close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Патент BY 13143

код для вставкиСкачать
ОПИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ПАТЕНТУ
РЕСПУБЛИКА БЕЛАРУСЬ
(46) 2010.04.30
(12)
(51) МПК (2009)
НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР
ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ
СОБСТВЕННОСТИ
(54)
A 61B 5/145
C 12Q 1/34
СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ПАНКРЕАТИТА ПО УРОВНЮ A2
ФОСФОЛИПАЗНОЙ АКТИВНОСТИ СЫВОРОТКИ КРОВИ
(21) Номер заявки: a 20071203
(22) 2007.10.02
(43) 2009.06.30
(71) Заявитель: Государственное научное учреждение "Институт биоорганической химии Национальной
академии наук Беларуси" (BY)
(72) Авторы: Литвинко Наталья Михайловна; Скоростецкая Лидия Адамовна (BY)
(73) Патентообладатель: Государственное
научное учреждение "Институт биоорганической химии Национальной
академии наук Беларуси" (BY)
BY 13143 C1 2010.04.30
BY (11) 13143
(13) C1
(19)
(56) СКОРОСТЕЦКАЯ Л.А. и др. Международная научная конференция "Молекулярные, мембранные и клеточные
основы функционирования биосистем". VII съезд БООФиБ: Сб. ст. Т.II.Минск, 2006.- С. 249-251.
ГОЛОВАЧ О.Н. и др. Молекулярные,
мембранные и клеточные основы функционирования биосистем: Сб. ст. Ч.II.Минск, 2004.- С. 225-227.
ЛИТВИНКО Н.М. Структурно-функциональные закономерности гидролиза
фосфолипидов под действием фосфолипаз А2 и С (активность in vitro и in
vivo, уровни регуляции): Автореф. дис.Минск, 2000.- С. 1, 12-13.
UA 51423 A, 2002.
UA 61092 C2, 2003.
SU 1589212 A1, 1990.
(57)
Способ диагностики панкреатита по уровню A2 фосфолипазной активности сыворотки
крови, отличающийся тем, что активность фосфолипазы А2 определяют с использованием в качестве субстрата мицелл, полученных из фосфатидилхолина яичного желтка, взятого в концентрации 0,12-0,2 мМ, и тритона Х-100, взятого в соотношении с
фосфатидилхолином яичного желтка 1:(2-3), причем субстрат вносят в буферный раствор
рН 7,4-10,0, содержащий CaCl2 в концентрации 1-2 мМ и метгемоглобин в концентрации
3-12 мкМ, полученную смесь преинкубируют в течение 2-5 минут при 20-37 °С, вносят в
две кюветы, добавляют в первую кювету 5-20 мкл сыворотки крови обследуемого пациента, во вторую - контрольную - 5-20 мкл сыворотки крови здорового человека, выравнивают оптические плотности образцов в кюветах путем внесения этанола в первую кювету и
20 мМ-ного раствора пальмитиновой кислоты в этаноле во вторую кювету, регистрируют
при длинах волн 405 и 423 нм дифференциальные спектры интенсивности абсорбции обоих образцов, по значениям ∆D405-423 определяют по калибровочному графику уровни А2
фосфолипазной активности в образцах и, если А2 фосфолипазная активность сыворотки
крови в 2,6 раза больше у обследуемого пациента, чем у здорового человека, диагностируют панкреатит.
BY 13143 C1 2010.04.30
Изобретение относится к области клинической биохимии, биотехнологии и медицины,
в частности к выявлению воспалительных заболеваний на основе определения в сыворотке крови активности одного из важнейших ферментов липидного метаболизма - фосфолипазы А2, уровень которой является патогенетическим признаком острого некротического
панкреатита и других воспалительных заболеваний [1].
При развитии воспалительных и онкологических процессов, тромбообразовании, ишемии тканей, язвенной болезни, многих заболеваниях, угрожающих жизни человека - отеках вследствие радиационного поражения и других патологиях наблюдается значительное
увеличение активности липолитического фермента фосфолипазы А2 (КФ 3.1.1.4, ФЛА2) в
органах и тканях [2].
Известен способ определения активности фосфолипазы А, использующийся в клинических биохимических лабораториях, состоящий в определении специфическими реагентами количества высвободившихся жирных кислот после инкубации сыворотки с
лецитином (фосфатидилхолин) в качестве субстрата, солюбилизированного дезоксихолатом натрия, в присутствии глицина в течение длительного времени (18 ч) при температуре
55 °С [3]. Определение активности ФЛА2 в биологическом материале осуществляется
также с использованием наиболее точного хроматографического метода, включающего в
себя экстракцию продуктов реакции, их разделение с помощью тонкослойной хроматографии и последующего количественного определения образующихся лизофосфатидилхолинов и оставшихся непрореагировавшими фосфатидилхолинов по содержанию в них
фосфора. Определение по этому способу занимает до пяти суток [4].
Существующие методы определения активности ФЛА2 трудоемки, требуют больших
затрат биологического материала, субстратов и времени, а также специального дорогостоящего оборудования и реактивов, не позволяют характеризовать уровень фермента в
кинетическом режиме, что создает большие трудности при необходимости быстрого определения активности этого жизненно важного фермента.
Функциональная значимость ФЛА2 для систем свертывания крови, биосинтеза в крови
биологически активных оксилипинов, необходимых для передачи внешнего сигнала на
внутренний "язык" клетки, обусловила актуальность определения активности этого фермента в сыворотке крови.
ФЛА2 обнаружена практически во всех клетках крови: тромбоцитах, эритроцитах, полиморфно-ядерных лейкоцитах (нейтрофилах, базофилах, эозинофилах) и т.д. Кроме участия в регуляции жирно-кислотного состава фосфолипидов клеточной мембраны ФЛА2
кровяных клеток имеет специальные функции. Однако основной функцией ФЛА2 клеток
крови является участие в продукции биологически активных оксилипинов путем отщепления арахидоновой кислоты - предшественника простагландинов, лейкотриенов и липоксинов [6]. Биосинтез активных метаболитов арахидоновой кислоты, которая освобождается из молекул фосфолипидов под действием ФЛА2, реализуется при активации
тромбоцитов. Таким образом функционирование ФЛА2, наличие которой зафиксировано
как в цитозоле, так и в мембране тромбоцитов, имеет решающее значение для реализации
их физиологической функции. Основной функцией полиморфно-ядерных лейкоцитов является фагоцитоз и уничтожение чужеродных бактерий. ФЛА2, секретируемая лейкоцитами и макрофагами при фагоцитозе, гидролизует фосфолипиды патогенных
микроорганизмов. Активация полиморфно-ядерных лейкоцитов сопровождается биосинтезом лейкотриенов, субстратом для биосинтеза которых также служит арахидоновая кислота, образующаяся из фосфолипидов в результате их разрушения ФЛА2. Клетки
иммунной системы крови представлены лимфоцитами и макрофагами. Фосфолипазная
активность оказалась присуща как T-, так и В-лимфоцитам. Локализация биосинтеза простагландинов в макрофагах указывает на наличие двух пулов фосфолипазной активности в лизосомах и в мембранах. В меньшей степени активность мембранно-связанной представлена в тенях эритроцитов [5].
2
BY 13143 C1 2010.04.30
Известен способ определения активности фосфолипазы А2 в биологических жидкостях и тканях, базирующийся на установлении содержания метаболитов фосфолиполиза в
биологическом материале при участии метгемоглобина в кинетическом режиме без отбора
отдельных проб с использованием разностной спектрофотометрии (АD405-423) (прототип)
[6]. Показано, что метод позволяет определять активность ФЛА2 в бронхоальвеолярном
смыве, в препарате культуры клеток альвеолярных макрофагов и в среде культивирования. Недостаток - диагностический тест на этом биологическом материале является узкоприменимым (только для диагностики болезней дыхательных путей).
Задачей изобретения является разработка универсального способа выявления связанных с повышенной активностью фосфолипазы А2 воспалительных заболеваний, который
позволяет провести измерение в одну стадию с высокой чувствительностью (1020 нмоль/мл) на небольшом количестве доступного биологического материала (5-20 мкл
сыворотки крови).
Поставленная задача решается способом диагностики панкреатита по уровню А2 фосфолипазной активности сыворотки крови, отличающегося тем, что активность фосфолипазы А2 определяют с использованием в качестве субстрата мицелл, полученных из
фосфатидилхолина яичного желтка, взятого в концентрации 0,12-0,2 мМ, и тритона-Х100,
взятого в соотношении с фосфатидилхолином яичного желтка 1:(2-3), причем субстрат
вносят в буферный раствор рН 7,4-10,0, содержащий CaCl2 в концентрации 1-2 мМ и метгемоглобин в концентрации 3-12 мкМ, полученную смесь преинкубируют в течение 25 мин при 20-37 °С, вносят в две кюветы, добавляют в первую кювету 5-20 мкл сыворотки
крови обследуемого пациента, во вторую - контрольную - 5-20 мкл сыворотки крови здорового человека, выравнивают оптические плотности образцов в кюветах путем внесения
этанола в первую кювету и 20 мМ-ного раствора пальмитиновой кислоты в этаноле - во
вторую кювету, регистрируют при длинах волн 405 и 423 нм дифференциальные спектры
интенсивности абсорбции обоих образцов, по значениям ∆D403-423 определяют по калибровочному графику уровни А2 фосфолипазной активности в образцах, и если А2 фосфолипазная активность сыворотки крови в 2,6 раза больше у обследуемого пациента, чем у
здорового человека, диагностируют панкреатит.
В процессе фосфолиполиза с участием фосфолипазы А2 (ФЛА2) в образцах сыворотки
крови больных людей (опытная проба) и здоровых доноров (контрольная проба) под действием продукта реакции фосфолиполиза - жирной кислоты - происходит превращение
метгемоглобина в гемихром, что регистрируется по изменению спектра в видимой области. В каждой из проб различия в содержании двух форм гемоглобина сопровождаются
пропорциональным изменением разностного спектра. На фиг. 1 представлены спектры
поглощения, регистрируемые в течение 90 мин при добавлении 10 мкл сыворотки больного острым панкреатитом к 1 мл реакционной смеси при следующих условиях реакции:
[ФX] = 0,12 мМ, [Hb] = 5 мкМ, [Ca2+] = 2 мМ, t° = 20 °С. Разностный спектр определяется
спектрофотометрически (Солар) по величине максимума абсорбции при λ = = 423 нм и
минимума - при λ = 405 нм. Интенсивность поглощения между максимумом и минимумом
в разностном спектре (D = D1 + D2). Интенсивность спектральных изменений (∆D405-423)
пропорциональна концентрации образующейся жирной кислоты, а следовательно, и активности ФЛА2. При этом ∆D405-423 в опытной пробе > ∆D405-423 контрольной пробы
(фиг. 2А). Дифференциальные спектры met-Hb в условиях определения активности ФЛА2
в сыворотке донора (1) и в сыворотке больного острым деструктивным панкреатитом (2).
Приведенные ниже примеры определения активности ФЛА2 в образцах сыворотки крови
больных людей и здоровых доноров подтверждают возможность осуществления изобретения, не ограничивая его объем.
Пример 1.
Определение активности ФЛА2 в сыворотке крови больных воспалительными заболеваниями с повышенной фосфалипазной активностью.
3
BY 13143 C1 2010.04.30
Для проведения реакции готовят следующие реактивы:
1. 0,05 M Трис-НСl-буфер, рН 8,0.
2. Раствор фосфатидилхолина яичного желтка (ФX) в хлороформе, исходная концентрация 30-50 мкмоль/мл. Хранится при -18 °С.
3. Раствор метгемоглобина в Трис- HCl-буфере, исходная концентрация - 30-50 мкМ
(по гему). Взвешивают лиофилизованный метгемоглобин, исходя из расчета, что 1 мг сухого порошка дает около 28 нмоль по гему. Добавляют буферный раствор до концентрации 0,5 мг/мл. Оставляют на 2-3 ч для набухания, после чего раствор хорошо
перемешивают и центрифугируют 5 мин при 3000 об/мин для отделения нерастворившегося белка и апогемоглобина. Регистрируют спектр поглощения разведенного в 20-40 раз
супернатанта на Спекорде UV-VIS либо определяют А406 на спектрофотометре. Рассчитывают содержание метгемоглобина (по гему) с учетом разведения и длины оптического пути, используя коэффициент молярной экстинкции метгемоглобина 162000 M-1 см-1.
4. 0,1 M CaCl2.
5. 48 мМ Тритон X-100, водный раствор.
Далее готовят реакционную смесь. Для этого выпаривают исходный раствор фосфатидилхолина (ФХ) в количестве, эквивалентном 0,516 мкмоль. Оставляют на воздухе на 2030 мин для удаления паров хлороформа. Суспендируют в 100 мкл буферного раствора
0,05М Трис-HCl, рН 8,0. Солюбилизируют суспензию добавлением 21,5 мкл 48мМ раствора Тритона X-100 (до соотношения ФХ/Тритон = 1/2, моль/моль). Оставляют в холодильнике на 15-30 мин до полного просветления. Доводят объем полученных мицелл до
2,5 мл тем же буферным раствором и добавляют 86 мкл 0,1 M CaCl2. Исходный раствор
метгемоглобина добавляется в количестве 21,5 нмоль Конечный объем реакционной смеси - 4,3 мл.
В условиях определения активности ФЛА2 в сыворотке крови для получения калибровочной зависимости используют способ количественной характеристики амплитуды дифференциального спектра met-Hb (∆D), возникающего благодаря воздействию
отщепившихся при липолизе жирных кислот в опытной кювете. Через определенный промежуток времени (когда зафиксирован под действием эндогенной жирной кислоты четкий
дифференциальный спектр met-Hb) параллельно с реакцией в опытной кювете, содержащей сыворотку больного или здорового донора, титруют метгемоглобин в контрольной
кювете в отсутствии сыворотки, раствором экзогенно добавленной жирной кислоты (ЖК)
до минимизации разницы между максимумом и минимумом в дифференциальном спектре
(фиг. 3А, Б). Количество мкмоль ЖК, пошедшей на уравнивание двух кювет по пропусканию, эквивалентно приросту продукта (∆P) за время реакции с данным количеством сыворотки (фиг. 3А). На фиг. 3А представлены спектры пропускания при титровании
пальмитиновой кислотой met-Hb в контрольной кювете в следующих условиях реакции:
[ФХ] = 0,12 мМ, [Hb] = 5 мкМ, [СА2+] = 2 мМ. Концентрации ПК: 1 - 0,12 мМ; 2 - 0,24 мМ;
3 - 0,35 мМ; 4 - 0,47 мМ; 5 - 0,58 мМ; 6 - 0,7 мМ; t - 15 мин, объем сыворотки больного - 4 мкл.
Оптимальной для титрования выбрана 20 мМ концентрация пальмитиновой кислоты (ПК).
Титрование производят следующим образом: после проведения реакции в течение выбранного интервала времени (близкого к времени насыщения) в контрольную кювету начинала уменьшаться. Титрование проводят до тех пор, пока не прекращается снижение
∆Т. На фиг. 3Б представлен калибровочный график снижения ∆D по мере добавления
пальмитиновой кислоты в контрольную кювету. Титрование met-Hb пальмитиновой кислотой в контрольной кювете проводят в следующих условиях реакции [ФХ] = 0,12 мМ,
[Hb] = 5 мкМ, [Ca2+] = 2 мМ. Общее количество мкмоль ПК, пошедшей на титрование
продукта, образовавшегося в течение 60 мин инкубирования 4 мкл сыворотки донора с 1
мл раствора met-Hb составило 0,8 мкмоль, что соответствовало ∆Т = 25 мм (∆D = 0,038).
Активность ФЛА2 в сыворотке донора составляет 0,067 мкмоль/мин⋅мг белка, а в сыворотке больного - 0,176 мкмоль/мин⋅мг белка. На фиг. 2А представлены дифференциаль4
BY 13143 C1 2010.04.30
ные спектры met-Hb в условиях определения активности ФЛА2 в сыворотке донора (1) и в
сыворотке больного (2), для которых с помощью калибровки, представленной выше, рассчитана активность фермента (0,067 мкмоль/мин-мг белка и 0,176 мкмоль/мин⋅мг белка
соответственно). Активность ФЛА2 в сыворотке больного в 2,6 выше, чем у здорового донора.
Пример 2.
Определение активности ФЛА2 в сыворотке крови традиционным методом с использованием TCX для разделения продуктов реакции.
Для этого была проведена реакция с использованием в качестве субстрата мицелл, содержащих яичный фосфатидилхолин (ФХ) и анионный детергент холат натрия (соотношение 1:3, моль/моль) [7]. В качестве контроля используют смесь того же образца мицелл,
содержащую ионы кальция и буферный раствор той же концентрации, что и в опыте. По
истечении выбранного времени реакции (24 ч) продукты гидролиза фосфолипида разделяют методом TCX, экстрагируют хлороформ-метанольной смесью и анализируют на наличие неорганического фосфора по методу Васьковского [8], после чего рассчитывают
процент гидролиза исходного фосфолипида и активность ФЛА2 в испытуемом образце
(сыворотке, фиг. 2Б).
На фиг. 2Б представлена зависимость степени гидролиза ФХ в мицеллярной фазе,
сформированной холатом натрия (1:3), под воздействием сыворотки крови здорового донора и больного. Условия проведения реакции были следующие: [ФХ] = 0,51 мМ,
[Ca2+] = 2 мМ, t° комн. Реакционная смесь объемом 2,2 мл содержала 0,8 мл сыворотки.
Установлено, что активность ФЛА2 сыворотки больного в 2,7 выше активности фермента
здорового донора: степень гидролиза субстрата составляет 8,1 % и 22 % соответственно
(фиг. 2Б). Таким образом, получены сходные данные об активности ФЛА2 больного по
сравнению со здоровым донором, полученные двумя разными методами: предлагаемым
методом и используемым в клинической практике.
Однако чувствительность известного метода с использованием TCX не позволяет достоверно зафиксировать фосфолипазную активность в сыворотке донора спустя 20 ч от начала реакции. В то же время гемопротеидный метод позволяет детектировать активность
за этот промежуток времени даже в 20 мкл реакционной смеси данного образца: ∆Т = 41
мм, что соответствует ∆D = 0,0638 o.e.
Источники информации:
1. Савельев B.C., Буянов В.М., Огнев Ю.В. Острый панкреатит.- M.: Медицина, 1983.
2. Литвинко H.M. Активность фосфолипаз А2 и С при биохимическом моделировании.- Минск: Технопринт, 2002.
3. Асатиани B.C. Ферментные методы анализа.- M.: Наука, 1969.- С. 490.
4. Кисель М.А., Литвинко Н.М. Химико-фармацевтический журнал.- 1995.- № 6.С. 19-22.
5. Литвинко Н.М., Кисель М.А. Эндогенные фосфолипазы А2. Структура и функция. Минск: Навука i тэхнiка, 1991.- 270 с.
6. Скоростецкая Л.А., Головач О.А., Таганович А.Д., Литвинко Н.М. Молекулярные,
мембранные и клеточные основы функционирования биосистем: Сб. ст. / Под ред.
И.Д. Волотовского и др.- 2006. T. II.- С. 249-251 (прототип).
7. Ахрем А.А., Шумелина Т.А., Литвенко Н.М., Линник О.И., Кисель М.А. Изучение
специфичности фосфолипазы А2 на субсодержащих структурах, имеющих разную надмолекулярную организацию // Биохимия. - 1989. - Т. 54. - № 4. - С. 687-693.
8. Vaskovsky V.E., Kostetsky E.Y., Vasendin I.M. A universal reagent for phospholipid
analysis // J. Chromat. - 1975. - V. 114. - No 1. - P. 129-141.
5
BY 13143 C1 2010.04.30
Фиг. 1
Фиг. 2
Фиг. 3
Национальный центр интеллектуальной собственности.
220034, г. Минск, ул. Козлова, 20.
6
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
0
Размер файла
151 Кб
Теги
13143, патент
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа