close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Патент BY 02925

код для вставкиСкачать
ОПИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ПАТЕНТУ
РЕСПУБЛИКА БЕЛАРУСЬ
(19)
BY (11) 2925
(13)
C1
(51)
(12)
6
C 07K 7/06,
A 61K 38/08,
A 61K 38/36
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ПАТЕНТНЫЙ
КОМИТЕТ РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ
(54)
ПЕПТИДЫ, ОБЛАДАЮЩИЕ АНТИКОАГУЛЯНТНЫМ ДЕЙСТВИЕМ
(21) Номер заявки: 2012
(22) 1994.06.30
(46) 1999.09.30
(71) Заявители: Голубович В.П., Мартинович В.П.
(BY)
(72) Авторы: Калихевич В.Н., Ардемасова З.А. (RU),
Голубович В.П. (BY), Петросян М.Т., Левицкая
Н.Г. (RU), Мартинович В.П. (BY)
(73) Патентообладатели: Голубович
Владимир
Петрович, Мартинович Вера Павловна (BY)
(57)
Пептиды общей формулы Gly-Pro-Arg-Pro-X-Y, где X-Y= ε AK-Arg ( ε AK- ε аминокапроновая кислота) или
Arg-Pro, или β Ala-Arg, обладающие антикоагулянтным действием.
BY 2925 C1
(56)
1. Laudano A. P., Doolittle R.F. Synthetik peptide derivates that bind to fibrinogen and prevent the polymerization of fibrin monomers.- Proc. Nat. Acad. Sci USA, 1978, vol. 75. - № 7. - Р. 3085-3089.
2. Laudano A.P., Doolittle R.F. Studies of synthetic peptides that bind to fibrinogen and prevent fibrin polymerization. Structural requirements, member a binding sites, and species differences. Biochemistry, 1980, vol. 19. - № 5.
- Р. 1013-1019.
Настоящее изобретение относится к пептидам антикоагулянтного действия - структурным аналогам Nконцевого сегмента Аα-цепи фибрина, которые регулируют процессы полимеризации фибрина и тромбообразования и могут быть использованы как препараты, подавляющие процесс свертывания крови.
Известны ингибиторы тромбообразования пептидной природы. Так, N-концевой сегмент Аα-цепи фибрина Gly-Pro-Arg способен избирательно связываться с определенными участками молекулы фибриногена и
блокировать процесс фибринообразования [1,2]. Добавление к этой последовательности аминокислотного
остатка пролина или саркозина значительно увеличивает связывающую и ингибирующую активность: GlyPro-Arg-Pro является наиболее активным ингибитором полимеризации фибрина из всех пептидных соединений, исследованных Лаудано и Дулитлом / 2 /.
С учетом данных о потере активности при модификации аминоконца и важности конформационного состояния
пептидов, связывающихся с фибриногеном [1,2], были синтезированы и исследованы аналоги Gly-Pro-Arg-Pro, удлиненные с С-конца остатком Lys или Arg. Активность Gly-Pro-Arg-Pro-Lys и Gly-Pro-Arg-Pro-Arg превышает активность тетрапептида в 2-3 раза при молярном соотношении фибриноген-пептид 1:50. Предполагается, что остатки Lys или Arg в пятом положении оптимально стабилизируют структуру пептида, а дополнительная NН2-rpyпna
способствует его взаимодействию с белком. Однако в исследованиях на плазме крови обнаружено, что действие
этих пептидов непродолжительно, они проявляют активность в течение 30-60 минут.
Задачей настоящего изобретения является получение соединений с антикоагулянтной активностью общей
формулы Gly-Pro-Arg-Pro-X-Y (1), где X-Y = ε-АК-Arg (ε-АК-аминокапроновая кислота) или Arg-Pro, или β-AlaArg, ингибирующие процесс полимеризации фибрина в плазме крови или русле кровопотока, проявляющие действие в течение 60-120 минут.
Проведенная модификация Gly-Pro-Arg-Pro - удлинение пептидной цепи, в том числе за счет введения
дополнительных метиленовых звеньев, позволила получить соединения с высокой антикоагулянтной активностью и пролонгированного действия, которые проявляют свою активность не только in vitro в модельной
системе тромбин-фибриноген, но и в плазме крови. Теоретический конформационный анализ этих пептидов
BY 2925 C1
показал, что у всех их сохранена "биологически активная" конформация, необходимая для связывания с
фибриногеном, проведенные по С-концу модификации дополнительно стабилизируют эту конформацию.
Пептиды с С-концевым аргинином (Gly-Pro-Arg-Pro-ε-AK-Arg, Gly-Pro-Arg-Pro-β-Ala-Arg) получают последовательным присоединением активированных эфиров Nα - защищенных аминокислот или дипептидов к
С-концевым фрагментам, используя внутреннее солеобразование карбоксила и гуанидиновой группы аргигина для блокирования реакционной способности гуанидиновой группы. При синтезе Gly-Pro-Arg-Pro-ArgPro также используют присоединение активированных эфиров Nα - бензилоксикарбониламинокислот или Nα,
NG , NG’ - трибензилоксикарбониларгинина к растущей пептидной цепи с С-концевым пролином. Бензилоксикарбонильную группу удаляют гидрированием в метаноле над 10 % палладием, осажденным на угле. Пептиды на этой стадии получают со свободными непротонированными аминогруппами, что позволяет сразу
использовать их в реакциях конденсации с активированными эфирами. Синтез по разработанным схемам позволяет получать целевые пептиды с минимальным числом стадий и высокими постадийными выходами.
Процессы синтеза, удаления защитных групп и индивидуальность полученных соединений контролируют
тонкослойной хроматографией на пластинках с закрепленным слоем силикагеля (Мерк, ФРГ), а также электрофорезом на бумаге ФН-12 (Фильтрак, ФРГ) при градиенте потенциала 30 в/см в 2 %-ой уксусной кислоте
(рН 2,6). Электрофоретическую подвижность определяют по отношению к гистидину,
Приведены хроматографические подвижности в системах: (А) - н.бутанол - уксусная кислота - вода, 3:1:1;
(Б)- этилацетат - пиридин - уксусная кислота - вода, 60:20:6:11; (В) - н.бутанол - уксусная кислота - пиридин - вода, 30:6:20:24, (Г) - бензол - этилацетат - уксусная кислота, 100:50:2; (Д) - н.бутанол - уксусная кислота - пиридин – вода, 6:1:1:2; (E) - н.бутанол - уксусная кислота - вода - этилацетат, 3:1:1:3. Проявление пластинок
хлорбензидиновым методом. Элементный анализ проводят на автоматическом C,H,N анализаторе 185 В
Хьюлетт Паккард. Данные элементного анализа полученных соединений соответствуют вычисленным значениям.
Аминокислотный анализ пептидов, гидролизированных в запаянных ампулах 6 н НСI при 110 ° С в течение 20 часов, выполняют на автоматическом аминокислотном анализаторе ААА-349 (Чехия). Удельное вращение определяют на автоматическом спектрополяриметре Перкин-Элмер МС 241.
Температура плавления определена на приборе Кофлера и проведена без коррекции.
Растворы веществ в органических растворителях высушивают безводным Na2SO4 и упаривают в вакууме
на ротационном испарителе при температуре не выше 40 °С. Твердые вещества высушивают в вакуумэксикаторе над КОН и Р2О5.
Пример 1. Глицил-пролил-аргинил-пролил-ε-аминокапроил-аргинин, диацетат.
1. Бензилоксикарбонил-ε-аминокапроил-аргинин (I).
К раствору 1, 90 г (4,4 ммоль) пентафторфенилового эфира бензилоксикарбонил-ε-аминокапроновой кислоты в 9 мл ДМФА прибавляют 0,61 г (3,55 ммоль) аргинина. После перемешивания в течение 12 часов реакционную смесь разбавляют этилацетатом, выпавший осадок отфильтровывают и высушивают. Получают
1,32 г (86 %) соединения I. [α]D20 +10,4° (с 1, МеОН); Rf 0,50 (А), 0,30 (E).
2. Бензилоксикарбонилпролил-ε-аминокапроил-аргинин (II).
1,14 г (2,6 ммоль) соединения 1 гидрируют в метаноле над Pd/C. После окончания гидрирования (контроль ТСХ) катализатор отфильтровывают, раствор упаривают досуха, к остатку прибавляют раствор 1,18 г
(4,4 ммоль) оксисукцинимидного эфира бензилоксикарбонилпролина в 8 мл ДМФА. Смесь перемешивают
24 часа и разбавляют этилацетатом. Выпавший осадок отфильтровывают и высушивают. Получают 1,40 г (95
%) соединения II, [α]D20 -17,2° (с 1, МеОН); Rf 0,39 (А), 0,30 (Б).
3. Трибензилоксикарбониларгинил -пролил -ε-аминокапроил-аргинин (III).
0,54 г ( 1 ммоль) соединения II гидрируют в метаноле над Pd/C. После окончания гидрирования катализатор отфильтровывают, раствор упаривают досуха, к остатку прибавляют раствор 0,9 г (1,25 ммоль) пнитрофенилового эфира трибензилоксикарбониларгинина в 7 мл ДМФА. Смесь перемешивают 24 часа и
разбавляют эфиром. Выпавший осадок отфильтровывают, растворяют в хлороформе и наносят на колонку
15х50 мм с суспензией силикагеля L 40/100 в хлороформе. Затем колонку промывают тремя объемами хлороформа и далее элюируют продукт смесью хлороформа с метанолом с повышающимся содержанием спирта от 20 % до 40 %. Объединенные фракции, содержащие целевой продукт, упаривают и осаждают эфиром.
Полученный аморфный осадок отфильтровывают и высушивают. Получают 0,58 г (60 %) соединения III,
[α]D20 - 41,7° (с 1, МеОН); Rf 0,54 (А), 0,23 (Б).
4. Бензилоксикарбонилглицил-пролил-аргинил-пролил-ε-аминокапроил-аргинин (IV).
0,12 г (0,12 ммоль) соединения III гидрируют в метаноле с добавлением нескольких капель уксусной кислоты над Pd/C. После окончания гидрирования катализатор отфильтровывают, раствор упаривают досуха и
к остатку добавляют раствор 0,08 г (0,17 ммоль) пентафторфенилового эфира бензилоксикарбонилглицилпролина в 1 мл ДМФА. Через 2 часа реакционную смесь разбавляют этилацетатом, выпавший аморфный
осадок отфильтровывают и высушивают. Получают 0,09 г (0,12 ммоль) (100 %) соединения IV, [α]D20 - 55,0°
(с I, MeOH); Rf 0,47 (В), 0,25 (Д).
2
BY 2925 C1
5. Глицил-пролил-аргинил-пролил-ε-аминокапроил-аргинин, диацетат (V).
0,058 г (0,07 ммоль) соединения IV гидрируют в 5 мл метанола с добавкой нескольких капель уксусной
кислоты над Pd/C. После окончания гидрирования катализатор отфильтровывают раствор упаривают до малого объема и разбавляют сухим эфиром. Выпавший осадок отфильтровывают и высушивают. Получают 0,057
г (100 %) соединения V, [α]D20 -50,2° (с 1, МеОН); Rf 0,30 (В), Е 1,00. Данные аминокислотного анализа: глицин 1,00 (1), аргинин 1,98 (2), пролил 1,92 (2).
Пример 2. Глицил-пролил-аргинил-пролил-аргинил-пролин.
1. Трибензилоксикарбонил-аргинил-пролин (Ia).
0,40 г (3,6 ммоль) пролина растворяют в 3,6 мл I н. NaOH и прибавляют раствор 1,7 г (2,4 ммоль) Z.-ArgOSu в 8 мл диоксана. Через сутки диоксан упаривают в вакууме, остаток подкисляют I н. НС1. Выпавшее
масло экстрагируют этилацетатом, экстракт промывают водой, насыщенным раствором NaCl, сушат, упаривают. Полученное масло массой 1,6 г (100 %) хроматографически однородное. [α]D20 - 58,1° (с 1, МеОН); Rf
0,42 (Г). Т. пл. дициклогекси-ламмониевой соли = 119-121° С.
2. Бензилоксикарбонилпролил-аргинин-пролин (IIа).
1,6 г (2,4 ммоль) соединения Ia гидрируют в метаноле над Pd/C. После окончания гидрирования катализатор отфильтровывают, раствор упаривают досуха, к остатку добавляют раствор 1 г (2,9 ммоль) Z-Pro-OSu в
7 мл ДМФА. Смесь перемешивают 24 часа и разбавляют эфиром. Выпавший осадок отфильтровывают, растворяют в хлороформе и наносят на колонку 15х50 мм с суспензией силикагеля L 40/ в хлороформе. Затем
колонку промывают тремя объемами хлороформа и далее элюируют смесью хлороформа и метанола с повышающимся содержанием спирта от 20 % до 40 %. Объединенные фракции, содержащие целевой продукт,
упаривают и осаждают эфиром. Полученный аморфный осадок отфильтровывают и высушивают. Получают
0,84 г (70 %) соединения IIа, [α]D20 - 80,3° (с 1, МеОН); Rf 0,30 (А), 0,56 (В).
3. Трибензилоксикарбониларгинил-пролил-аргинил-пролин (IIIа).
0,4 г (0,8 ммоль) соединения IIа гидрируют в метаноле над Pd/C. После окончания гидрирования катализатор отфильтровывают, раствор упаривают досуха, к остатку прибавляют раствор 0,7 г (1 ммоль) Z3 -ArgONp в 5 мл ДМФА. Через сутки реакционную смесь разбавляют этилацетатом, содержащим 10 %
н.бутанола, и промывают водой. Органический слой упаривают до малого объема и прибавляют эфир. Выпавший осадок отфильтровывают, растворяют в хлороформе и наносят на колонку 15х50 мм с суспензией
силикагеля L 40/100 в хлороформе. Колонку промывают тремя объемами хлороформа и далее элюируют
продукт смесью хлороформа с метанолом (4:1). Фракции, содержащие целевой продукт, упаривают, содержимое высаждают эфиром. Полученный аморфный осадок отфильтровывают и высушивают. Получают 0,45
г (60 %) соединения IIIа, [α]D20 - 70,6° ( с 1, МеОН); Rf 0,40 (А), 0,23 (Б), 0,49 (В).
4. Бензилоксикарбонилглицил-пролил-аргинил-пролил-аргинил-пролин (IVa).
0,25 г (0,27 ммоль) соединения IIIа гидрируют в метаноле с добавлением нескольких капель уксусной кислоты над Pd/C. После окончания гидрирования катализатор отфильтровывают, раствор упаривают досуха, к
остатку прибавляют раствор 0,17 г (0,35 ммоль) Z-Gly-Pro-Opfp в 6 мл ДМФА. Через сутки реакционную
смесь разбавляют этилацетатом, выпавший аморфный осадок отфильтровывают, высушивают и обрабатывают смесью 10 мл хлороформа и 12 мл воды. Водный слой, содержащий целевой продукт, отделяют и упаривают досуха с изопропиловым спиртом. Получают 0,20 г (92 %) соединения IVа, [α]D20 - 32,3° (с 1, МеОН); Rf 0,46 (В).
5. Глицил-пролил-аргинил-пролил-аргинил-пролин, диацетат (Vа).
0,20 г (0,25 ммоль) соединения IVa гидрируют в метаноле с добавлением уксусной кислоты над Pd/C. После окончания гидрирования катализатор отфильтровывают, раствор упаривают до малого объема и добавляют сухой эфир. Выпавший осадок отфильтровывают и высушивают. Получают 0,20 г соединения Va,
[α]D20 - 91,9° (с 1, MeOH); Rf 0,ll (В).
Данные аминокислотного анализа: глицин 1,00 (1), пролин 2,85 (3), аргинин 2,05 (2).
Пример 3. Глицил-пролил-аргинил-пролил-β-аланил-аргинин, диацетат.
1. Трет. бутилоксикарбонил-β-аланил-аргинин (1б).
К раствору 1,4 г (4 ммоль) пентафторфенилового эфира трет. бутилоксикарбонил-β-аланина в 7 мл
ДМФА прибавляют 0,52 г (3 ммоль) аргинина. После перемешивания в течение 12 часов реакционную смесь
разбавляют этилацетатом, выпавший аморфный осадок отфильтровывают и высушивают. Получают 1,04 г
(100 %) соединения 1б, [α]D20 + 6,3° (c 1, MeOH); Rf 0,39 (A), 0,60 (В).
2. Бензилоксикарбонилпролил-β-аланил-аргинин (IIб).
0,7 г (2 ммоль) соединения Iб растворяют в 7 мл ледяной уксусной кислоты и прибавляют равный объем
2 н. HCl/AcOH. После выдерживания в течение часа при комнатной температуре реакционную смесь упаривают, остаток обрабатывают сухим эфиром. Полученный осадок отфильтровывают и высушивают. Затем
вещество растворяют в небольшом количестве метанола и раствор обрабатывают ионообменной смолой
ДАУЭКС 1х8 в ОН= форме до отрицательной реакции на ион Сl=. Смолу отфильтровывают, раствор упаривают досуха и к остатку прибавляют раствор 0,86 г (2,5 ммоль) Z-Рго-OSu в 6 мл ДМФА. Смесь перемеши3
BY 2925 C1
вают 24 часа, разбавляют этилацетатом, выпавший аморфный осадок отфильтровывают и высушивают. Получают 0,9 г (95 %) соединения Iiб, [α]D20 - 6,1° (с 1, MeOH); Rf 0,42 (А), 0,53 (В).
3. Трибензилоксикарбониларгинил-пролил-β-аланил-аргинин (IIIб).
0,48 г (1 ммоль) соединения IIб гидрируют в метаноле над Pd/C. После отделения катализатора раствор
упаривают досуха, к остатку прибавляют раствор 0,9 г (1,25 ммоль) Z-Arg-ONp в 6 мл ДМФА. Смесь перемешивают 24 часа и разбавляют эфиром. Выпавший осадок отфильтровывают, растворяют в хлороформе и наносят на колонку' 15х50 мм с суспензией силикагеля L 40/100 в хлороформе. Затем колонку промывают тремя
объемами хлороформа и далее элюируют продукт смесью хлороформа с метанолом с повышающимся содержанием спирта от 20 % до 40 %. Объединенные фракции, содержащие целевой продукт упаривают и обрабатывают эфиром. Полученный аморфный порошок отфильтровывают и высушивают. Получают 0,55 г (60 %)
соединения IIIб, [α]D20 + 6,6° (с 1, МеОН); Rf 0,54 (А), 0,21 (В).
4. Пентафторфениловый:эфир бензилоксикарбонилглицил-пролина (IVб).
К раствору 0,31 г (1 ммоль) Z-Gly-Рго в 5 мл ДМФА, охлажденном до 0 °С, прибавляют 0,76 г (1 ммоль)
комплекса "F". Реакционную смесь перемешивают 10 мин и оставляют на 24 часа при комнатной температуре, затем разбавляют этилацетатом, отфильтровывают дициклогексилмочевину, раствор промывают 5 %
NaHCO3, водой, насыщенным раствором NaCl и высушивают безводным Na2SO4. После упаривания оставшееся масло закристаллизовывают под гексаном. После кристаллизации из смеси этилацетата с гексаном
получают 0,38 г (80 %) соединения Ivб, Т. пл. 79-81 °С, [α]D20 - 13,4° (с 1, ДМФА); Rf 0,69 (Г).
5. Бензилоксикарбонилглицил-пролил-аргинил-пролил- β-аланил-аргинин (Vб).
0,11 г (0,12 ммоль) соединения IIIб гидрируют в метаноле с добавлением нескольких капель уксусной кислоты над Pd/C. После окончания гидрирования катализатор отфильтровывают, раствор упаривают досуха и
к остатку прибавляют раствор 0,07 г (0,15 ммоль) соединения IVб в 1 мл ДМФА. Через 24 ч реакционную
смесь разбавляют этилацетатом, выпавший аморфный осадок отфильтровывают и высушивают. Получают
0,095 г (100 %) соединения Vб, [α]D20 -42,9°(с 1, MeOH); Rf 0,39(Б), 0,23 (Д).
6. Глицил-пролил-аргинил-пролил-β-аланил-аргинин, диацетат (Vб).
0,08 г (0,1 ммоль) соединения Vб гидрируют в метаноле с добавкой уксусной кислоты над Pd/C. После
окончания гидрирования катализатор отфильтровывают, раствор упаривают до малого объема и разбавляют
сухим эфиром. Выпавший осадок отфильтровывают и высушивают. Получают 0,07 г (100 %) соединения Vб,
[α]D20 - 31,5° (с 1, МеОН); Rf 0,95 (В), Еhis 1.00. Данные аминокислотного анализа: глицин 1,00 (10, аргинин
2,04 (2), пролин 1,94 (2).
Эксперименты по изучению антикоагулянтного действия пептидов были проведены в условиях in vitro (в
системе фибриноген-тромбин) и на плазме крови человека, полученной со станции переливания крови. Следует отметить, что в модельной системе все ранее изученные нами пептиды проявляли существенную активность, которая заметно падала в плазме крови в связи с деградацией их под действием пептидов, поэтому
эксперименты на плазме крови были определяющими для выявления физиологически активных препаратов.
В опытах использовали плазму, полученную центрифугированием из цитратсодержащей крови человека.
Концентрацию фибриногена в плазме определяли методом Бидвела. Исследуемые пептиды добавляли в молярном соотношении к белку 100:1. В контроле к плазме добавляли соответствующий объем цитратного буфера. Время свертывания после добавления в плазму раствора тромбина в концентрации 0,1 % наблюдали по изменению мутности на спектрометре при λ=350 нм. Среди рассмотренных пептидов нами были обнаружены три препарата, которые проявляют
антикоагулянтную активность в течение двух часов после введения, в отличие от ранее полученных соединений, которые сохраняли активность в плазме крови в течение 30-60 минут. Результаты испытаний Gly-ProArg-Pro-ε-AK-Arg, Gly-Pro-Arg-Pro-Arg-Pro, Gly-Pro-Arg-Pro-β-Ala-Arg представлены в таблице.
Пептид
Gly-Pro-Arg-Pro-ε-AK-Arg
Gly-Pro-Arg-Pro-Arg-Pro
Gly-Pro-Arg-Pro-β-Ala-Arg
0
5,4+0,5
4,5+0,5
4,5+0,5
Время после введения пептида в плазму
крови/мин
30
60
2,8+0,3
1,4+0,2
3,0+0,3
2,6+0,3
3,0+0,3
1,9+0,2
120
1,1+0,1
1,8+0,2
1,2+0,1
Представленные в таблице величины являются соотношением времен свертывания крови в присутствии
пептида и без него при добавлении тромбина.
Как видно из таблицы, пептид Gly-Pro-Arg-Pro-ε-AK-Arg проявляет наибольшую активность при введении в плазму, а пептид Gly-Pro-Arg-Pro-Arg-Рго наиболее устойчив к действию пептидаз. По сравнению с известным антикоагулянтом прямого действия гепарином заявляемые пептиды обладают более мягким физио4
BY 2925 C1
логическим действием, целенаправленно влияют на свертывающую систему крови и легко выводятся из кровотока за счет собственных ресурсов организма. Данные соединения обладают низкой токсичностью. При
внутривенном введении препаратов белым беспородным мышам летальная доза не была достигнута даже
при соотношении 0,1 г на 1 кг живого веса, что превышает терапевтические дозы на несколько порядков.
Представленные пептиды могут найти применение в медицине при трансфузии, гемодиализе, гемосорбции, а
также, возможно, и в хирургической практике.
Государственный патентный комитет Республики Беларусь.
220072, г. Минск, проспект Ф. Скорины, 66.
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
0
Размер файла
186 Кб
Теги
02925, патент
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа