close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Патент BY 07934

код для вставкиСкачать
ОПИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ПАТЕНТУ
РЕСПУБЛИКА БЕЛАРУСЬ
BY (11) 7934
(13) C1
(19)
(46) 2006.04.30
(12)
7
(51) C 07K 7/23,
НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР
ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ
СОБСТВЕННОСТИ
(54)
A 61K 38/09,
A 61P 35/00
АНТАГОНИСТЫ LHRH С УЛУЧШЕННОЙ РАСТВОРИМОСТЬЮ
(21) Номер заявки: a 20010866
(22) 2000.03.11
(31) 199 11 771.3 (32) 1999.03.17 (33) DE
(85) 2001.10.17
(86) PCT/ЕР00/02165, 2000.03.11
(87) WO 00/55190, 2000.09.21
(43) 2002.06.30
(71) Заявитель: ЗЕНТАРИС ГМБХ (DE)
(72) Авторы: БЕРНД, Майкл; КУТШЕР,
Бернхард; ГЮНТЕР, Экхард; РОМАЙС, Петер; РАЙССМАНН, Томас; БЕКЕРС, Томас (DE)
(73) Патентообладатель: ЗЕНТАРИС ГМБХ
(DE)
(56) RU 2123499 C1, 1998.
RU 2074191 C1, 1997.
RU 2130464 C1, 1999.
EP 0876337 A2, 1998.
EP 0328090 A3, 1990.
(57)
1. Соединения общей формулы I:
А-Ххх1-Ххх2-Ххх3-Ххх4-Ххх5-Ххх6-Ххх7-Ххх8-Ххх9-Ххх10-NH2,
в которой
А означает ацетил или 3-(4-фторфенил)пропионил;
Ххх1 означает D-Nal(1) или D-Nal(2);
Ххх2-Ххх3 означает D-Cpa-D-Pal(3) или простую связь;
Ххх4 означает Ser;
Ххх5 означает N-Me-Tyr;
Xxx6 означает D-Hci или остаток D-аминокислоты общей формулы II:
BY 7934 C1 2006.04.30
O
NH
(CH2)n
(II)
,
NH
O
R1
где n означает число 3 или 4,
R1 означает группу общей формулы III:
-(СН2)р-СО-NR2R3,
(III)
где р означает целое число от 1 до 4,
R2 означает водород или С1-С4-алкил,
R3 означает фенил, возможно замещенный амидином,
(I)
BY 7934 C1 2006.04.30
или R1 означает 3-амино-1,2,4-триазол-5-карбонильную группу;
Ххх7 означает Leu или Nle;
Ххх8 означает Arg или Lys(iPr);
Ххх9 означает Pro;
Ххх10 означает А1а или Sar,
или их соли с фармацевтически приемлемыми кислотами.
2. Соединения по п. 1, отличающиеся тем, что соль представляет собой ацетат, трифторацетат или эмбонат.
3. Соединения по п. 1 или 2, отличающиеся тем, что Ххх6 означает D-(3-амино-1,2,4триазол-5-карбонил)-Lys, сокращенно D-Lys(Atz), или D-[ε-N′-4-(4-амидинофенил)амино1,4-диоксобутил]-Lys, сокращенно D-Lys(B).
4. Соединение по п. 1, отличающееся тем, что представлено формулой Ac-D-Nal(2)1D-Cpa2-D-Pal(3)3-Ser4-N-Me-Tyr5-D-Hci6-Nle7-Arg8-Pro9-D-Ala10-NH2.
5. Соединение по п. 1, отличающееся тем, что представлено формулой Ac-D-Nal(2)1D-Cpa2-D-Pal(3)3-Ser4-N-Me-Tyr5-D-Lys(Atz)6-Leu7-Arg8-Pro9-D-Ala10-NH2.
6. Соединение по п. 1, отличающееся тем, что представлено формулой Ac-D-Nal(2)1D-Cpa2-D-Pal(3)3-Ser4-N-Me-Tyr5-D-Lys(В)6-Leu7-Lys(iPr)8-Pro9-D-Ala10-NH2.
7. Соединение по п. 1, отличающееся тем, что представлено формулой Ac-D-Nal(2)1D-Cpa2-D-Pal(3)3-Ser4-N-Me-Tyr5-D-Lys(B)6-Leu7-Arg8-Pro9-D-Ala10-NH2.
8. Соединение по п. 1, отличающееся тем, что представлено формулой Ac-D-Nal(2)1D-Cpa2-D-Pal(3)3-Ser4-N-Me-Tyr5-D-Hci6-Nle7-Lys(iPr)8-Pro9-D-Ala10-NH2.
9. Соединение по п. 1, отличающееся тем, что представлено формулой Ac-D-Nal(2)1D-Cpa2-D-Pal(3)3-Ser4-N-Me-Tyr5-D-Hci6-Nle7-Lys(iPr)8-Pro9-Sar10-NH2.
10. Соединение по п. 1, отличающееся тем, что представлено формулой Ac-D-Nal(2)1D-Cpa2-D-Pal(3)3-Ser4-N-Me-Tyr5-D-Hci6-Nle7-Arg8-Pro9-Sar10-NH2.
11. Соединение по п. 1, отличающееся тем, что представлено формулой 3-(4фторфенил)пропионил-D-Nal(1)1-Ser4-N-Me-Tyr5-D-Lys(Atz)6-Leu7-Arg8-Pro9-D-Ala10-NH2.
12. Фармацевтическая композиция, обладающая активностью против гормонзависимых опухолей, а также незлокачественных образований, для лечения которых требуется
подавление гормона LHRH, включающая соединение по любому из пп. 1-11 в эффективном количестве и фармацевтически приемлемый носитель.
13. Способ получения соединений общей формулы I по п. 1, в котором фрагменты, состоящие из остатков Xxxm с подходящими защитными группами, где m означает целое
число от 1 до 10, а Ххх1 ацетилирован, наращивают на твердой фазе или в растворе в общепринятых условиях, затем фрагменты на твердой фазе соединяют путем конденсации
фрагментов и после конденсации соединения общей формулы I отщепляют от твердой фазы посредством амидирования по остатку Ххх10.
14. Применение соединений по пп. 1-11 для получения фармакологического средства
для лечения гормонзависимых опухолей, прежде всего карциномы предстательной железы
или рака молочной железы, а также для лечения незлокачественных образований, для лечения которых требуется подавление гормона LHRH.
15. Способ получения фармакологического средства, в котором соединения по пп. 111 смешивают с общепринятыми носителями или вспомогательными материалами и изготавливают в виде фармакологического средства.
Изобретение относится к антагонистам LH-RH с улучшенной растворимостью, способам получения этих соединений, лекарственным средствам, в которых содержатся указанные
соединения, а также к применению лекарственного средства при лечении гормонзависимых опухолей и незлокачественных гормонзависимых заболеваний, таких как доброкачественная гиперплазия простаты (ВРН) и эндометриоз. Номенклатура, используемая при
2
BY 7934 C1 2006.04.30
описании пептидов, совпадает с номенклатурой, которая вошла в состав Биохимической
Номенклатуры, утвержденной комиссией ИЮПАК-ИЮБ (European J.Biochem. (1984), т.
138, стр. 8-37), где в соответствии с общепринятым написанием N-концевая аминогруппа
располагается слева, а С-концевая карбоксильная группа располагается справа. Антагонисты LH-RH, так же как и пептиды по настоящему изобретению, включают как природные,
так и синтетические аминокислоты, причем первые включают Ala, Val, Leu, IIe, Ser, Thr,
Lys, Arg, Asp, Asn, Glu, Gln, Cys, Met, Phe, Tyr, Pro, Trp и His. Сокращенные названия отдельных аминокислотных остатков основаны на тривиальных названиях аминокислот, например, Ala = аланин, Arg = аргинин, Gly = глицин, Leu = лейцин, Lys = лизин, Pal(3) = 3(3-пиридил)аланин, Nal(2) = 3-(2-нафтил)аланин), Phe = фенилаланин, Сра = 4-хлорфенилаланин, Pro = пролин, Ser = серин, Thr = треонин, Тгр = триптофан, Туr = тирозин и
Sar = саркозин. Если не указано иное, все описанные в заявке аминокислоты относятся к
L-ряду. Например, сокращенное название D-Nal(2) означает 3-(2-нафтил)-D-аланин, а сокращенное название Ser означает L-серин.
Заместители по є-аминогруппе боковой цепи лизина приведены после термина "Lys" в
скобках, по выбору в сокращенной форме.
Прочие сокращения, использованные в тексте заявки:
Ас - ацетил
Atz - 3-амино-1,2,4-триазол-5-карбонил
В - 4-(4-амидинофенил)амино-1,4-диоксобутил
Вос - трет-бутилоксикарбонил
Вор - гексафторфосфат бензотриазол-1-окситрис(диметил-амино)фосфония
DCC - дициклогексилкарбодиимид
ДХМ - дихлорметан
Ddz - диметоксифенилдиметилметиленоксикарбонил (диметиоксидиметил-Z)
DIC - диизопропилкарбодиимид
DIPEA- N,N-диизопропилэтиламин
ДМФ - диметилформамид
Fmoc - флуоренилметилоксикарбонил
HF - фтористоводородная кислота
HOBt- 1-гидроксибензотриазол
ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография
Me - метил
ТФУ - трифторуксусная кислота
Z - бензилоксикарбонил
Hci - гомоцитруллин
Сра - 4-хлорфенилаланин.
Пептиды по настоящему изобретению представляют собой аналоги релизинг-фактора
лютеинизирующего гормона (LH-RH), как показано на следующей структуре:
p-Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2, (LH-RH, гонадорелин).
В течение более, чем 20 лет исследованы селективные потенциальные антагонисты
декапептида LH-RH (статья Karten M., Rivier J.E. Endocrine Reviews, 1986. - Т. 7. - С. 44-66).
Большой интерес к таким антагонистам обусловлен необходимостью их использования в
области эндокринологии, гинекологии, предупреждения беременности и терапии онкологических заболеваний. В качестве потенциальных антагонистов LH-RH получено множество соединений. Наиболее интересными соединениями, которые найдены к настоящему
времени, являются такие соединения, структура которых является модификацией структуры LH-RH.
Первую серию потенциальных антагонистов получали введением ароматических аминокислот в положения 1, 2, 3, и 6 или 2, 3 и 6 (полипептидной цепи). Принятый способ
описания таких соединений заключается в следующем: прежде всего указывают амино3
BY 7934 C1 2006.04.30
кислоты, на которые заменены первоначальные аминокислоты в пептидной цепи LH-RH,
причем положения, в которых произошли замены, обозначают цифрами, расположенными
в верхнем индексе. Затем указывают термин "LH-RH", обозначающий тот факт, что речь
идет об аналоге LH-RH, содержащем указанные замены.
Известными антагонистами являются следующие соединения:
[Ac-D-Cpa1,2, D-Trp3,6] LH-RH (статья D.H. Coy et al., "Peptides; Proceedings of the 6th
American Peptid Symposium" (Пептиды, Материалы 6-го американского симпозиума по
пептидам), стр. 775-779, ред. Gross E., Meienhofer J., Pierce Chem.Co., Rocckville III (1979);
[Ac-Pro1, D-Cpa2, D-Nal(2)3|6]LH-RH (патент США № 4419347) и
[Ac-Pro1, D-Cpa2, D-Trp3i6]LH-RH (статья J.L. Pineda et al., J.Clin.Endocrinol.Metab.
(1983), т. 56, стр. 420).
Для усиления действия антагонистов позднее в положение 6 стали вводить основные
аминокислоты, например, D-Arg. Например, получены: [Ac-D-Cpa1,2, D-Trp3, D-Arg6, DAla10]LH-RH (ORG-30276) (статья D.H. Coy et al., Endocrinology (1982), т. 100, стр. 1445), и
[Ac-D-Nal(2)1, D-Phe(4-F)2, D-Trp3, D-Arg6]LH-RH (ORF 18260) (статья J.E. Rivier et al.,
в книге: "LHRH and its Analogs" (LHRH и его аналоги), стр.11-12, ред. Vickery B.H., Nestor
Jr. J.J., Hafez E.S.E., MTS Press, Lancaster, UK, (1984)).
Прочие потенциальные антагонисты LH-RH описаны в заявках WO 92/19651, WO
94/19370, WO 92/17025, WO 94/14841, WO 94/13313, US-A 5300492, US-A 5140009, EP
0413209 A1 и DE 19544212 A1.
Позднее описаны соединения с модифицированными остатками орнитина и лизина в
положении 6, представленные следующей формулой: Ac-D-Nal(2)1-D-Cpa2-D-Pal(3)3-Ser4Tyr5-D-Xxx6-Leu7-Arg8-Pro9-D-Ala10-NH2, где D-Xxx является аминокислотным остатком
общей формулы IV:
-HN-CH-CO(CH2)n
.
(IV)
NH
CO-R
Кроме того, антогонисты LH-RH описаны в заявках WO 97/19953 ЕР-А20328090.
Другими известными антагонистами LH-RH являются антареликс, ганиреликс и цетрореликс.
Антареликс:
Ac-D-Nal(2)1-D-Cpa2-D-Pal(3)3-Ser4-Tyr5-D-Hci6-Leu7-Lys(iPr)8-Pro9-D-Ala10-NH2,
Ганиреликс:
Ac-D-Nal(2)1-D-Cpa2-D-Pal(3)3-Ser4-Tyr5-D-hArg(Et)26-Leu7-hArg(Et)28-Pro9-D-Ala10NH2,
Цетрореликс:
Ac-D-Nal(2)1-D-Cpa2-D-Pal(3)3-Ser4-Tyr5-D-Cit6-Leu7-Arg8-Pro9-D-Ala10-NH2.
Задачей изобретения является разработка новых антагонистов LH-RH, обладающих
повышенной устойчивостью к действию ферментов и значительно более высокой растворимостью в воде.
Объектом изобретения являются соединения общей формулы I:
А-Ххх1-Ххх2-Ххх3-Ххх4- Ххх5-Ххх6-Ххх7- Ххх8-Ххх9-Ххх10- NН2,
(I)
где
А означает ацетил- или 3-(4-фторфенил)пропионилгруппу,
Ххх1 означает D-Nal(1) или D-Nal(2),
Ххх2-Ххх3 означает D-Cpa-D-Pal(3) или простую связь,
Ххх4 означает Ser,
4
BY 7934 C1 2006.04.30
Ххх5 означает N-Me-Tyr,
Ххх6 означает D-Hci или остаток D-аминокислоты общей формулы II:
O
NH
(CH2)n ,
(II)
NH
O
R1
где n означает число 3 или 4, причем R1 означает группу общей формулы III:
-(CH2)p-CO-NR2R3,
(III)
где р означает целое число от 1 до 4, R2 означает водород или С1-С4-алкил, a R3 означает
фенил, возможно замещенный амидином, или R1 означает 3-амино-1,2,4-триазол-5карбонильную группу;
Ххх7 означает Leu или Nle,
Ххх8 означает Arg или Lys(iPr),
Ххх9 означает Pro, и
Ххх10 означает Ala или Sar,
или их соли с фармацевтически приемлемыми кислотами, прежде всего ацетата, эмбоната и трифторацета.
Среди соединений по изобретению более предпочтительными являются соединения, в
которых Ххх6 означает D-(3-амино-1,2,4-триазол-5-карбонил)-Lys, сокращенное название
D-Lys(B).
Другими более предпочтительными соединениями по изобретению являются:
3-(4-фторфенил)пропионил-О-Nаl(1)1-Ser4-N-Ме-Tyr5-D-Lys(Atz)6-Leu7-Аrg8-Pro9-DAla -NH2,
а также их соли с вышеупомянутыми фармацевтически приемлемыми кислотами.
Другим объектом изобретения является фармацевтическая композиция, обладающая
активностью против гормонзависимых опухолей, а также незлокачественных образований,
для лечения которых требуется подавление гормона LH-RH, включающая соединение по
изобретению в эффективном количестве и фармацевтически приемлимый носитель.
Еще одним объектом изобретения является способ получения соединений общей формулы I, в котором фрагменты, состоящие из остатков Хххm с подходящими защитными
группами, где m означает целое число от 1 до 10, а Ххх1 ацетилирован, наращивают на
10
5
BY 7934 C1 2006.04.30
твердой фазе или в растворе в общепринятых условиях, затем фрагменты на твердой фазе
соединяют путем конденсации фрагментов и после конденсации соединения общей формулы I отщепляют от твердой фазы посредством амидирования по остатку Ххх10.
Объектом изобретения является также применение соединений по изобретению для
получения фармакологического средства для лечения гормонзависимых опухолей, прежде
всего карциномы предстательной железы или рака молочной железы, а также при незлокачественных показаниях, при терапии которых требуется подавление LH-RH. С этой целью их смешивают с общепринятыми носителями и вспомогательными веществами и
изготавливают в виде лекарственных препаратов.
Синтез соединений формулы (I) можно осуществлять как с помощью классической
конденсации фрагментов, так и твердофазным синтезом по Мерифильду с последовательным наращиванием цепи с использованием D-лизина, ацилированного в боковой цепи
карбоновой кислотой общей формулы R1-COOH, а также посредством модификации декапептидного фрагмента соответствующими карбоновыми кислотами за счет образования
амидной связи с боковой цепью D-лизина6. Благодаря этому введение R1-СО-группы
можно осуществлять на трех различных стадиях синтеза: перед конденсацией отдельных
фрагментов с образованием пептида, после введения в цепь лизина или орнитина, но перед конденсацией последующих фрагментов, или после конденсации всех фрагментов.
Соединения формулы (I) синтезируют известными методами, например, с помощью
исключительно твердофазного метода, с частичным использованием твердофазного метода (так называемой конденсацией фрагментов) или с помощью классического синтеза в
растворе [см. в книге Bodanszky М. Principles of Peptide Synthesis (Принципы пептидного
синтеза), Springer Verlag, 1984].
Например, методы твердофазного синтеза описаны в руководстве Stewart J.M., Young J.D.
Solid Phase Peptide Synthesis (Твердофазный синтез пептидов), Pierce Chem.Company,
Rockford, III, 1984 и в книге Barany G., Merrifield R.B. The peptides (Пептиды). Гл.1; 1979. С. 1-285. Academic Press Inc. Классический синтез в растворе подробно описан в руководстве "Methoden der Organischen Chemie (Houben-Weyl), Synthese von Peptiden" ("Методы
органической химии (Губен-Вейль), синтез пептидов"), ред. Wunsch E., 1974, Georg
Thieme Verlag, Stuttgart, BRD.
Ступенчатый синтез проводят, например, следующим образом, прежде всего С-концевую
аминокислоту с защищенной α-аминогруппой ковалентно присоединяют к одному из обычных нерастворимых носителей, затем от этой аминокислоты отщепляют α-аминозащитную группу, и к образовавшейся свободной аминогруппе присоединяют по карбоксильной
группе следующую аминокислоту с защищенной аминогруппой, и таким образом к синтезируемому пептиду стадия за стадией присоединяют в правильной последовательности
остальные аминокислоты, а после присоединения всех аминокислот готовый пептид отщепляют от носителя и по выбору отщепляют остальные присутствующие защитные
группы боковых цепей аминокислот. Ступенчатую конденсацию проводят обычным способом из соответствующих, должным образом защищенных аминокислот.
Конденсацию отдельных аминокислот друг с другом проводят обычными методами,
которые прежде всего включают:
метод с использованием симметричного ангидрида в присутствии дициклогексилкарбодиимида или диизопропилкарбодиимида (DCC, DIC),
общий карбодиимидный метод,
карбодиимид-гидроксибензотризольный метод (см. в книге "The Peptides" (Пептиды).
Т. 2. / Под. ред. Е. Gross, J. Meienhofer).
При конденсации фрагментов предпочтительно используют не сопровождающийся
рацемизацией азидный метод или метод с использованием DCC-1-гидроксибензотриазола
или, соответственно, DCC-3-гидрокси-4-оксо-3,4-дигидро-1,2,3-бензотриазина. Кроме того, можно использовать активированный эфир фрагмента.
6
BY 7934 C1 2006.04.30
Для ступенчатой конденсации аминокислот наиболее всего подходят активированные
эфиры N-защищенных аминокислот, например, N-гидроксисукцинимидный эфир или
2,4,5-трихлорфенильный эфир. Для эффективного катализа аминолиза используют Nгидроксисоединения, обладающие кислотностью приблизительно равной кислотности уксусной кислоты, например 1-гидроксибензотриазол.
В качестве промежуточных аминозащитных групп предложены группы, удаляемые
гидрированием, например бензилоксикарбонильный остаток (= Z-остаток) или отщепляемые в слабой кислоте группы. В качестве защитных групп для α-аминогруппы используют,
например, следующие группы: трет-бутилоксикарбонил, флуоренилметилоксикарбонил,
карбобензокси, соответственно карбобензтио (по выбору с п-бром- или п-нитробензильным
остатком), трифторацетил, фталильный остаток, о-нитрофеноксиацетил, тритил, п-толуолсульфонил, бензил, бензил, имеющий заместители в бензольном кольце (п-бром- или пнитробензильный остаток) и а-фенилэтил. Кроме того, методы защиты аминогрупп описаны в следующих книгах: Jesse P. Greenstein, Milton Winitz. Chemistry of Amino Acids
(Химия аминокислот), New York, 1961, John Wiley and Sons, Inc. - Т.2, например, стр. 883
и др., Principles of Peptide Synthesis (Принципы пептидного синтеза), Springer Verlag, 1984.
Solid Phase Peptide Synthesis (Твердофазный синтез пептидов). Stewart J.M., Young J.D.
Pierce Chem.Company, Rockford, III, 1984. Barany G., Merrifield R.B. The Peptides (Пептиды). Гл.1. - С. 1-285, 1979. Academic Press Inc., а также The Peptides (Пептиды). - Т. 2. /
Под. ред. Е. Gross, J.M. Meienhofer, Academic Press, New York. В основном эти же защитные группы используют и для защиты других функциональных боковых групп (ОН-групп,
NH2-групп) соответствующих аминокислот.
Имеющиеся гидроксигруппы (серина и треонина) предпочтительно защищают с помощью бензильных групп и аналогичных групп. Прочие не α-аминогруппы (например,
аминогруппы в ω-положении, гуанидиногруппы аргинина) предпочтительно защищают
ортогонально.
Отдельные производные аминокислот, за исключением лизина и орнитина, модифицированных R1-CO-группами, имеются в продаже.
Возможная схема процесса получения последних соединений является следующей:
1. Амидируют α-карбоксильную группу.
2. Защищают є-аминогруппу Z-группой.
3. Защищают α-аминогруппу Вос-группой, таким образом обеспечивая селективность
последующего отщепления аминозащитных групп.
4. Отщепляют Z-группу с е-аминогруппы.
5. Присоединяют требуемую R1-CO-группу по є-аминогруппе.
6. Отщепляют Вос-группу от α-аминогруппы.
7. Защищают α-аминогруппу Z-группой.
Для введения R1-CO-группы с целью модификации аминогруппы лизина соответствующей карбоновой кислотой в основном используют способы, описанные для конденсации
аминокислот. Однако наиболее предпочтительна конденсация с использованием карбодиимида, например 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимида, и 1-гидроксибензотриазола.
Реакцию конденсации аминокислот проводят в обычных нейтральных растворителях
и суспендирующих средствах (например в дихлорметане), причем по выбору для повышения растворимости может быть добавлен диметилформамид.
В качестве синтетических материалов-носителей используют нерастворимые полимеры, например набухающую в органическом растворителе полистирольную смолу в форме
гранул (например сополимеризат полистирола и 1 % дивинилбензола). Синтез защищенного декапептидамида, имеющего после отщепления от носителя в присутствии HF требуемую С-концевую амидную группу, на метилбензгидриламидной смоле (МВНА-смола,
т.е. полистирольная смола, содержащая метилбензгидриламидные группы) может быть
осуществлен согласно по постадийной схеме (таблица 1).
7
BY 7934 C1 2006.04.30
Na-Boc-защищенные аминокислоты обычно конденсируют в присутствии трехкратного молярного избытка диизопропилкарбодиимида (DIC) и 1-гидроксибензотриазола
(HOBt) в СН2Сl2/ДМФ в течение 90 мин, а Вос-защитную группу отщепляют под действием 50 %-ной трифторуксусной кислоты (ТФУ) в CH2Cl2. Для контроля полноты прохождения реакции используют хлоранильный тест по Кристенсену и нингидриновый тест по
Кайзеру. Остаток свободной аминогруппы блокируют ацетилированием в присутствии
пятикратного избытка ацетилимидазола в СН2Сl2. Последовательность реакционных стадий наращивания пептидной цепи на смоле приведена на постадийной схеме. Для отщепления связанного со смолой пептида конечный продукт твердофазного синтеза сушат в
вакууме над Р2О5 и обрабатывают 500-кратным избытком смеси HF/анизол 10:1/об.:об. в
течение 60 мин при 0 °С.
После упаривания HF и анизола в вакууме пептидамид выпадает в осадок при перемешивании с безводным этиловым эфиром в виде твердого вещества белого цвета, отделение от осадка полимерного носителя осуществляют промыванием 50 %-ной водной
уксусной кислотой. После осторожного концентрирования раствора в уксусной кислоте в
вакууме пептид может быть получен в виде очень вязкого масла, которое при добавлении
абсолютного эфира на холоде превращается в твердое вещество белого цвета.
Дальнейшую очистку проводят известным методом высокоэффективной жидкостной
хроматографии (ВЭЖХ).
Перевод пептида в его кислотно-аддитивную соль может быть осуществлен взаимодействием с кислотами по известному способу. И наоборот, свободный пептид может
быть получен взаимодействием его кислотно-аддитивной соли с основанием. Эмбонат
пептида может быть получен взаимодействием соли пептида и трифторуксусной кислоты
(соль с ТФУ) с эмбоновой кислотой (памовой кислотой) или соответствующей динатриевой солью эмбоновой кислоты. Для этого соль пептида с ТФУ в водном растворе обрабатывают раствором динатриевой соли эмбоновой кислоты в полярном апротонном
растворителе, предпочтительно диметилацетамиде и выделяют образующийся осадок
светло-желтого цвета.
Следующие примеры приведены для пояснения изобретения без ограничения области
изобретения.
Пример 1.
Ac-D-Nal(2)1-D-Cpa2-D-Pal(3)3-Ser4-N-Me-Tyr5-D-Hci6-Nle7-Arg8-Pro9-D-Ala10-NH2
Синтез проводят согласно постадийной схеме твердофазного синтеза (см. протокол
пептидного синтеза, стр. 11) с использованием конденсации в присутствии DIC/HOBt) и
3,3 г смолы МВНА (плотность нагрузки 1,08 ммоль/г). После отщепления от полимерного
носителя в присутствии HF образуется неочищенный пептид (3,4 г), который затем очищают стандартным методом препаративной ВЭЖХ. После лиофильного высушивания получают 1,43 г чистого по данным ВЭЖХ продукта брутто-формулы С72, Н96, N17, O14,
Cl с соответствующими масс-спектром, МС-ББА: 1458,7 (М + Н+) (рассчитано: 1457,7) и
1
Н-ЯМР-спектром.
1
Н-ЯМР (500 МГц, D2O/AMCO-d6, δ часть/млн): 8,7-7,2 (несколько m, ароматический
Н и NH неполного обмена), 6,92 и 6,58 (2d, 2×2H, ароматический Н p-Cl-Phe), 5,2-3,5 (несколько m, Сα-Н и алифатический Н), 3,2-2,6 (несколько m, ароматический Сβ-Н), 2,1-0,7
(несколько m, остаточный алифатический Н), 1,70 (s, 3Н, ацетил), 1,20 (d, 3Н, Сβ-Н Ala),
0,8 (m, Cδ-H, Leu).
Ацетатную форму декапептида из примера 1 могут получать описанным выше способом или известными в литературе методами.
Результаты ЯМР:
1
Н-ЯМР (500 МГц, ДМСО-d6, δ часть/млн):
8
BY 7934 C1 2006.04.30
8,7-6,6, несколько m, ароматический Н и NH; 6,0-5,9 жесткая структура, 1Н, NH; 5,455,35 жесткая структура, 2Н, NH2; 5,15-3,4, несколько m, Сα-Н остаточный алифатический
Н; 3,2-2,6, несколько m, алифатический Сβ-Н, NCH3; 2,1-1,0, несколько m, остаточный
алифатический Н; 1,85, s, 6H, ацетат; 1,70, s, 3Н, ацетил; 1,25, d, 3Н, Сβ-Н Ala; 0,85-0,75,
m, Сδ-Н, Leu.
Пример 2.
Ac-D-Nal(2)1-D-Cpa2-D-Pal(3)3-Ser4-N-Me-Tyr5-D-Lys(B)6-Leu7-Lys(iPr)8-Pro9-D-Ala10NH2
Синтез проводят согласно постадийной схеме твердофазного синтеза (см. протокол
пептидного синтеза, стр. 11) с использованием конденсации в присутствии DIC/HOBt) и
4,0 г смолы МВНА (плотность нагрузки 1,11 ммоль/г). После отщепления от полимерного
носителя в присутствии HF образуется неочищенный пептид (4,87 г), который затем очищают стандартным методом препаративной ВЭЖХ. После лиофильного высушивания получают 0,93 г чистого по данным ВЭЖХ продукта, который превращают в требуемое
соединение в присутствии 4-амидинофениламино-4-оксомасляной кислоты и ВОР в качестве конденсирующего агента. После повторной очистки методом ВЭЖХ получают 148 мг
конечного соединения брутто-формулы С85, Н112, N17, O15, Cl с соответствующими
масс-спектром, MC-ESI: 1647,6 (М + Н+) (рассчитано: 1645,8) и 1Н-ЯМР-спектром.
1
Н-ЯМР (500 МГц, ДМСО-d6, δ часть/млн): 10,4 (s, 1H) и 9,13 (s, 2H) и 8,94 (s, 2H, NH
из 4-амидиноанилина), 8,6-7,35 (несколько m, ароматические Н и NH), 7,22 и 7,18 (2d, 4H,
ароматический Н (pCl)Phe), 6,95 и 6,58 (2d, 4H, ароматический Н Tyr), 5,2-3,5 (несколько
m, Сα-Н и алифатический Н), 3,3-2,4 (несколько m, Сβ-Н и N-CH3), 2,1-1,1 (несколько m,
остаточный алифатический Н), 1,68 (s, 3Н, ацетил), 1,20 (d, 3Н, Cβ-H Ala), 0,83 (dd, 6H,
Сδ-Н Leu).
Пример 3.
Ac-D-Nal(2)1-D-Cpa2-D-Pal(3)3-Ser4-N-Me-Tyr5-D-Lys(B)6-Leu7-Arg8-Pro9-D-Ala10-NH2
Синтез проводят согласно постадийной схеме твердофазного синтеза (см. протокол
пептидного синтеза, стр. 11) с использованием конденсации в присутствии DIC/HOBt) и
4,0 г смолы МВНА (плотность нагрузки 0,97 ммоль/г). После отщепления от полимерного
носителя в присутствии HF образуется неочищенный пептид (4,0 г), который затем очищают стандартным методом препаративной ВЭЖХ. После лиофильного высушивания получают 1,39 г чистого по данным ВЭЖХ продукта, который превращают в требуемое
соединение в присутствии 4-амидинофениламино-4-оксомасляной кислоты и ВОР в качестве конденсирующего агента. После повторной очистки методом ВЭЖХ получают 440 мг
конечного соединения брутто-формулы С82, Н106, N19, O15, Cl с соответствующими
масс-спектром, MC-ESI: 1632,7 (М + Н+) (рассчитано: 1631,7) и 1Н-ЯМР-спектром.
1
Н-ЯМР (500 МГц, ДМСО-d6, δ часть/млн): 10,4 (s, 1H) и 9,15 (s, 2H) и 9,0 (s, 2H, NH
из 4-амидиноанилина), 8,60 (m, 2H, ароматический Н), 8,3-7,2 (несколько m, ароматические Н и NH), 7,27 и 7,20 (2d, 4Н, ароматический Н (pCl)Phe), 6,96 и 6,60 (2d, 4Н, ароматический Н Tyr), 5,2-3,5 (несколько m, Сα-Н и алифатический Н), 3,2-2,4 (несколько m,
Cβ-H и N-СН3), 2,1-1,1 (несколько m, остаточный алифатический Н), 1,70 (s, 3Н, ацетил),
1,20 (d, 3Н, Сβ-Н Ala), 0,85 (dd, 6H, Сβ-Н Leu).
Пример 4.
Ac-D-Nal(2)1-D-Cpa2-D-Pal(3)3-Ser4-N-Me-Tyr5-D-Hci6-Nle7-Lys(iPr)8-Pro9-D-Ala10-NH2
Синтез проводят согласно постадийной схеме твердофазного синтеза (см. протокол
пептидного синтеза, стр. 11) с использованием конденсации в присутствии DIC/HOBt) и
2,5 г смолы МВНА (плотность нагрузки 1,08 ммоль/г). После отщепления от полимерного
9
BY 7934 C1 2006.04.30
носителя в присутствии HF образуется неочищенный пептид (2,78 г), который затем очищают стандартным методом препаративной ВЭЖХ. После лиофильного высушивания получают 400 мг чистого по данным ВЭЖХ продукта брутто-формулы С75, Н102, N15, O14,
Cl с соответствующими масс-спектром, МС-ESI: 1472,6 (M + H+) (рассчитано: 1471,7) и
1
Н-ЯМР-спектром.
1
Н-ЯМР (500 МГц, D2O/ДMCO-d6, δ часть/млн): 8,62 (m, 2H), 8,30 (m, 2Н), 7,80 (m,
4Н), 7,66 (s, 1Н), 7,47 (m, 2Н), 7,36 (d, 1H, ароматический Н), 7,25 и 7,20 (2d, 4H, ароматический Н (pCl)Phe), 6,96 и 6,63 (2d, 4H, ароматический Н Tyr), 5,10-4,0 (несколько m, СαН и алифатический Н), 3,75-2,65 (несколько m, Cβ-H и N-СН3), 2,1-1,05 (несколько m, остаточный алифатический Н), 1,74 (s, 3Н, ацетил), 1,23 (d, 3Н, Cβ-H Ala), 1,20 (m, CH3 изопропил), 0,8 (m, 3Н, Сδ-Н Nle).
Пример 5.
Ac-D-Nal(2)1-D-Cpa2-D-Pal(3)3-Ser4-N-Me-Tyr5-D-Hci6-Nle7-Lys(iPr)8-Pro9-Sar10-NH2
Синтез проводят согласно постадийной схеме твердофазного синтеза (см. протокол
пептидного синтеза, стр. 11) с использованием конденсации в присутствии DIC/HOBt) и
2,5 г смолы МВНА (плотность нагрузки 1,08 ммоль/г). После отщепления от полимерного
носителя в присутствии HF образуется неочищенный пептид (2,74 г), который затем очищают стандартным методом препаративной ВЭЖХ. После лиофильного высушивания получают 840 мг чистого по данным ВЭЖХ продукта брутто-формулы С75, Н102, N15, O14,
Cl с соответствующими масс-спектром, МС-ESI: 1472,6 (М + Н+) (рассчитано: 1471,7) и
1
Н-ЯМР-спектром.
1
Н-ЯМР (500 МГц, D2O/ДМСО-d6, δ часть/млн): 8,6 (m, 2Н), 8,3 (m, 2Н), 7,85 (m,
2Н),7,8 (m, 2Н), 7,65 (s, 1Н), 7,46 (m, 2Н), 7,35 (d, 1H, ароматический Н), 7,23 и 7,17 (2d,
4H, ароматический Н (pCl)Phe), 7,0 и 6,6 (2d, 4H, ароматический Н Tyr), 5,10-3,8 (несколько m, Сα-Н и алифатический Н), 3,75-2,6 (несколько m, Cβ-H и N-CH3), 2,1-1,05 (несколько m, остаточный алифатический Н), 1,70 (s, 3Н, ацетил), 1,23 (d, 3Н, Cβ-H Ala), 1,20 (m,
CH3 изопропил), 0,8 (m, 3Н, Сδ-Н Nle).
Пример 6.
3-(4-фторфенил)пропионил-D-Nаl(1)1-Ser4-N-Ме-Tyr5-D-Lys(Atz)6-Leu7-Arg8-Pro9-DAla10-NH2
Синтез проводят согласно постадийной схеме твердофазного синтеза (см. протокол
пептидного синтеза, стр. 11) с использованием конденсации в присутствии DIC/HOBt) и
9,2 г смолы МВНА (плотность нагрузки 1,08 ммоль/г). После отщепления от полимерного
носителя в присутствии HF образуется неочищенный пептид (5,8 г), который затем очищают стандартным методом препаративной ВЭЖХ. После лиофильного высушивания получают 2,0 г чистого по данным ВЭЖХ незамещенного октапептида, 0,4 ммоль которого
превращают в неочищенный требуемый продукт (790 мг) в присутствии 0,5 ммоль 3амино-1,2,4-триазол-5-карбоновой кислоты и РуВОР в качестве конденсирующего агента.
После повторной очистки методом ВЭЖХ получают 200 мг конечного продукта бруттоформулы С64, Н86, N17, O12, F c соответствующим масс-спектром, МС-ББА: 1304,6
(М + Н+) (рассчитано: 1303,6)
1
Н-ЯМР (500 МГц, D2O/ДМСО-d6, δ часть/млн): 8,14 (m, 1H), 7,90 (m, 1Н), 7,80 (m,
1Н), 7,50 (m, 2Н), 7,35 (m, 2Н), 7,0 (m, 6Н), 7,63 (m, 2Н, ароматический Н), 5,0 (m,1Н), 4,83
(m, 2Н), 4,41 (m, 1Н), 4,30-4,05 (несколько m, 4Н, Сα-Н), 3,66-2,25 (несколько m, алифатические и ароматические Н в боковой цепи), 2,95 (s) и 2,75 (s, N-Me), 2,05-1,1 (несколько m,
остаточный алифатический Н), 1,20 (d, Cβ-H Ala), 0,75 (m, 6H, Сδ-H Leu).
Соединения по настоящему изобретению формулы I исследуют по их связыванию с
рецептором. Использованные способы относятся к известным методам, описанным в ста10
BY 7934 C1 2006.04.30
тье Beckers et al., Eur.J.Biochem., (1995) т. 231, стр. 535-543. Цетрореликс, синтезированный, как описано выше, иодируют [125I] (производства фирмы Amersham, удельная активность 80,5 Бк/фмоль) с использованием реагента lodoGen (производства фирмы Pierce).
Реакционную смесь очищают методом обращеннофазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии, при этом получают моноиодированный цетрореликс без примеси немеченного пептида. При необходимости приблизительно 80 % [125I]-цетрореликса и
немеченного соединения по изобретению являются пригодными для специфического связывания с рецептором.
Соединения по настоящему изобретению могут быть исследованы по их действию in
vitro с использованием следующих методов 1 и 2, причем аффинность связывания определяют методом анализа связывания с [125I]-цетрореликсом (метод 1), а функциональную
активность определяют с использованием трипторелина в качестве агонистического стимулятора (метод 2).
Метод 1.
Анализ связывания с рецептором по статье Beckers Т., Marheineke К., Reilander H., Hilgard P. "Selection and characterization of mammalian cell lines with stable overexpression of
human pituitary receptors for gonadoliberin (GnRH)" (Отбор и характеристика линий клеток
млекопитающих, обладающих устойчивой суперэкспрессией рецепторов гонадолиберина
(GnRH) гипофиза человека) Eur.J.Biochem. (1995), т. 231, стр. 535-543.
Для исследования связывания с рецептором цетрореликс иодируют [125I] (производства
фирмы Amersham, удельная активность 80,5 Бк/фмоль) с использованием реагента lodoGen
(производства фирмы Pierce). Реакционную смесь очищают методом высокоэффективной
жидкостной хроматографии с замещенными фазами, причем получают моноиодированный
цетрореликс без примеси немеченного пептида. Приблизительно 80 % [125I]-цетрореликса
являются пригодными для специфического связывания с рецептором.
Анализ связывания с рецептором проводят с использованием интактных клеток в физиологических условиях по описанной методике (Beckers et al. 1995). Субконфлюентные
культуры стабильных трансфектных клеток LTK, которые экспрессируют на поверхности
рецептор LHRH человека, отделяют инкубированием в присутствии NaCI/Pj (137 мМ
NaCl, 2,7 мМ KCl, 8,1 мМ Na2HPO4, 11,47 мМ КН2РО4)/1 мМ ЭДТУ и собирают центрифугированием. Осадок клеток ресуспендируют в буфере для связывания (DMEM без
Н2СО3, содержащая 4,5 г/л глюкозы, 10 мМ Hepes рН 7,5, 0,5 мас./об. % БСА, 1 г/л бацитрацина, 0,1 г/л STBI, 0,1 мас./об. % NaN3. Для анализа по механизму замещения суспензию 0,25×106 клеток/100 мкл, содержащую приблизительно 225пМ [125I]-цетрореликс
(удельная активность 5-10×105 импульс/мин/пмоль), инкубируют в присутствии различных концентраций немеченного соединения по настоящему изобретению в качестве конкурирующего соединения. Суспензию клеток в 100 мкл среды для связывания наслаивают
в трубки для исследования объемом 400 мкл на 200 мкл смеси 84 об. % силиконового масла (Merck Тур 550)/16 об. % парафинового масла. После инкубирования в течение 1 ч при
37 °С при непрерывном медленном встряхивании клетки отделяют от инкубационной среды путем центрифугирования в течение 2 мин при 9000 об/мин (центрифуга Rototyp HTA
13,8, производства Heraeus Sepatec, Osterode, Германия). Верхние части трубок, содержащие осадок клеток, отрезают. Затем в осадке клеток и надосадочной жидкости определяют
число импульсов γ-излучения. Количество неспецифически связанных соединений, включая немеченный цетрореликс при конечной концентрации 1 мкМ, которое в типичном
случае составляет ≤ 10 % от общего количества связанных соединений. Для анализа данных по связыванию используют аналитическую программу EBDA/Ligand (Biosoft V3,0).
Метод 2.
Функциональный анализ для определения антагонистического действия.
Анализ проводят с некоторыми модификациями, как описано в статье Beckers Т.,
Reilander H., Hilgard P. Characterization of gonadotropin-releasing hormone analogs based on a
11
BY 7934 C1 2006.04.30
sensitive cellular luciferase reporter gene assay (Характеристика аналогов релизинг-гормона
гонадотропина, основанная на чувствительном анализе репортерного гена клеточной люциферазы) (1997), Analyt.Biochem., т. 251, стр. 17-23 (Beckers et al. 1997). 10000 клеток в
лунке, которые содержат на поверхности LHRH-рецептор человека и репортерный ген
люциферазы человека, культивируют в микропланшете в течение 24 ч с использованием
среды DMEM с добавками и 1 % сыворотки теленка (FCS). Затем клетки стимулируют в
течение 6 ч 1 нМ раствором [D-Trp6] LHRH. Перед стимулированием добавляют антагонистические соединения по настоящему изобретению и наконец для количественного определения активности клеточной люциферазы клетки лизируют. Рассчет величины IC50
проводят с использованием кривой дозо-зависимого действия и нелинейного регрессионного анализа Hill-Modells (программа EDX 2,0, C. Grunwald, Arzneimittelwerk, Dresden).
Количественное определение активности люцтферазы в основном определяют по известному методу (Promega Technical Bulletins, No 101/161) с использованием дубликатов и
современных систем для анализа люциферазы (Promega E4030). При добавлении коэнзима
А (СоА) происходит окисление люциферил-СоА с благоприятной кинетикой. После удаления культуральной среды из микропланшета клетки лизируют путем добавления 100
мкл буфера для лизиса (25 мМ трис-фосфат, рН 7,8, 2 мМ дитиотреитол, 2 мМ 1,2диаминоциклогексан-N,N,N'N'-тетрауксусная кислота (CDTA), 10 % (об./об.) глицерин,
1 % (об./об.) тритон Х-100). После инкубирования в течение 15 мин при комнатной температуре 10 мкл клеточного лизата переносят в микропланшет белого цвета, пригодные для
люминометрического определения (Dynatech). Ферментативную реакцию инициируют путем добавления 50 мкл буфера для анализа (20 мМ трицин, рН 7,8, 1,07 мМ
(MgCO3)4Mg(OH)2, 2,67 мМ MgSO4, 0,1 мМ этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТУ),
33,3 мМ дитиотреитол, 270 мкМ коэнзим А, 470 мкМ люциферин из светляков Photinus
pyralis, 530 мкМ rATPNa2). Через 1 мин определяют люминисценцию в течение общего
времени 1 сек и с временем сброса сигнала 5 мин при использовании MicroLumat LB 96 Р,
EG&G Berthold. Таким образом получают данные действия in vitro, представленные в таблице 2, причем аффинность связывания представлена величинами KD, функциональная
активность величинами IC50, а термин "пМ" означает пикомоль в литре.
Таблица 1
Постадийная схема (протокол пептидного синтеза)
Стадия
1
2
3
4
5
6
7
8
9
Функция
Промывка
Промывка
Отщепление
Промывка
Промывка
Промывка
Нейтрализация
Промывка
Промывка
10
Остановка
11
12
13
Конденсация
Промывка
Промывка
Растворитель/реагент об./об.
Метанол
ДХМ
ДХМ/ТФУ (1:1)
Изопропанол
Метанол
ДХМ
ДХМ/DIPEA (9:1)
Метанол
ДХМ
Добавление Восаминокислоты в
ДХМ + DIC + HOBt
ДХМ, по выбору ДХМ/DCF
Метанол
ДХМ
12
Время
2×2 мин
3×3 мин
1×30 мин
2×2 мин
2×2 мин
2×3 мин
3×5 мин
2×2 мин
3×3 мин
прибл. 90 мин
3×2 мин
2×3 мин
BY 7934 C1 2006.04.30
Таблица 2
Соединение
Цетрореликс
Пример 1 (ацетат)
Пример 2
Пример 3
Пример 6
KD[пM]
170 (21)
н/о
181 (1)
154 (1)
н/о
н/о = не определено.
() = число независимых друг от друга испытаний.
Национальный центр интеллектуальной собственности.
220034, г. Минск, ул. Козлова, 20.
13
IС50 [пМ]
198 (5)
242 (3)
684 (2)
492 (2)
221 (2)
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
0
Размер файла
225 Кб
Теги
07934, патент
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа