14
(43) 2008.08.30
(71) Заявитель: Государственное научное
учреждение "Институт микробиологии Национальной академии наук
Беларуси" (BY)
(72) Авторы: Суховицкая Людмила Антоновна; Сафронова Галина Владимировна; Мохова Светлана Валентиновна; Мельникова Наталия Владимировна (BY)
(73) Патентообладатель: Государственное
научное учреждение "Институт микробиологии Национальной академии
наук Беларуси" (BY)
(56) US 5360737 A, 1994.
DE 3735364 A1, 1988.
SU 1083531 A, 1985.
RU 2224791 C1, 2004.
BY 4632 C1, 2002.
МИШУСТИН Е.Н. и др. Клубеньковые бактерии и инокуляционный процесс. - Москва: Наука, 1973. - С. 86-89,
С. 170-173.
BY 11555 C1 2009.02.28
(57)
Штамм бактерий Enterobacter sp. БИМ В-402Д для повышения урожайности растений.
Изобретение относится к сельскохозяйственной микробиологии, в частности к получению экологически безопасных микробных препаратов комплексного действия и представляет собой новый штамм бактерий с неспецифической ростстимулирующей способностью,
азотфиксирующей, фосфатмобилизующей активностями, антимикробным эффектом и
может быть использован в сельском хозяйстве для бактеризации семян.
В области сельскохозяйственной биотехнологии известны способы бактеризации растений путем предпосевной обработки семян. Например, предпосевная инокуляция семян
бобовых культур специфичными клубеньковыми бактериями [1]. Однако клубеньковые
бактерии могут быть использованы исключительно для обработки семян симбиотрофных
бобовых культур.
Основной задачей исследований в области ассоциативной азотфиксации является изучение азотфиксирующих бактерий корневой зоны небобовых растений, в которой развиваются ассоциативные микроорганизмы, эффективность которых оценивается в основном
по признаку азотфиксирующей активности [2] и урожайности определенной небобовой
культуры. Однако известны основные механизмы, определяющие эффективность ассоциаций небобовых растений с азотфиксирующими микроорганизмами. Это - азотфиксация, действие гормонов и повышение степени использования растениями элементов
минерального питания, антимикробный эффект штаммов-инокулянтов. Известны штаммы
несимбиотических ассоциативных бактерий, предназначенные для бактеризации небобовых культур и получения микробных препаратов.
BY 11555 C1 2009.02.28
Известен штамм Arthrobacter mysorense-7 для обработки семян многолетних злаковых
трав [3]. Недостатком данного штамма является отсутствие ростстимулирующего, антимикробного и фосфаттрансформирующего эффекта.
Известен штамм азотфиксирующих бактерий Azospirillum brasilense В-4485 [4] для
обработки семян зерновых культур и многолетних злаковых трав с целью повышения их
урожайности. Недостатком данного штамма является отсутствие антимикробного и фосфаттрансформирующего эффекта.
Известен штамм Pseudomonas radiobacter АР, предназначенный для повышения урожайности свеклы [5]. Штамм обладает фосфатмобилизующей и ростстимулирующей способностью, но эффективен на узком спектре сельскохозяйственных культур (овощные и
корнеплоды) и неспособен к биологической азотфиксации.
Известен штамм Azotobacter vinelandii для получения микробного препарата для борьбы с болезнями пшеницы и повышения урожайности [6]. Недостатком данного азотфиксирующего штамма является отсутствие антибактериального и фосфатмобилизующего
действия.
Известен штамм Streptomyces chrysomallus B-21, предназначенный для получения полифункционального биопрепарата против фитопатогенных грибов и вирусов, стимулирующего рост и развитие растений [7]. К недостаткам данного штамма относится
отсутствие азотфиксирующей и фосфатмобилизующей активности.
Наиболее близким по технической сущности к заявляемому изобретению является
штамм бактерий Azotobacter vinelandii для получения биопрепарата для борьбы с корневыми гнилями пшеницы, повышения количества и качества урожая [8]. Недостатком данного штамма являются:
отсутствие антагонистического воздействия на бактериальные фитопатогены;
отсутствие фосфаттрансформирующей способности;
узкий спектр ростстимулирующей активности;
вызывает сомнение перспективность использования штамма в практике в связи с отсутствием данных о его способности колонизировать корневую систему растений - свойстве, наиболее обусловливающем эффект инокуляции ассоциативными азотфиксаторами
растений.
Задачей изобретения является получение нового штамма бактерий Enterobacter sp.
БИМ В-402Д с широким спектром хозяйственно-ценных свойств, способного к ростостимуляции широкого спектра растений, биологической азотфиксации и фосфатмобилизации,
подавлению фитопатогенной микрофлоры растений и высокой приживаемости на корнях
(колонизирующая способность).
Предлагаемый штамм Enterobacter sp. БИМ В-402Д выделен из ризопланы ячменя методом, предложенным Берестецким О.А. и Васюк Л.Ф. [9]. Гомогенат корней помещали в
полужидкую среду DN [10]. Образцы инкубировали в термостате 72 часа при температуре
26-28 °С и проверяли способность накопительной культуры восстанавливать ацетилен
[11]. Из варианта, обладающего наиболее высокой нитрогеназной активностью, делали
высевы на среду Эшби с целью получения изолированных колоний, которые оценивали по
азотфиксирующей активности. Отобранный наиболее активный бактериальный изолят
идентифицировали (Определитель бактерий Берджи, 1997) как Enterobacter sp. и депонировали в Коллекции непатогенных микроорганизмов ГНУ "Институт микробиологии
НАН Беларуси" под регистрационным номером БИМ В-402Д. Культура также поддерживается в коллекции лаборатории взаимоотношений микроорганизмов почвы и высших
растений ГНУ "Институт микробиологии НАН Беларуси".
Штамм хранится при 4 °С на мясо-пептонном агаре, рН 6,8-7,2; перевивка - 1 раз в три
месяца.
Культурально-морфологические свойства.
2
BY 11555 C1 2009.02.28
Колонии на мясо-пептонном агаре на 2-3 сутки роста гладкие, серо-белые, прозрачные. Диаметр колоний на указанных средах 2-4 мм. Края ровные, профиль выпуклый. Хорошо и равномерно эмульгируются в воде.
Цитология.
Грамотрицательные неспорообразующие подвижные, имеющие перит-рихальное жгутикование, палочковидные клетки размером 0,3-0,4 × 0,6-1,2 мкм. Отдельные клетки капсулированы.
Физиолого-биохимические свойства.
Продуцирует: β-индолил уксусную кислоту.
Другие особенности: оксидазоотрицателен, каталазаположителен, имеет положительные реакции Вогес-Проскауэра, с метиловым красным, на уреазу, бродильный метаболизм
глюкозы в тесте Хью-Лейфсона; желатин не разжижает, крахмал не гидролизует. Образует кислоту из: глюкозы, сахарозы, лактозы, маннита, дульцита, сорбита, арабинозы, рафинозы, рамнозы, мальтозы, ксилозы, трегалозы, целлобиозы, мелибиозы, маннозы, но не
использует фруктозы, глицерина, мелецитозы, адонита, инозита. Усваивает цитрат.
Особые свойства: растет на безазотных средах Bürka и Эшби. Не нуждается в факторах роста. Обладает комплексом хозяйственно-ценных свойств: ИУК-синтезирующей,
азотфиксирующей, фосфатмобилизующей и антимикробной активностями.
Штамм не является патогенным и токсикогенным. Токсикологические исследования
штамма проводились на белых мышах и кроликах. Установлено, что штамм при внутрибрюшинном введении его суспензии в дозе 500 млн.м.н. мышам и нанесением на скарифицированный участок кожи кроликов такой же дозы суспензии штамма не вызывает
гибели животных. Отклонений в поведении, поедаемости корма, состоянии шерстного и
кожного покрова при клиническом исследовании не наблюдалось. Патологоанатомические исследования органов и тканей отклонений от нормы не выявили. Результаты констатируют отсутствие патогенности и токсичности, что свидетельствует о возможности
использования штамма Enterobacter sp. БИМ В-402Д в микробиологическом производстве.
Штамм Enterobacter sp. БИМ В-402Д не фитотоксичен. Фитотоксичность проверена на
растениях редиса - традиционном биотесте, обладающем высокой чувствительностью к
фитотоксичным препаратам. После обработки кончиков корней проростков редиса культуральной жидкостью бактерий Enterobacter sp. БИМ В-402Д и выдерживания их в течение 3 суток в термостате (22-24 °С) отсутствия задержки в развитии, некротических пятен,
ожогов и других изменений в сравнении с контролем (вода и стерильная питательная среда) не обнаружено, что свидетельствует о нетоксичности бактерий Enterobacter sp. БИМ
В-402Д для высших растений.
Штамм характеризуется широким спектром физиолого-биохимических свойств, определяющих его хозяйственно-ценные признаки (ростстимуляция, биологическая азотфиксация и фосфатмобилизация, подавление фитопатогенной микрофлоры, высокая приживаемость в ризоплане растений и др.), что позволяет использовать его в качестве основы
микробного препарата комплексного действия.
Суть предлагаемого изобретения иллюстрируют следующие примеры.
Пример 1
Штамм Enterobacter sp. БИМ В-402Д обладает неспецифичной ростостимулирующей
активностью на ранних стадиях онтогенеза растений, которая обусловлена синтезом ауксина β-индолил-3-уксусной кислоты (β-ИУК).
Ростостимулирующее действие Enterobacter sp. БИМ В-402Д и влияние продуктов
метаболизма на накопление биомассы, изучали по методам, изложенным в руководстве
Возняковской, 1969. Семена растений замачивали в водной суспензии культуры (концентрация клеток 108 КОЕ/мл). Контролем служила стерильная водопроводная вода. Обрабо3
BY 11555 C1 2009.02.28
танные семена проращивали в термостате при температуре 28 °С в течение 2-3 суток.
Анализ полученных данных свидетельствует о том, что исследуемый штамм обладает неспецифической ростстимулирующей активностью: стимулировал рост и развитие проростков 12 видов сельскохозяйственных культур (биомасса бобовых, зерновых, овощных и
крестоцветных возросла в сравнении с контролем в среднем на 50, 36, 46 и 14 % соответственно), что является преимуществом заявляемого штамма Enterobacter sp. БИМ В-402Д
по сравнению с прототипом (табл. 1).
Пример 2
Ростстимулирующий эффект Enterobacter sp. БИМ В-402Д обусловлен продуцированием индольного ауксина (β-индолил-3-уксусная кислота). Количество β-ИУК, продуцируемое штаммом, определяли колориметрическим методом. Суспензию Enterobacter sp.
БИМ В-402Д, доведенную до концентрации 108 КОЕ/мл, вносили в количестве 10 % от
объема среды и инкубировали в течение 1-4 сут. при температуре 28 °С в жидкой безазотной среде Bürka следующего состава, г/л: раствор А: глюкоза - 10,0; MgSO4 ⋅ 7H2O - 0,2;
CaSO4 ⋅ 2Н2О - 0,1; FeSO4 ⋅ 7Н2О - 0,005; Na2MoO4 ⋅ 2Н2О - 0,00024; дистиллированная вода до 500 мл; раствор Б: 0,005 М калий-фосфатный буфер (рН - 7,1) - 500 мл. Растворы А и
Б автоклавировали отдельно и после охлаждения смешивали в соотношении 1:1. В среду
вносили 0,05 % L-триптофана.
Таблица 1
Влияние продуктов метаболизма Enterobacter sp. БИМ В-402Д на накопление
биомассы проростками сельскохозяйственных культур
Биомасса проростков растений,
СельскоБиомасса проростков
обработанных водной суспензихозяйственная в контроле, мг абс.
ей Enterobacter sp. БИМ В-402Д,
культура
сух. в.
мг абс. сух. в.
бобовые
Вика
63
124
Люпин
700
880
Горох
250
567
Фасоль
1305
1213
Клевер
20
21
зерновые
Пшеница
180
180
Рожь
180
190
Ячмень
63
127
овощные
Редис
122
164
Огурцы
104
163
крестоцветные
Кресс-салат
28
29
Горчица
33
41
% от контроля
197
126
227
93
105
100
106
202
134
157
104
124
Результаты анализа количественного показали, что Enterobacter sp. БИМ В-402Д способен к биосинтезу ауксина как в чистой культуре, так и в ассоциации с инокулированным растением (содержание индолил-3-уксусной кислоты в культуральной жидкости
до 19,0 мкг β-ИУК/мл, в растениях ячменя в фазе колошения - 3,92 мкг/г абс. сух. в.)
(табл. 2), что подтверждает пролонгированный ростстимулирующий эффект штамма и является его преимуществом.
4
BY 11555 C1 2009.02.28
Таблица 2
Продуцирование β-индолил-3-уксусной кислоты Enterobacter sp. БИМ В-402Д
в чистой культуре и в ассоциации с растением
Варианты опыта
Концентрация β-ИУК
в культуральной жидкости,
мкг/мл
19,0±0,06
Содержание β-ИУК
в растениях ячменя в фазе
колошения, мкг/г абс. сух. в.
1,70±0,078
3,92±0,015
Контроль
Enterobacter sp. В-402Д
Пример 3
Штамм Enterobacter sp. БИМ В-402Д обладает нитрогеназной и фосфатмобилизующей
активностью, т.е. ассимилирует азот атмосферы и трансформирует труднодоступные
ортофосфаты. Результаты определения представлены в табл. 3.
Таблица 3
Нитрогеназная и фосфатмобилизующая активность штамма
Enterobacter sp. БИМ В-402Д
Свойства
Нитрогеназная активность в чистой культуре,
нМоль С2Н4 /фл./сут
Азотфиксирующая активность в ассоциации
с растением, нМоль С2Н4/раст./сут
Фосфатмобилизующая активность, диаметр
зон растворения ортофосфатов кальция, мм
Контроль
Enterobacter sp. БИМ В-402Д
-
2,3±0,21
11,2±0,80
135,1±3,50
-
10,5-12,4
Азотфиксирующую активность Enterobacter sp. БИМ В-402Д в чистой культуре и в ассоциации с ячменем определяли ацетиленовым методом на Хром-4 (Умаров, 1986). Выявлено, что нитрогеназная активность Enterobacter sp. БИМ В-402Д в чистой культуре
составляла 2,3 нМоль С2Н4/фл./сут, в ассоциации с растениями ячменя - в среднем более
чем на порядок превышала контроль.
Способность Enterobacter sp. БИМ В-402Д трансформировать малоподвижные фосфаты устанавливали чашечным методом по зонам растворения ортофосфатов вокруг колоний этих микроорганизмов на агаризованной глюкозо-аспарагиновой среде Муромцева,
следующего состава, г/л: глюкоза - 10,0; аспарагин - 1,0; кукурузный экстракт - 0,2; K2SO4 0,2; MgSO4 ⋅ 7Н2О - 0,2; агар - 20,0. рН среды до 6,8 доводили 10 % раствором NaOH. В
стерильную среду вносили методом осаждения фосфаты кальция (3,3 г СаС12 ⋅ 6Н2О + 3,8 г
Na3PO4 ⋅ 12Н2О), алюминия или железа (0,570 г Na3 PO4 ⋅ 12Н2О + 0,362 г АlСl3 ⋅ 6Н2О или
0,405 г FeCl3 ⋅ 6Н2О). Как вытекает из полученных данных, диаметр зон растворения ортофосфатов кальция штаммом Enterobacter sp. БИМ В-402Д достигал 12,4 мм. Трансформация ортофосфатов - важное отличительное свойство Enterobacter sp. БИМ В-402Д от
прототипа.
Пример 4
Штамм Enterobacter sp. БИМ В-402Д представляет интерес в качестве потенциального
агента биологической защиты, т.к. обладает антагонистическим действием (табл. 4). Способность штамма образовывать вещества антибиотической природы изучали методом
блоков (Сэги, 1983). В качестве тест-объектов использовали фитопатогенные грибы и бактерии.
Отличительной особенностью штамма Enterobacter sp. БИМ В-402Д от прототипа
является подавление роста не только фитопатогенных грибов родов Fusarium и Alternaria,
но и его антибактериальный эффект (ингибирующее действие на рост фитопатогенных
бактерий рода Pseudomonas и Erwinia).
5
BY 11555 C1 2009.02.28
Таблица 4
Антагонистическое действие штамма Enterobacter sp. БИМ В-402Д
Вид фитопатогенных
Диаметр зон ингибирования роста фитопатогенов, мм
микроорганизмов
Fusarium sporotrichiella
28,3±1,21
Fusarium oxysporum
28,6±1,12
Fusarium moniliforte
12,5±1,50
Alternaria alternata
20,0±0,75
Alternaria sp.
23,0±1,01
Pseudomonas syringe
21,0±2,01
Pseudomonas cerasi
24,0±0,71
Erwinia carotovora
36,6±1,23
Пример 5
Свойство, наиболее обусловливающее эффект инокуляции ассоциативными азотфиксаторами растений - колонизирующая способность. Колонизирующую способность
штамма Enterobacter sp. БИМ В-402Д изучали антибиотикорезистентным методом (Генетические методы селекции клубеньковых бактерий, 1984). Согласно полученным данным
(табл. 5), штамм Enterobacter sp. БИМ В-402Д обладает высокой колонизирующей способностью и сохраняется на корнях ячменя в течение всего вегетационного периода, что обусловливает эффект диазотрофной инокуляции.
Таблица 5
Колонизирующая способность штамма Enterobacter sp. БИМ В-402Д
(численность в ризоплане корней, млн. КОЕ/г корней)
Фазы развития ячменя
Вариант опыта
кущение
выход в трубку колошение
созревание
Контроль
Enterobacter sp. В-402Д
0,35
8,00
2,60
0,49
Пример 6
Для сравнения продуктивности штамма Enterobacter sp. БИМ В-402Д с прототипом Azotobacter vinelandii ИБ-4 проводили выращивание в колбах на качалке при 200220 об./мин в течение 48 часов, при 28 °С на жидких питательных средах Эшби и мелассно-минеральной. Состав среды Эшби, г/л: маннит - 20,0; K2НРО4 - 0,2; MgSO4 ⋅ 7Н2О - 0,2;
NaCl - 0,2; K2SO4 - 0,1; СаСО3 - 5,0, мелассно-минеральной - меласса (разведенная 1:1) 30,0 (NH4)2SO4 - 10,0, К2НРО4 - 0,5, КН2РО4 - 0,5. Приведенные в табл. 6 результаты свидетельствуют о более высокой продуктивности заявляемого штамма над штаммом по прототипу. Согласно полученным данным заявляемый штамм Enterobacter sp. БИМ В-402Д
способен к росту на среде с дешевыми источниками углеводного и азотного питания
(мелассно-минеральной). Заявляемый штамм более технологичен: получение высокого
титра клеток достигается к 48 часам культивирования.
Таблица 6
Титр штамма Enterobacter sp. БИМ В-402Д при культивировании на разных средах
Среда Эшби
Мелассно-минеральная среда
число
жизнеспочисло жизнеспоШтамм
время культививремя культивисобных клеток
собных клеток
рования, ч
рования, ч
(КОЕ), млрд./мл
(КОЕ), млрд./мл
24
6,5⋅109
Azotobacter
vinelandii ИБ-4
48
2,2⋅1011
9
(прототип)
60
3,3⋅10
9
24
24
5,4⋅10
4,1⋅109
Enterobacter sp.
48
48
3,7⋅1010
5,6⋅1010
БИМ В-402Д
60
60
1,0⋅1010
8,8⋅109
6
BY 11555 C1 2009.02.28
Пример 7
Оценку эффективности инокуляции двух зерновых культур проводили на экспериментальной базе РНИУП "Институт земледелия и селекции НАН Беларуси". Полевые опыты
закладывали в соответствии с методикой их постановки (Доспехов, 1979). Статистически
достоверно установлено увеличение урожая зерна ярового ячменя на 15,1, озимой ржи - на
11,6 % в результате использования для инокуляции штамма Enterobacter sp. БИМ В-402Д,
обладающего комплексом хозяйственно-ценных свойств (табл. 7).
Таблица 7
Эффективность инокуляции зерновых культур штаммом
Enterobacter sp. БИМ В-402Д
Варианты опыта
Контроль (N90P60K90)
Enterobacter sp. В-402Д
НСР 0,95
Яровой ячмень
Озимая рожь
урожайность, прибавка уро- урожайность, прибавка уроц/га
жая, ц/га
ц/га
жая, ц/га
41,0
40,6
47,2
6,2
45,3
4,7
4,0
3,3
Полученные данные свидетельствуют о перспективности использования технологичного штамма Enterobacter sp. БИМ В-402Д с широким спектром хозяйственно-ценных
свойств: ИУК-синтезирующей, азотфиксирующей, фосфатмобилизующей, антагонистической активностями и высокой колонизирующей способностью для повышения урожайности растений.
Сравнительные характеристики заявляемого штамма Enterobacter sp. БИМ В-402Д и
штамма прототипа представлены в табл. 8 и 9.
Таблица 8
Спектр хозяйственно-ценных свойств штамма Enterobacter sp. БИМ В-402Д
Свойства
1
Ростстимулирующая
активность
Количественные характеристики
Azotobacter vinelandii ИБ-4
(прототип)
3
2
Стимулировал рост и развитие проростСтимулировал рост
ков 12 видов сельскохозяйственных
и развитие фасоли:
культур (биомасса бобовых, зерновых,
высоту растений овощных и крестоцветных возросла в
на 9,8, вес корней сравнении с контролем в среднем на 50,
на 62 %.
36, 46 и 14 % соответственно)
Биосинтез β-ИУК
19,0 ± 0,06 мкг β-ИУК/мл культуральной
жидкости
в ассоциации с растением 3,92 ± 0,015 мкг β-ИУК /г абс. сух. в.
Нитрогеназная активность 2,3 нМоль С2Н4/фл./сут
в чистой культуре в ассо135,1 нМоль С2Н4/раст./сут
циации с растением
Диаметр зон растворения
10,5-12,4 мм
ортофосфатов кальция
Колонизирующая способность в процессе вегетации 0,35-8,00 млн. КОЕ /г корней
ячменя
в чистой культуре
7
0,656 мкг N2/мл/ч
-
BY 11555 C1 2009.02.28
Таблица 9
Спектр антибактериальной активности штамма Enterobacter sp. БИМ В-402Д
Диаметр зон ингибирования роста фитопатогенов, мм
Вид фитопатогенных
Azotobacter vinelandii ИБ-4
микроорганизмов
Enterobacter sp. БИМ В-402Д
(прототип)
Fusarium sporotrichiella
28,3±1,21
Fusarium oxysporum
28,6±1,12
Fusarium moniliforte
12,5±1,50
12,0
Alternaria alternata
20,0±0,75
Alternaria sp.
23,0±1,01
Pseudomonas syringe
21,0±2,01
Pseudomonas cerasi
24,0±0,71
Erwinia carotovora
36,6±1,23
Источники информации:
1. Мишустин Е.Н., Шильникова В.К. Клубеньковые бактерии и инокуляционный процесс. - М.: Наука, 1973.
2. Бiолочiний азот / В.П. Патика, С.Я. Коць, В.В. Волкогон и др. За ред. В.П. Патики. К.:СВIТ, 2003. - С. 157-251.
3. А.с. СССР 1083531 А1, МПК С 05F 11/08, С 12N 1/20, 1985.
4. Патент РБ 4632 С1, МПК С 12N 1/20, 2002.
5. А.с. СССР 1723078 А1, МПК С 05F 11/08, С 12N 1/20, 1991.
6. Патент RU 2224791 С1, МПК С 12N 1/20, A 01N 63/00, 2004.
7. Патент RU 2226214 С1, МПК С 12N 1/20, А 01N 63/00, 2004.
8. Патент RU 2245918 С1, МПК С 12N 1/20, A 01N 63/00, 2005.
9. Берестецкий О.А., Васюк Л.Ф. Азотфиксирующая активность в ризосфере и на корнях небобовых растений // Изв. АН СССР. - 1983. - № 1. - С. 138-157.
10.Vulow Y., Dobereiner J. Potential for nitrogen fixation in maize genotypes in Brasil //
Proc. Nat. Acad. Sci. USA. - 1975. - Vol. 72, № 6. - P. 1123-1126.
11.Умаров M.M. Ацетиленовый метод изучения азотфиксации в почвенно-микробиологических исследованиях // Почвоведение. - 1976. - № 11. - С. 119-123.
Национальный центр интеллектуальной собственности.
220034, г. Минск, ул. Козлова, 20.
8
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
0
Размер файла
136 Кб
Теги
патент, 11555
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа