close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Патент BY 04124

код для вставкиСкачать
ОПИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ПАТЕНТУ
РЕСПУБЛИКА БЕЛАРУСЬ
(19)
BY (11) 4124
(13)
C1
(51)
(12)
7
C 07K 14/785,
A 61K 38/17
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ПАТЕНТНЫЙ
КОМИТЕТ РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ
(54)
ПОЛИПЕПТИДЫ, ОБЛАДАЮЩИЕ АКТИВНОСТЬЮ ЛЁГОЧНОГО
ПОВЕРХНОСТНО-АКТИВНОГО ВЕЩЕСТВА, И ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ
КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ РЕСПИРАТОРНОГО ДИСТРЕСССИНДРОМА У МЛЕКОПИТАЮЩИХ
(21) Номер заявки: 960861
(22) 1996.12.30
(86) PCT/EP 95/02028, 1995.05.27
(31) P 44 18 936.2
(32) 1994.05.31
(33) DE
(46) 2001.09.30
(71) Заявитель: Бик Гульден Ломберг Хемише
Фабрик ГмбХ (DE)
(72) Авторы: НЭЙВ, Рюдигер, УЛЬРИХ, ВольфРюдигер, ШТУРМ, Эрнст, КРЮГЕР, Уве,
ХЕФНЕР,
Дитрих,
ШЁФЕР,
Клаус,
МЕЛЬХЕРС, Клаус (DE)
(73) Патентообладатель: Бик
Гульден
Ломберг
Хемише Фабрик ГмбХ (DE)
(57)
1. Полипептиды, обладающие активностью легочного поверхностно-активного вещества, общей формулы I:
BY 4124 C1
, (I)
где А − Н или Phe,
B − Phe или Trp,
C − Ile, Leu или Ser.
2. Полипептид по п. 1, отличающийся тем, что А − H или Phe, B − Phe, С −Ile.
3. Полипептид по п. 1, отличающийся тем, что A − Phe, B − Phe, C − Ile.
4. Полипептид по п. 1, отличающийся тем, что А − Н, В − Phe, С − Ile.
5. Фармацевтическая композиция для лечения респираторного дистресс-синдрома (РДС) у млекопитающих, включающая действующее вещество в эффективном количестве, фосфолипиды и жирную кислоту, отличающаяся тем, что в качестве действующего вещества она содержит легочный поверхностно-активный
полипептид по любому из пп. 1-4 и дополнительно содержит электролиты.
6. Фармацевтическая композиция по п. 5, отличающаяся тем, что она дополнительно содержит, по
меньшей мере, один легочный поверхностно-активный полипептид из группы SP-A и SP-B.
7. Фармацевтическая композиция по п. 6, отличающаяся тем, что она содержит SP-B.
8. Фармацевтическая композиция по п. 5, отличающаяся тем, что в качестве фосфолипидов она содержит дипальмитоилфосфатидилхолин (ДПФХ), пальмитоилолеилфосфатидилглицерин (ПОФГ) и/или фосфатидилглицерин (ФГ).
9. Фармацевтическая композиция по п. 5, отличающаяся тем, что в качестве жирных кислот она содержит пальмитиновую кислоту.
BY 4124 C1
10. Фармацевтическая композиция по п. 5, отличающаяся тем, что в качестве электролитов она содержит соли кальция и/или натрия.
(56)
WO 91/18015.
WO 89/04326.
WO 93/21225.
EP 0119056 A2, 1983.
EP 0406732 A2, 1989.
Изобретение относится к легочным поверхностно-активным полипептидам, способу их получения и к содержащим их композициям.
Легкие всех позвоночных животных содержат смесь веществ, называемую как "легочное поверхностноактивное вещество". Она проявляет поверхностно-активные свойства и настолько понижает поверхностное
натяжение в альвеолярной области легких, что предотвращается коллапс конечных участков дыхательных
путей при выдохе. Эта смесь веществ регулирует поверхностное натяжение динамическим образом, так что
ожидаемый, согласно закону Лапласа, коллапс мелких альвеол в пользу более крупных благодаря соответствующей адаптации поверхностного натяжения не происходит. В результате этого образуется хорошо сбалансированная, гистологически и физиологически стабильная структура легких.
Легочное поверхностно-активное вещество выделяется альвеолярными пневмоцитами типа II в виде пластинчатых телец. Они представляют собой компактные образования из фосфолипидных двойных слоев с высоким содержанием дипальмитоилфосфатидилхолина (ДПФХ) и фосфатидилглицерина (ФГ). Другими основными компонентами, содержащимися в легочных поверхностно-активных веществах, являются
протеины, которые обозначаются как SP-A, SP-B и SP-C. SP-A представляет собой высокомолекулярный
гликопротеин, играющий основную роль в регуляции секреции.
Протеины SP-C и в меньшей степени SP-B выполняют функцию "термодинамических катализаторов" при
формировании мономолекулярной поверхностной пленки (в более узком смысле - поверхностно-активного
вещества). Благодаря наличию этих протеинов кинетика расширения чрезвычайно ускоряется. Только вследствие этого без задержек возможна адаптация состава поверхностно-активного вещества к соответствующим
требованиям поверхностного натяжения. Эти свойства отражаются в крайне гидрофобном характере протеинов, в частности SP-C.
Путем экстракции легочной ткани или промывки легких животных можно получить препараты поверхностно-активного вещества, которые как в физико-химической измерительной аппаратуре, например на животных моделях, так и при клиническом применении проявляют способность компенсировать недостаток поверхностно-активного вещества и тем самым пригодны, например, для терапии детского синдрома удушья
(респираторный дистресс-синдром новорожденных (РДСН)). Однако этим препаратам, полученным из животных, присущи серьезные недостатки.
Состав фосфолипидов сильно зависит от вида животного, его здоровья и состояния питания и может
быть лишь в ограниченной степени сбалансирован примешиванием определенных компонентов. Содержание
поверхностно-активных протеинов, а также соотношение SP-B/SP-C подвержено тем же неопределенностям.
Кроме того, в терапевтически применяемой смеси также содержатся возможные продукты протеолитического разложения протеинов или модифицированные производные (например, в результате окисления метионина). При продолжительном применении или аппликации больших количеств поверхностно-активного вещества, что может быть необходимо, например, при синдроме удушья у взрослых (шоковые легкие,
респираторный дистресс-синдром взрослых (РДСВ)) или в других случаях применения, например при использовании поверхностно-активного вещества в качестве "буксира" для других веществ при легочной аппликации, вопрос, связанный с пополнением вещества, остается открытым.
Поэтому эти проблемы предлагается решать путем получения протеинов методами генной инженерии.
Так как рекомбинантные протеины, в частности при применении бактериальных систем экспрессии, могут
быть получены практически в неограниченных количествах и существует возможность применения современных методов анализа и контроля качества, то, используя синтетические фосфолипиды, можно получить
поверхностно-активное вещество точно определенного состава. Это вещество может оптимально удовлетворять терапевтическим требованиям.
Центральная часть человеческого протеина SP-C (см. формулу (I), где А - Н или Phe; В - Cys; С - Met), который особенно важен для кинетики расширения, состоит исключительно из алифатических, очень гидрофобных аминокислот, таких как валин, лейцин и изолейцин. Длина этой центральной части (аминокислоты
12-34) позволяет интегрировать пептид в мономолекулярную фосфолипидную пленку. В последовательности
Pro-Cys-Cys-Pro (позиция 3-6) оба Cys-остатка тиоэтерифицированы пальмитиновой кислотой по SH2
BY 4124 C1
группам. Пальмитиновая кислота дополнительно повышает гидрофобный характер всего протеина и одновременно закрывает обе SH-группы цистеинов и защищает их от окисления и образования дисульфидного
мостика. Центральная область (аминокислоты 13-34) образует трансмембранную пространственную спираль.
Эта область примыкает к N-концу с помощью полярной последовательности, содержащей положительно заряженные аминокислоты (Lys, 10: Arg, 11).
В международной заявке WO 91/18015 описывается получение рекомбинантного SP-С и мутантов SP-C.
В этой заявке, помимо прочего, предлагается заменить оба цистеина в положениях 4 и 5 двумя серинами.
Преимущество этого при получении состоит в том, что после выделения очень гидрофобного протеина отпадает необходимость в технически трудоемком пальмитоилировании обоих цистеинов.
Неожиданно было обнаружено, что SP-С-мутанты, отличающиеся от человеческого белка SP-C заменой
обоих цистеинов в положениях 4 и 5 фенилаланином или триптофаном и заменой метионина в положении 32
изолейцином, лейцином или серином, не обладают никакими функциональными потерями в сравнении с
природным SP-C, а в отношении стабильности даже превосходят его. При этом значительно упрощается получение с использованием методов генной инженерии с достижением более высокого выхода. Новые полипептиды с легочной поверхностной активностью могут быть получены с высокой чистотой.
Предметом изобретения являются поэтому полипептиды с легочной поверхностной активностью, имеющие аминокислотную последовательность общей формулы I:
,
где А - Н или Phe;
В - Phe или Trp и
С - Ile, Leu или Ser.
Предпочтительным предметом изобретения являются полипептиды обшей формулы (I), где А обозначает
Н или Phe, В обозначает Phe и С обозначает Ile, при этом наиболее предпочтительно А обозначает Н, В обозначает Phe и С обозначает Ile.
Еще одним предметом изобретения являются фармацевтические композиции, которые отличаются тем,
что содержат один или несколько полипептидов по изобретению и при необходимости дополнительно содержат один или несколько легочных поверхностно-активных полипептидов из группы SP-A и SP-B, предпочтительно SP-B.
Полипептиды по изобретению могут быть получены либо по известным методам твердофазного пептидного синтеза, либо с помощью соответствующих рекомбинантных векторов в клетках-хозяевах. Методы
конструирования векторов, методы трансформирования клеток, методы, вызывающие экспрессию протеина
в трансформированных клетках, и методы выделения и очистки экспрессированных протеинов известны
специалистам в данной области техники (WO 86/03408, WO 87/06588 и WO 91/18015). При получении векторов для экспрессии SP-C в бактериальных системах используют обычные методы рекомбинантной ДНК.
Экспрессия гидрофобного SP-С-протеина в бактериях возможна в большом количестве и без ущерба для
клетки-хозяева только в форме пригодных слитых протеинов, как, например, совместно с хлорамфениколацетилтрансферазой (CAT). Например, вектор pTrpAmpCAT152 кодирует N-терминальную область CAT и
предназначен для клонирования "внутри рамки считывания" (5'-)EcoRI- и (3'-)РstI-фрагментов ДНК, кодирующих SP-C. CAT и SP-C связываются при этом на белковом уровне друг с другом через чувствительное к
гидроксиламину место слияния (AsN ↓ Сly). Такие векторы, как pTrpAmpCAT152::SPC, позволяют осуществлять контролируемую экспрессию соответствующих слитых протеинов вплоть до производственного масштаба (ферментация). Экспрессия слитых белков вызывает образование телец включения в клетке-хозяине.
При этом длина доли САТ в слитом протеине может быть изменена таким образом, что будут достигнуты
высокие выходы телец включения при высокой доли SP-C.
Помимо бактерий экспрессия может происходить и в большом количестве систем-хозяевах, например в
клетках млекопитающих, дрожжей и насекомых. Пригодные для различных клеток-хозяев конструкции ДНК
синтезируют по известным методам и встраивают обычным образом с соответствующими управляющими
последовательностями в геном клеток-хозяев.
На синтезаторе ДНК MilliGen/Biosearch Cyclone обычным фосфоамидитным методом могут быть синтезированы два олигонуклеотида ДНК.
Первый олигонуклеотид ДНК образует кодирующую (нетранскрибируемую) нить ДНК длиной 118 нуклеотидов. Эта нить кодирует (в направлении 5'→3') специфический в отношении EcoRI 5'-конец для последующего субклонирования, место расщепления Asn/Gly гидроксиламином и человеческий SP-C, начиная с
Gly-25 и кончая Leu-58 SР-С-последовательности-предшественника, т.е. Gly-1, соответственно Leu-34 в
3
BY 4124 C1
формуле (I). При этом известная аминокислотная последовательность человеческого SP-С-протеина по правилам генетического кода переводится в ДНК. Однако последовательность модифицируется таким образом,
что оба цистеина в положениях 28 и 29 SP-С-последовательности-предшественника заменяются фенилаланином или триптофаном, а метионин в положении 56 последовательности-предшественника заменяется изолейцином, лейцином или серином. Таким же образом дополнительно могут быть учтены частоты использования кодона клетки-хозяина. Измененная SP-С-последовательность, содержащая в положениях 4 и 5
фенилаланин и в положении 32 изолейцин (нумерация согласно формуле (I)), обозначается в соответствии с
обычным однобуквенным кодом для этих обеих аминокислот как SPC34(FF/I). Далее смысловая нить ДНК
содержит терминирующий ТАА-кодон для прерывания рибосомной трансляции, а также специфический в
отношении PstI 3'-конец. Второй олигонуклеотид ДНК представляет собой комплементарную, некодирующую (антисмысловую) нить, состоящую из 110 нуклеотидов.
Синтетически полученный SP-С-фрагмент ДНК клонируют в пригодный вектор экспрессии, как, например, pTrpAmpCAT152. Этот вектор составлен из рКК233 (фирма Pharmacia), содержащего ген устойчивости
к ампициллину и являющегося производным pBR322. Trc-промотор может быть заменен на Trc-промотор,
как в pTrpAmpCFT152. Могут быть использованы также и другие индуцируемые промоторы.
Для субклонирования SP-С-фрагмента комплементарные олигонуклеотиды ДНК сначала гибридизируют
друг с другом. Получающаяся в результате двойная нить ДНК имеет выступающие однонитевые концы
(EcoRI/PstI).
Встраивание в векторную ДНК осуществляется обычным путем после расщепления векторной ДНК с
помощью EcoRI/PstI, очистки требуемых фрагментов векторной ДНК посредством электрофореза в агарозном геле и гибридизации SP-С-ДНК и векторных фрагментов по сцепленным концам. Затем оба фрагмента
по известным методам связывают друг с другом путем лигирования.
Для амплификации ДНК и выделения плазмид производят трансформацию по обычным протоколам, например, в кальций-хлорид-компетентные клетки ММ294 E.coli и для селекции несущих плазмиду клеток покрывают на LB-агаровых пластинках ампициллином. Из полученных устойчивых к ампициллину (Ampрезистентных) колоний выделяют плазмидную ДНК и анализируют ее с помощью соответствующих комбинаций рестрикционного фермента. Выбирают клоны с ожидаемой рестрикционной картой ДНК. Путем полного секвенирования плазмидной последовательности подтверждается правильно осуществленная инсерция
последовательности SPC34(FF/I).
Полученные таким образом плазмидные векторы позволяют осуществлять экспрессию слитого протеина
CAT::SPC под контролем Trp-промотора (или других промоторов). Рекомбинантный слитой протеин выпадает в клетках-хозяевах после индукции в форме телец включения.
Слитой протеин CAT152::SPC34(FF/I) имеет следующую представленную обычным однобуквенным кодом аминокислотную последовательность:
34 аминокислоты SP-C(FF/I) в положениях 153-186 слитого протеина выделены подчеркиванием и указанием положений 1-34.
Последующее расщепление гидроксиламином для разделения CAT и SP-C происходит между Asn-152 и
Gly-153 (соответствует 1-й аминокислоте в SP-С-пептиде). Выделение и очистка SP-С-пептида осуществляется по обычным в химии белка методам.
Полипептиды по изобретению можно применять отдельно или в комбинации в фармацевтических композициях, которые удовлетворяют требованиям лечения дыхательных путей. Эти композиции пригодны не
только для лечения синдрома удушья у недоношенных новорожденных и у взрослых, но также и для лечения
пневмонии и бронхита. Кроме того, полипептиды по изобретению пригодны в качестве "буксира" для лекарственных веществ, вводимых путем ингаляции.
Наряду с полипептидами композиции содержат фосфолипиды, предпочтительно такие фосфолипиды, которые содержатся в природных составах, обладающих легочной поверхностной активностью, как, например,
предпочтительно дипальмитоилфосфатидилхолин (ДПФХ), пальмитоилолеилфосфатидилглицерин (ФОФГ)
и/или фосфатидилглицерин (ФГ). Для достижения оптимальной вязкости композиции содержат ионы кальция или магния, а также хлорид натрия. Для определения вида и количества отдельных компонентов композиций специалист может ориентироваться, во-первых, на известный состав природного легочного поверхно-
4
BY 4124 C1
стно-активного вещества, а во-вторых, на многочисленные предложения, известные из уровня техники, например из европейских патентных заявок ЕР-А 0119056 и ЕР-А 0406732.
Предпочтительные композиции по изобретению содержат 80-95 мас. % фосфолипидов, 0,5-3,0 мас. % полипептидов, 4-7 мас. % жирной кислоты, предпочтительно пальмитиновой кислоты, и 1-3 мас. % хлорида
кальция.
Пример получения.
1. Штамм-продуцент.
Применяемый штамм-продуцент E.coli 199 имеет происхождение из штамма ММ294 E.coli К12, который
депонирован под N 5208 в "Германской коллекции микроорганизмов и клеточных культур ГмбХ" (DSM,
Брауншвейг).
Вектор экспрессии pTrpAmpCAT152::SPC34(FF/I), содержащий ген слитого протеина
CAT152::SPC34(FF/I), был получен из ДНК-последовательности pBR322, т.е. ColEI-производного [E.Weber
(ред.), (1988), Biologische Sicherheit, Bundesministerium für Forschung und Technologie, Bonn]. В плазмиде
pKK233-2, поставляемой фирмой Pharmacia, с помощью EcoRI/HindIII был вырезан Trc-промотор и заменен
синтетическим Trp-промотором (рTrp233). Последний состоит из промоторной области (участок связывания
РНК-полимеразы), операторной области (участок связывания Trp-репрессора), последовательности ШайнаДальгарно (S/D-последовательности), а также сайтов рестрикции для клонирования. За Trp-промотором был
вставлен ген (CAT152), кодирующий 152 аминокислоты 5'-части бактериальной хлорамфеникол-ацетилтрансферазы. С частью CAT152 ДНК-последовательности был слит синтетический фрагмент гена, кодирующий 34 аминокислоты подобного человеческому протеина SP-C(FF/I). Функциональный транскриптон
CAT::SPC(FF/I) заканчивается бактериальной rrnB-последовательностью Т1Т2, терминирующей транскрипцию. Полученная конструкция обозначается как pTrpAmpCAT152::SPC34(FF/I).
Вектор pTrpAmpCAT::SPC(FF/I) имеет следующие функциональные элементы:
ген CAT152::SPC34(FF/I), управляемый Trp-промотором и Т1Т2- терминатором транскрипции;
ori-область и соседние области, которые управляют чистом копий плазмиды;
ген Amp®.
После помещения плазмиды в клетку-хозяина последняя имеет высокое число копий гена
CAT::SPC(FF/I), контролируемого Trp-промотором. Trp-репрессор вырабатывает сама клетка-хозяин.
Ферментативное получение rCAT::SPC регулируется концентрацией триптофана в среде, соответственно
добавлением β-IАА(β-индолилакриловой кислоты).
2. Периодическая ферментация.
С помощью пробирки Working Cell Bank (культура глицерина) культуральную среду (состав см. ниже)
высевают в шейкер (предварительная или начальная культура 1 л) и при 37 °С инкубируют при встряхивании
и при сильной ампициллинзависимой селекции. За ростом следят по оптической плотности при 578 нм. По
достижении начальной культурой E.coli 199 оптической плотности более 3 культуру высевают в 10литровый ферментер и продолжают выращивание бактерий при уменьшенной ампициллинзависимой селекции. После достижения значения оптической плотности между 5 и 6 10-литровую культуру переносят в 100литровый ферментер и продолжают инкубировать в тех же условиях. После достаточного роста путем добавления, например, 40 мг/л β-IАА индуцируют управляемый Trp-промотором транскриптон
CAT::SPC(FF/I). После индукции для сбора клеток ферментацию продолжают дополнительно в течение 4-5
ч.
Во время ферментации напрямую контролируют и регулируют парциальное давление кислорода (рО2),
значение рН и температуру бульона в ферментере. Значение рН поддерживают постоянным с помощью раствора едкого натра, парциальное давление кислорода (рО2) регулируют путем введения кислорода и с помощью числа оборотов мешалки. Оптическую плотность при 578 нм и концентрацию источника С в среде определяют через определенные интервалы. Пенообразование контролируют с помощью пенного датчика, с
помощью которого при необходимости определенными дозами добавляют антивспениватель для подавления
пенообразования.
В различные моменты времени отбирают аликвоты культурального бульона. После лизиса бактерий протеины E.coli для контроля экспрессии разделяют на полиакриламидном геле и подкрашивают. Процентную
долю (доминантных) протеинов во всем протеине E.coli определяют с помощью денситометра. Вскоре после
индукции рекомбинантного гена появляется новая доминантная протеиновая полоса (rCAT::SPC).
Культуральная среда имеет следующий состав.
Соевый пептон 27,0 г/л, дрожжевой аутолизат KAV 14 г/л, NaCl 5,0 г/л, К2НРО4•3Н2О 6,0 г/л, КН2РО4 3,0 г/л,
MgSO4•7H2О 0,5 г/л, глицерин (99,5 %-ный) 30,0 г/л, антивспениватель J673 (фирма Structol Comp.) 0,2 мл/л,
L-триптофан 80,0 мг/л и ампициллин 20 мг/л для 1-й предварительной культуры и 5 мг/л для 2-й предварительной культуры и 100-литрового ферментера.
Перед нагреванием в автоклаве и стерилизацией комплексной питательной среды рН с помощью 2Н
NaOH устанавливают на 6,8. Для предварительной культуры в 10-литровом ферментере скорость мешалки
5
BY 4124 C1
составляет 750 об/мин, а расход кислорода составляет 10 л/мин при 37 °С, для главной культуры в 100литровом ферментере скорость мешалки составляет 400 об/мин, а расход кислорода составляет 70 л/мин при
37 °С. Антивспениватель при необходимости добавляют одноразовым шприцем через перегородку.
Приблизительно через 4 ч после индукции клетки отделяют от культурального бульона фильтрацией
и/или центрифугированием. Влажную клеточную массу собирают в емкости из нержавеющей стали и в течение ночи перемешивают с 10 л переваривающего буфера (рН 8,0) в холодильнике (16 часов, 4 °С). Перемешанную клеточную суспензию обрабатывают (при комнатной температуре) в гомогенизаторе высокого давления (≥700 бар) и снова собирают в стерильную емкость из нержавеющей стали. Затем сразу же путем
фильтрации и/или центрифугирования (центрифуга Sorvall RC2-B, 27000g) при 4 °С собирают тельца включения, ресуспендируют в буфере (около 1 л) и порциями, например приблизительно по 350 мл, переносят в
1-литровую круглодонную колбу и лиофилизуют в течение ≈ 96 ч. Из 100-литровой ферментационной загрузки получают приблизительно 200 г сухих телец включения с содержанием слитых протеинов более 20
мас. %. Лиофилизованные тельца включения могут храниться при -20 °С месяцами.
3. Расщепление слитого протеина и очистка липофильного пептида SP-C(FF/I).
100 г Сухих телец включения растворяют при легком нагревании в 1,6 л 8-молярного раствора гидрохлорида гуанидина (917,1 г). Нерастворившийся остаток отфильтровывают через складчатый фильтр. Для расщепления слитого протеина по месту связывания Asn-Gly к раствору добавляют 167 г гидроксиаммонийхлорида и рН раствора доводят 2Н NaOH до 9,6. Расщепляющий раствор затем оставляют стоять на 3-4 дня при
комнатной температуре при перемешивании. По завершении реакции добавлением 6,4 л трис-буфера (рН
8,0) осаждают SP-C(FF/I) и его отделяют с помощью центрифугирования (центрифуга Sorvall RC2-В,
20000g). Надосадочную жидкость декантируют, осажденные центрифугированием SP-C повторно суспендируют в 400-500 мл трис-буфера и снова центрифугируют при тех же условиях в течение 30 мин.
Осажденный центрифугированием SP-C растворяют в 3,5 л смеси хлороформа, метанола и соляной кислоты (1,75 л СНСl3 + 1,75 л СН3ОН + приблизительно 30 мл 2Н НСl). Этот сырой раствор SP-C далее очищают с помощью препаративной жидкостной хроматографии высокого давления (ЖХВД) на С8 в качестве
материала обращенной фазы. Хлороформ/метанольный экстракт перед загрузкой на колонку для препаративной ЖХВД разбавляют 90 %-ным метанолом в соотношении приблизительно 1:2. Из этого раствора в колонку (диаметр 5 см) можно загружать, например, приблизительно 400 мг SP-C(FF/I) (например, разбавленного ≈ 2 л сырого экстракта). SP-C(FF/I) элюируют в кислых условиях (рН 2-3) с использованием градиента
вода/изопропанол (см. таблицу). Приблизительно через 30 мин хроматографирования в той области, в которой элюирован SP-C (УФ-обнаружение при 220 нм), собирают 4-6 фракций по 200 мл. Фракции проверяют с
помощью аналитической ЖХВД и соответственно направляют в банк данных. Если пробы необходимо хранить, то их замораживают в жидком азоте и хранят в морозильной камере при -80 °С. Чистота получаемого
SP-C(FF/F) составляет 98,5-99,5 %.
Условия разделения представлены в таблице.
4. Встраивание SP-C(FF/I) в фосфолипидную матрицу.
Липофильный пептид SP-C(FF/I) смешивают в изопропанольном растворе с компонентами фосфолипидной матрицы и осаждают путем впрыскивания в разбавленный раствор поваренной соли (0,065 % вес/вес
NaCl) при комнатной температуре в гомогенной смеси с компонентами фосфолипидной матрицы. Из суспензии легочного поверхностно-активного вещества на стаканчиковой центрифуге отделяют легочное поверхностно-активное вещество (ЛПАВ), ресуспендируют в растворе электролита (NaCl, CaCl2) и с помощью 0,1Н
NaOH рН доводят до 6,5. Эту водную суспензию разливают по 20-миллилитровым ампулам и лиофилизуют.
Приведенные в нижеследующем примере получения весовые и объемные данные относятся к получению 10граммового препарата легочного поверхностно-активного вещества.
7,00 г Дипальмитоилфосфатидилхолина (ДРФХ), 3,08 г аммониевой соли пальмитоилолеилфосфатидилглицерина (ПОФГ х NH4) и 0,25 г пальмитиновой кислоты растворяют при 40 °С в 200 мл 90 %ного изопропанола и затем охлаждают до комнатной температуры. Полученный раствор фосфолипида объединяют с 1 л раствора, полученного после ЖХВД-очистки и содержащего 200 мг очищенного SP-C(FF/I).
Значение рН полученного "распыляемого раствора" доводят при перемешивании раствором бикарбоната
(приблизительно 5 мл 5 %-ного раствора NaHCO3) до 4,5.
"Распыляемый раствор" при интенсивном перемешивании вводят при комнатной температуре со скоростью впрыскивания 25 мл/мин через однокомпонентное сопло в 9,6 л разбавленного раствора NaCl (0,065 %
вес/вес). Образуется опалесцирующий раствор, из которого после двухчасовой выдержки при 4-8 °С при
впрыскивании раствора электролита (3,0 г CaCl2•2H2O и 61,3 г NaCl в 300 мл H2O) в осадок выпадает препарат легочного поверхностно-активного вещества. Суспензию легочного поверхностно-активного вещества
(общий объем 10,8-11,0 л) выдерживают в течение ночи при 4 °С, а затем в течение 30 мин центрифугируют
на стаканчиковой центрифуге Sorvall (RC2-B) при 16000g. Для удаления остатков изопропанола образовавшуюся при центрифугировании лепешку ресуспендируют в половинном объеме 0,65 %-ного раствора поваренной соли и повторно центрифугируют. Эту стадию повторяют 3-4 раза. Лепешку, полученную на заклю6
BY 4124 C1
чительной стадии центрифугирования, растворяют в 400 мл 0,65 %-ного раствора NaCl, значение рН с помощью 0,1Н NaOH доводят до 6,5 и распределяют порциями по 6,2 г в 20-миллилитровые ампулы. Содержимое ампул лиофилизуют следующим образом: замораживают на 6 ч при -45 °С и нормальном давлении,
сушат вымораживанием в течение 54 ч при 0,16 мбар и -20 °С, а затем для дальнейшей интенсивной сушки
еще в течение 5 ч при -20 °С и 0,02 мбар.
Таким путем получают 65-66 ампул, содержащих по 0,150 г легочного поверхностно-активного вещества
(рассчитано без NaCl).
Сухие пробы легочного поверхностно-активного вещества хранят в холодильной камере при 4 °С, а перед
применением их необходимо ресуспендировать водой или физиологическим раствором NaCl (суспензионная
концентрация 25 мг/мл).
В каждой ампуле содержится: 95,6 мг дипальмитоилфосфатидилхолина, 42,1 мг пальмитоилолеилфосфатидилглицерина (аммониевая соль), 2,7 мг SP-C(FF/I), 6,8 мг пальмитиновой кислоты, 2,9 мг
хлорида кальция (безводного).
Условия разделения:
Колонка Kromasil С8 100 А 16 мкм 300 мм, внутренний диаметр 50 мм
Элюент А: Вода для ЖХФД из установки Millipore
Б: изо-РrОН с линейным градиентом
В: 60 ммоль/л НСl (разбавление из дымящей соляной кислоты)
Градиент:
Время
0
10
55
65
75
85
90
%A
45
45
0
0
45
45
45
%Б
50
50
95
95
50
50
50
Государственный патентный комитет Республики Беларусь.
220072, г. Минск, проспект Ф. Скорины, 66.
7
%B
5
5
5
5
5
5
5
Поток (мл/мин)
100
100
100
100
100
100
0,2
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
0
Размер файла
212 Кб
Теги
патент, 04124
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа