close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Патент BY 4013

код для вставкиСкачать
ОПИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ПАТЕНТУ
РЕСПУБЛИКА БЕЛАРУСЬ
(19)
BY (11) 4013
(13)
C1
(51)
(12)
7
A 61K 31/155,
A 61K 31/122
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ПАТЕНТНЫЙ
КОМИТЕТ РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ
(54)
КОМБИНАЦИЯ АТОВАКУОНА И ПРОГУАНИЛА ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ
ПРОТОЗОЙНЫХ ИНФЕКЦИЙ, СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ,
ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ, ПРЕПАРАТ
(71) Заявитель: Дзе Веллкам Фаундейшн Лимитед (GB)
(21) Номер заявки: 950461
(72) Авторы: Уинстон, Эдвард ГАТТЕРИДЖ; Дэвид,
(22) 1995.05.19
Брайан, Аштон ХАТЧИСОН; Виктория, Сузан
(86) PCT/GB 93/02425, 1993.11.25
ЛАТТЕР; Мэри ПАДНИ (GB)
(31) 9224739,4
(73) Патентообладатель: Дзе
Веллкам
Фаундейшн
(32) 1992.11.26
Лимитед (GB)
(33) GB
(46) 2001.09.30
(57)
1. Комбинация 2-[4-(4-хлорфенил)-циклогексил]-3-гидрокси-1,4-нафтохинона и прогуанила, отличающаяся тем, что соотношение прогуанил: 2-[4-(4-хлорфенил)-циклогексил]-3-гидрокси-1,4-нафтохинон находится в интервале от 1:1 до 1:3.
2. Комбинация по п. 1, отличающаяся тем, что соотношение прогуанил: 2-[4-(4-хлорфенил)циклогексил]-3-гидрокси-1,4-нафтохинон равно 2:5.
3. Комбинация по пп. 1 или 2, отличающаяся тем, что 2-[4-(4-хлорфенил)-циклогексил]-3-гидрокси-1,4нафтохинон находится в форме транс-изомера или смеси цис и транс- изомеров, в которой преобладает
транс-изомер.
4. Способ лечения и/или профилактики протозойной паразитарной инфекции и инфекции, вызываемой P.
Carinii у млекопитающих, отличающийся тем, что он включает введение эффективного количества комбинации по любому из пп. 1-3.
5. Способ по п. 4, отличающийся тем, что 2-[4-(4-хлорфенил)-циклогексил]-3-гидрокси-1,4-нафтохинон
и прогуанил вводят совместно.
6. Способ по пп. 4 или 5, отличающийся тем, что протозойной инфекцией является малярия.
7. Способ по пп. 4 или 5, отличающийся тем, что протозойной инфекцией является токсоплазмоз.
8. Способ по пп. 4 или 5, отличающийся тем, инфекция вызвана P. Carinii.
9. Фармацевтическая композиция для лечения и/или профилактики протозойной паразитарной инфекции,
отличающаяся тем, что она содержит комбинацию по любому из пп. 1-3 вместе с одним или более фармацевтически приемлемыми носителями.
10. Препарат в виде стандартной дозы, отличающийся тем, что содержит от 50 мг до 3 г каждого из 2[4-(4-хлорфенил)-циклогексил]-3-гидрокси-1,4-нафтохинона и прогуанила, взятых в соотношении (1-3):1.
11. Препарат по п. 10, отличающийся тем, что содержит 500 мг 2-[4-(4-хлорфенил)-циклогексил]-3гидрокси-1,4-нафтохинона и 200 мг прогуанила.
(56)
EP 0123238 A2, 1984.
EP 0401875 A2, 1990.
EP 0362996 A2,1990.
WO 9105550 А1,1991.
WO 9104021 А1,1991.
Данное изобретение касается синергических комбинаций 2-[4-(4-хлорфенил)циклогексил]-3-гидрокси1,4-нафтохинона (атовакуона) и прогуанила, которые имеют противопаразитарную активность. Изобретение
касается также фармацевтических композиций, содержащих такие комбинации, их применения в лечении
инфекций, вызываемых протозойными паразитами, таких как малярия и токсоплазмоз, и их применения в
лечении инфекций, вызываемых Pneumocystis carinii.
BY 4013 C1
Комбинация 2-4-(4-хлорфенил)циклогексил]-3-гидрокси-1,4-нафтохинон (атовакуон) была описана ранее,
например, в ЕП № 123 238, который касается 2-замещенных 3-гидрокси-1,4-нафтохинонов с формулой I:
(I)
в которой каждый R1 представляет собой водород, a R2 выбирается из С1-6-алкокси, аралкокси, С1-6-алкил-С16-алкокси, фенила, замещенного одной или двумя группами, выбранными из галогена и С1-6-алкила, галогена
и пергало- С1-6-алкила, или R1 и R2 оба представляют собой С1-6-алкил или фенил, n обозначает 0 или 1, или
их физиологически приемлемых солей. Известно, что эти соединения обладают противопротозойной активностью. В частности, считают, что соединения формулы (I), в которых n представляет собой 0, активны против малярийного паразита человека Plasmodium falciparum, а также против видов Eimeria, таких как E. tenella
и E. acervulina, которые являются организмами, вызывающими кокцидиоз, а соединения с формулой (I), в
которых n представляет собой 1, активны против простейших рода Theileria, в частности T. annulata или T.
parva. Среди соединений, названных конкретно и приведенных в качестве примера, находится соединение с
формулой (I), в которой n представляет собой 0, R1 представляет собой водород и R2 представляет собой 4хлорфенил, т.е. атовакуон.
Прогуанил представляет собой хорошо известное лекарственное средство для профилактики малярии. Он
является одним из самых безопасных противомалярийных лекарственных средств и его можно давать маленьким детям и беременным женщинам. Однако появилась устойчивость P. falciparum к прогуанилу, в частности в Юго-Западной Азии, и эта устойчивость к прогуанилу представляет собой все увеличивающуюся
проблему.
Для преодоления устойчивости к лекарственным средствам обычной практикой становится применение
комбинаций более чем одного противомалярийного средства, одновременно или последовательно. Однако
многие такие комбинации являются антагонистичными,что приводит к менее эффективному лечению, и схемы приема лекарственных средств часто усложняются, увеличивая вероятность того, что больные не смогут
завершить лечение. Задачей данного изобретения является обеспечение комбинации противомалярийных лекарственных средств, которая не была бы антагонистичной и не требовала сложной схемы приема лекарственных доз.
Неожиданно было обнаружено, что путем комбинирования либо одновременного, либо последовательного атовакуона, представленного в данном описании формулой II:
(II)
и прогуанила достигается усиление противопаразитарной и, в частности, противомалярийной активности.
Кроме того, комбинация соединения формулы (II) и прогуанила может быть легко представлена в виде одного фармацевтического препарата.
Данное изобретение обеспечивает способ лечения и/или профилактики инфекции, вызываемой протозойными паразитами, например малярии или токсоплазмоза, или инфекции, вызываемой P. Carinii у млекопитающих, в том числе у человека, предусматривающий введение эффективного количества атовакуона или
его физиологически приемлемой соли и сопутствующее или последовательное введение эффективного количества прогуанила.
Изобретение также обеспечивает применение атовакуона при изготовлении лекарственного препарата
для введения либо вместе, либо последовательно с прогуанилом для лечения и/или профилактики инфекций
протозойных паразитов, например малярии или токсоплазмоза, или инфекции, вызываемой P. Carinii, у млекопитающих, в том числе у человека.
Предпочтительно соединение с формулой (II) и прогуанил вводят вместе. Более предпочтительно соединение формулы (II) и прогуанил вводят в потенциирующем соотношении.
Таким образом, согласно изобретению, обеспечивается комбинация атовакуона или его физиологически
приемлемой соли и прогуанила, в которой атовакуон или его соль и прогуанил присутствуют в потенциирующем соотношении.
Термин "потенциирующее соотношение" применяется для указания, что атовакуон и прогуанил присутствуют в таком соотношении, что противопаразитарная активность этой комбинации выше, чем активность
2
BY 4013 C1
одного атовакуона или одного прогуанила или аддитивной активности, которая могла бы быть прогнозирована для этой комбинации на основе активностей отдельных компонентов. Таким образом, отдельные компоненты действуют синергически в комбинации при условии, что они присутствуют в потенциирующем соотношении.
Потенциирующее соотношение, которое можно успешно применять для лечения малярии, в том числе
для воздействия на устойчивые к гидроксинафтохинону штаммы малярии, находится в диапазоне 1:0,1-1:100
(прогуанил: атовакуон). Предпочтительно, чтобы потенциирующее соотношение находилось в диапазоне
1:0,2-1:10.
Особенно предпочтительное потенциирующее соотношение находится в диапазоне 1:1-1:3.
Данное изобретение обеспечивает также способ лечения и/или профилактики малярии у млекопитающих,
в том числе у человека, предусматривающий введение эффективного количества комбинации атовакуона или
его физиологически приемлемой соли и прогуанила.
Гидроксильная группа атовакуона может образовать соли с подходящими основаниями, и физиологически приемлемыми солями атовакуона являются соли неорганического основания, такие как соли щелочных
металлов (например соли кальция); соли органических оснований, например фенилэтилбензиламина, дибензилэтилендиамина, этаноламина и диэтаноламина и соли аминокислот, например лизина и аргинина.
Соединение формулы (II) может существовать в виде цис- или транс-изомера, то есть кольцо циклогексила может быть цис- или транс-замещенным нафтохиноновым ядром и карбофенильной группой. В соответствии с данным изобретением можно использовать как цис-, так и транс-изомеры и их смеси. Вообще при
использовании этого соединения в виде смеси изомеров транс-изомер будет присутствовать в количестве
приблизительно 50 % или будет преобладающим изомером, но использование смесей, в которых преобладает цис-изомер, также включено в сферу действия изобретения. Конкретное отношение изомеров можно
варьировать, если требуется; типичными являются смеси, в которых отношение цис/транс-изомеров равно
приблизительно 1:1, 40:60 и 5:95. Для применения, согласно данному изобретению, предпочтительны трансизомер соединения с формулой (II) или смесь его цис- и транс-изомеров, содержащая по меньшей мере 95 %,
например 99 % транс-изомера.
Соединение с формулой (II) может также существовать в его таутомерной форме, в которой гидроксильная группа отдает свой протон одной из оксогрупп, и применение таких таутомерных форм включено в сферу действия данного изобретения. Однако считают, что стабильной формой является форма, представленная
в формуле (II).
Количество комбинаций атовакуона и прогуанила, необходимое для эффективного действия в качестве
противопаразитарного агента, будет изменяться и, в конце концов, определяется по усмотрению ветеринарного врача или медицинского работника. Факторами, которые должны учитываться, являются способ введения и природа препарата, вес тела млекопитающего, возраст и общее состояние, и природа, и тяжесть заболевания. В основном подходящая эффективная доза для введения человеку при лечении малярии находится в
диапазоне 2 мг-30 мг прогуанила на килограмм веса тела в день и 0,5 мг-30 мг атовакуона на килограмм веса
тела в день, например 3-20 мг/кг/день прогуанила и 1-20 мг/кг/день атовакуона, в частности 5-15 мг/кг/день
прогуанила и 3-15 мг/кг/день атовакуона.
Подходящая эффективная доза для введения человеку для профилактики малярии находится в диапазоне
от 3 до 20 мг на килограмм веса тела в неделю для прогуанила и атовакуона, например от 6 мг/кг до 10 мг/кг
в неделю для прогуанила и атовакуона.
Названные выше дозы рассчитаны для лекарственных средств per se.
Для применения, согласно данному изобретению, комбинация атовакуона и прогуанила предпочтительно
представлена в виде фармацевтического препарата.
Фармацевтические препараты содержат эти активные ингредиенты (т.е. комбинацию атовакуона и прогуанила) вместе с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми носителями и иногда другими терапевтическими и/или профилактическими ингредиентами. Носитель или носители должны быть приемлемыми в смысле их совместимости с другими ингредиентами этой формулы и безвредными для реципиента.
Поэтому данное изобретение обеспечивает фармацевтический препарат, содержащий комбинацию атовакуона и прогуанила в сочетании с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми носителями.
Кроме того, данное изобретение обеспечивает способ получения фармацевтического препарата, предусматривающий соединение комбинации атовакуона и прогуанила с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми носителями.
Комбинация атовакуона и прогуанила может быть для удобства представлена в виде фармацевтического
препарата в форме стандартных (унифицированных) доз. Удобный препарат в виде стандартной дозы содержит активные ингредиенты в количествах от 10 мг до 3 г каждого, например 50 мг-3 г каждого. Типичные стандартные дозы могут содержать, например, 500 мг атовакуона и 500 мг прогуанила.
Фармацевтические препараты включают в себя препараты, пригодные для перорального, топического (в
том числе дермального, трансбуккального и подъязычного), ректального и парентерального (в том числе
подкожного, чрескожного, внутримышечного и внутривенного) введения, а также для введения при помощи
3
BY 4013 C1
назогастрального зонда. Препарат может быть, если нужно, представлен для удобства в виде отдельных дозированных единиц и может быть приготовлен любым из способов, хорошо известных в области фармации.
Все способы предусматривают стадию соединения активных ингредиентов с жидкими носителями или тонко
измельченными твердыми носителями или теми и другими с последующим приданием формы полученному
продукту, если это желательно.
Наиболее предпочтительно фармацевтические композиции для перорального введения, в которых носитель является твердым, представлять в виде препаратов со стандартной рассчитанной на один прием дозой,
таких как болюсы, капсулы или таблетки, каждая содержащая заданное количество активных ингредиентов.
Таблетка может быть приготовлена путем прессования или формования при помощи шаблона (формы), иногда с одним или несколькими вспомогательными ингредиентами. Прессованные таблетки могут быть приготовлены путем прессования в пригодной для этого машине активных соединений в свободно текучей форме,
такой как порошок или гранулы, иногда смешанные со связующим веществом, смазывающим веществом,
инертным разбавителем, смягчающим агентом, поверхностно-активным веществом или диспергирующим
агентом. Формованные таблетки могут быть приготовлены путем отливки в форме инертного жидкого разбавителя. Иногда таблетки могут иметь покрытие, а если они не покрыты, то могут иметь отметки на их поверхности. Капсулы могут быть приготовлены путем помещения активных ингредиентов либо одних, либо в
смеси с одним или несколькими вспомогательными ингредиентами в капсульные оболочки с последующим
загерметизированием их обычным образом. Крахмальные облатки аналогичны капсулам, в которых активные ингредиенты вместе с любым вспомогательным ингредиентом (ингредиентами) загерметизированы в
оболочку из рисовой бумаги. Комбинация соединения с формулой (II) и прогуанила может быть также
сформована в виде диспергируемых гранул, которые, например, могут быть суспендированы в воде перед
введением или насыпаны на пищевой продукт. Гранулы могут быть упакованы, например, в небольшой пакет. Препараты, пригодные для перорального введения, в которых носитель представляет собой жидкость,
могут быть представлены в виде раствора или суспензии в водной или неводной жидкости или в виде жидкой эмульсии типа масла в воде.
Препараты для перорального введения могут представлять собой лекарственные формы с контролируемым высвобождением активных ингредиентов (формы пролонгированного действия), например таблетки, в
которых активные ингредиенты готовят в подходящем контролирующем высвобождение матриксе, или активные ингредиенты покрыты пленкой, контролирующей выделение. Такие препараты могут быть особенно
пригодны для профилактического применения.
Активные ингредиенты могут быть также приготовлены в виде раствора или суспензии, пригодных для
введения при помощи назогастрального зонда.
Фармацевтические препараты для ректального введения, в которых носитель твердый, наиболее предпочтительно готовят в виде суппозиториев, содержащих лекарственное средство для одного введения. Пригодными носителями являются какао-масло и другие материалы, обычно применяемые для суппозиториев в
фармации. Суппозитории могут быть приготовлены смешиванием активной комбинации с размягченным
или расплавленным носителем (носителями) с последующим охлаждением и формованием в шаблонах.
Фармацевтическими препаратами, пригодными для парентерального введения, являются стериальные
растворы или суспензии активной комбинации в водных или маслянистых носителях. Инъецируемые препараты могут быть приспособлены для инъекции ударной дозы или для непрерывного вливания. Такие препараты для удобства помещают в контейнеры для упаковок на один прием и для многократного приема, которые герметизируют после введения препарата и хранят до момента использования. Альтернативно, активные
ингредиенты перед применением могут быть в виде порошка, который находится в подходящем носителе,
таком как стерильная апирогенная вода.
Комбинация атовакуона и прогуанила может быть приготовлена в виде депо-препарата пролонгированного действия, который можно вводить при помощи внутримышечной инъекции или имплантации, например
подкожной или внутримышечной. Депо-препараты могут содержать, например, пригодные полимерные или
гидрофобные материалы или ионообменные смолы. Такие препараты пролонгированного действия особенно
удобны для профилактического применения.
Должно быть понятно, что кроме упомянутых выше компоненов-носителей фармацевтические препараты
для различных путей введения, описанных выше, могут содержать в случае необходимости один или несколько дополнительных компонентов-носителей, таких как растворители, буферы, вкусовые вещества, связующие вещества, поверхностно-активные агенты, загустители, смазывающие вещества, консерванты (в том
числе антиоксиданты) и т.п., и вещества, включаемые для того, чтобы сделать препарат изотоничным с кровью будущего реципиента.
Для применения в ветеринарии могут быть использованы композиции для перорального, парентерального и интрарубцового введения (через рубец).
Способы получения атовакуона описаны в ЕР 123 238 и один конкретный способ иллюстрирован в примере 1.
4
BY 4013 C1
Пример 1.
2-[транс-4-(4-хлорфенил)циклогексил]-3-гидрокси-1,4-нафтохинон.
а) 4-(4-хлорфенил)циклогексан-1-карбоновая кислота.
Ацетилхлорид (30 г) и мелко растертый в порошок хлорид алюминия (60 г) перемешивали вместе в дисульфиде серы (120 мл) и затем охлаждали до -50 °С в бане с СО2/окситолом. Циклогексен (30 г), предварительно охлажденный до -50 °С, добавляли по каплям в течение 10 минут, поддерживая температуру реакционной смеси ниже -20 °С. Смесь перемешивали при -50 °С еще 60 минут и затем растворитель
декантировали, оставляя клейкий оранжевый комплекс. Добавляли немного хлорбензола при нагревании материала до температуры окружающей среды; затем добавляли остаток хлорбензола (всего 300 мл), полученный таким образом раствор нагревали при 40 °С в течение 3 часов при перемешивании, выливали в смесь
льда и концентрированной соляной кислоты и отделяли органический слой. Его промывали 2М соляной кислотой, 2М гидроксидом натрия и водой, сушили над безводным сульфатом натрия и выпаривали досуха.
Продукт перегоняли в вакууме, фракцию, кипящую при 140-154 °С (0,1 мм Hg), собирали, растворяли в равном объеме петролейного эфира (40-60 мл), охлаждали до 6 °С и пробулькивали через раствор азот в виде
непрерывного потока, после чего извлекали отделенное бесцветное твердое вещество.
К раствору гидроксида натрия (6,2 г) в воде (42 мл) при 0 °С добавляли бром (2,8 мл). Полученный, как
описано выше, замещенный гексагидроацетофенон (3,1 г) растворяли в диоксане (15 мл) и затем добавляли
холодный раствор гипобромита, поддерживая температуру реакционной смеси ниже 20 °С. Реакционную
смесь перемешивали при температуре окружающей среды в течение 6 часов, затем оставляли стоять в течение ночи. Для разрушения избытка гипобромита добавляли метабисульфит натрия, смесь охлаждали и затем
подкисляли, получая бесцветное твердое вещество. Его отфильтровывали, промывали водой, сушили и перекристаллизовывали из этанола, получая 4-(4-хлорфенил)циклогексан-1-карбоновую кислоту, температура
плавления 254-256 °С.
в) 2-[4-(4-хлорфенил)циклогексил]-3-хлор-1,4-нафтохинон.
Смесь 2-хлор-1,4-нафтохинона (3,95 г, 0,02 моля), 4-(4-хлорфенил)циклогексан-1-карбоновой кислоты
(4,9 г, 0,02 моля) и порошкообразного нитрата серебра (1,05 г, 0,0062 моля) нагревали с обратным холодильником при сильном перемешивании в 40 мл ацетонитрила. Раствор персульфата аммония (12,0 г, 0,0525
моля) в 50 мл воды добавляли каплями в течение 1 часа. Смесь нагревали с обратным холодильником в течение 3 часов, затем охлаждали на льду в течение 30 минут, после чего фильтровали и оставшееся липкое
твердое вещество экстрагировали дважды кипящим хлороформом для удаления неорганического материала.
Хлороформ удаляли выпариванием, получая в остатке желто-коричневое твердое вещество (приблизительно
2,7 г). Его растворяли в 40 мл кипящего ацетонитрила; небольшое количество нерастворимого материала
удаляли фильтрованием. После охлаждения названное в заголовке соединение отделяли в виде желтых кристаллов (550 мг), температура плавления 172-175 °С.
ЯМР, dH(δ-DMSO) 8,05 (2Н, мультиплет, β-нафт.), 7,85 (2Н, мультиплет, α-нафт.), 7,30 (4Н, с., PhH),
3,30(1Н, шир.т., СН), 2,67(1Н, шир.т., СН), 1,2-2,4(8Н, мультиплет, 4xСН2).
2-[4-(4-хлорфенил)циклогексил]-3-гидрокси-1,4-нафтохинон
Продукт стадии в) суспендировали в 10 мл кипящего метанола и добавляли по каплям 0,55 г гидроксида
калия в 5,5 мл воды в течение 15 минут. Смесь кипятили с обратным холодильником, пока не образовывался
темно-красный раствор (после приблизительно 6 часов), затем добавляли осторожно по каплям 2 мл концентрированной соляной кислоты. Смесь охлаждали и фильтровали и твердый остаток тщательно промывали
водой. Водные промывки снова подкисляли и фильтровали. Объединенные твердые остатки (500 мг), температура плавления 200-209 °С, перекристаллизовывали из ацетонитрила, получая названный в заголовке продукт в виде транс-изомера (300 мг), температура плавления 216-219 °С.
Пример 2.
Следующие примеры иллюстрируют обычные фармацевтические препараты, которые могут применяться
в соответствии с данным изобретением.
А. Покрытая пленкой таблетка.
кор (центральная часть):
соединение примера 1
500 мг
гидрохлорид прогуанила
200 мг
микрокристаллическая целлюлоза (Avicel PH101)
130 мг
гидроксипропил-целлюлоза, Lo-sub(LHПC, LHII)
99 мг
натрий-гликолат крахмала (Explotab)
30 мг
повидон КЗО
36 мг
стеарат магния
5 мг
масса в прессованном виде
1000 мг
покрытие:
дисперсия полимера (Гидроксипропилметилцеллюлоза и диоксид титана и полиэтиленгликоль 400 и краситель)
20 мг
5
BY 4013 C1
глянцевание:
полиэтиленгликоль 8000
2 мг
общая масса 1022 мг
В. Диспергируемая покрытая пленкой таблетка.
ядро:
соединение примера 1
гидрохлорид прогуанила
микрокристаллическая целлюлоза (Avicel PH101)
гидроксипропилцеллюлоза, Lo-sub(LHPC, LHII)
натрий-гликолат крахмала (Explotab)
повидон КЗО
стеарат магния
докузат натрия
силикат магния-алюминия (Veegum F)
натрия сахарин
масса в прессованном виде
покрытие:
дисперсия полимера (Гидроксипропилметилцеллюлоза и диоксид титана и полиэтиленгликоль 400 и краситель)
глянцевание:
полиэтиленгликоль 8000
500 мг
200 мг
100 мг
83 мг
40 мг
20 мг
5 мг
1 мг
50 мг
1 мг
1000 мг
10 мг
2 мг
общая масса 1012 мг
Результаты биологического испытания.
Пример 3.
Сравнение взаимодействия лекарственных средств в комбинациях соединения примера 1 с другими противомалярийными препаратами.
Исследования in vitro чувствительности к лекарственным средствам проводили при помощи полуавтоматизированного способа Desjardins (Desjardins et al. Antimalarial Agents and Chemotherapy 1979; 16(6):710-718).
Противомалярийную активность в этой системе оценивают по ингибированию включения радиоактивно меченого гипоксантина в паразитах градационными концентрациями лекарственных средств.
Противомалярийные лекарственные средства для испытания растворяли в воде, 95 % этаноле или диметилсульфоксиде (DMSO); лекарственные средства, растворенные в воде, разводили 1:1 95 % этанолом, а лекарственные средства, растворенные в 95 % этаноле, разводили 1:1 водой. Затем растворы разводили культуральной средой, содержащей 10-процентную сыворотку человека, до исходных концентраций,
превышающих в 20-50 раз IС50. Испытанные лекарственные средства и их растворители перечислены ниже:
Лекарственное средство
Соединение примера 1
Хинин
Хлорохин
Мефлохин
Примахин
Артесунат
РМ443
Тетрациклин
Норфлоксацин
Ципрофлоксацин
Прогуанил
Циклогуанил
Пириметамин
Триметоприм
Сульфаметоксазол
Дапсон
Клопидол
Аллопуринол
PS-15
WR 99210
Исходный растворитель
DMSO
Этанол-вода
Вода-этанол
Этанол-вода
Этанол-вода
Этанол-вода
DMSO
DMSO
DMSO
DMSO
Этанол-вода
Этанол-вода
DMSO
DMSO
DMSO
DMSO
DMSO
Этанол-вода
DMSO
DMSO
6
Среда
1640
1640
1640
1640
1640
1640
1640
1640
1640
1640
Lo-фолат
Lo-фолат
Lo-фолат
Lo-фолат
Lo-фолат
Lo-фолат
Lo-фолат
Lo-фолат
Lo-фолат
Lo-фолат
BY 4013 C1
Для исследования комбинаций лекарственных средств их растворы в исходных концентрациях комбинировали в различных соотношениях (1:5, 1:2, 2:1 и 5:1). Затем растворы лекарственных средств и комбинации
вносили в 96-луночный микротитрационный планшет, получая двойные ряды соединения примера 1 лекарственного средства, комбинируемого с ним, и четыре комбинации двух лекарственных средств. Серийные
разведения 1:3 лекарственных средств средой были сделаны для заполнения 96-луночного микротитрационного планшета при помощи 12-канального пипеттора. Для оценки лекарственных средств, классифицируемых как ингибиторы редуктазы дигидрофолиевой кислоты (DHFR), применяли модифицированную культуральную среду, содержащую только физиологические концентрации фолиевой кислоты и РАВА.
Остальные биологические процедуры проводили согласно способу Desjardins за исключением того, что
использовали три штамма P. falciparum (устойчивый к множеству лекарственных средств W-2 клон, чувствительный к лекарствам, но устойчивый к мефлохину D-6 клон и С2В изолят, устойчивый к соединению примера 1), и инкубацию удлиняли до 72 часов.
Отдельные IС50 рассчитывали при помощи программы "MINSQ" из Micromath Scientific Software. Каждая
серия парных данных хорошо соответствовала функции гиперболического тангенса, примененной Desjardins.
IС50 нормализовали путем принятия за 1 величины IС50 для соединения примера 1 и для других находящихся в комбинациях лекарственных средств с пропорциональными нормализованными величинами для каждого соотношения из двух лекарственных средств. Путем подставления этих данных в уравнение, представленное ниже, была построена изоболограмма:
Уi = 1-[Хi/(Хi+е1x(1-Хi))],
где Уi - IС50 для соединения примера 1 при комбинировании его с другим лекарственным средством;
Xi - IС50 для другого лекарственного средства при комбинировании его с соединением примера 1;
I - параметр взаимодействия, свидетельствующий о степени обратимости.
Величины I рассчитывали для каждой комбинации. Положительные величины I свидетельствовали о синергической комбинации, отрицательные величины I свидетельствовали об антагонизме, а I = 0 указывало на
аддитивное взаимодействие.
Результаты представлены в таблице 1.
Таблица 1
Лекарственное средство, комбинированное
с соединением примера 1
Хинин
Хлорохин
Мефлохин
Тетрациклин
Примахин
Артесуновая кислота
РМ443
Норфлоксацин
Ципрофлоксацин
Пириметамин
Триметоприм
Прогуанил
Циклогуанил
Аллопуринол
PS-15
WR 99210
Сульфаметоксазол
Дапсон
Клопидол
W-2
-1,36
-1,84
-1,19
1,27
-0,79
I
D-6
C2B
-1,40
1,11
0,02-0,08
-0,18
-1,28
1,02
-1,22
0,36
1,27
2,43, 2,88
2,21
1,14
1,77, 0,65, 1,97
0,02
2,75
-0,39
2,38, 2,65
2,56
1,66
0,43
-0,74
-0,48
0,58
2,56
0,13-0,73
0,73
Эти результаты показывают, что комбинации 2-[4-(4-хлорфенил)циклогексил]-3-гидрокси-1,4нафтохинона и прогуанила обнаружили наиболее стойкое потенциирование по сравнению с другими испытанными комбинациями лекарственных средств, в частности по отношению к устойчивому к гидроксинафтохинону штамму С2В.
Оптимальное соотношение комбинации с прогуанилом определяли для каждого из трех штаммов малярийного паразита путем определения отношения IС50 прогуанила к IС50 соединения формулы (II). Эти результаты представлены в таблице 2 ниже.
7
BY 4013 C1
Таблица 2
Прогуанил: соединение формулы (I)
W-2
920:1, 2473:1
D-6
4038:1
С2В
0,2:1
Пример 4.
Сравнение активностей против Toxolasma in vivo соединения примера 1, прогуанила и их комбинаций.
Активности соединений и комбинаций испытывали в мышиной модели T. gondii, используя увеличение
времени до смерти и процент выживания мышей как меры активности лекарственного средства.
Группы 10, 20 г СВА/СА мышей инфицировали перорально путем введения через желудочный зонд 6
цист штамма С56 T. gondii и лечение лекарственным средством начинали спустя 3 дня и продолжали в течение 10 дней. Все лекарственные средства вводили перорально при помощи желудочного зонда.
Исследовали следующие группы:
контрольная
атовакуон @ 10 мг/кг
атовакуон @ 25 мг/кг
прогуанил @ 25 мг/кг
атовакуон @ 10 мг/кг+прогуанил @ 25 мг/кг
атовакуон @ 25 мг/кг+прогуанил @ 25 мг/кг.
Всех животных обследовали дважды в день в течение 30 дней и все смерти регистрировали.
Эти результаты представлены в таблицах 3 и 4.
Таблица 3
Среднее время до смерти (дни)
Прогуанил (мг/кг)
0
25
Атовакуон
10 мг/кг
20,1
18,4
0
140
9,0
25 мг/кг
24,1
29,3
Таблица 4
Процент выживания
Прогуанил (мг/кг)
0
25
Атовакуон
10 мг/кг
10,1
0,0
0
10,0
0,0
25 мг/кг
10,0
80,0
Среднее время до смерти контрольных мышей было равно 14 дням и выжило только одно животное
(10 %). (Это животное, возможно, не было инфицировано вследствие низкого количества инокулята). Один
атовакуон увеличил время до смерти до 20,1 дней при 10 мг/кг и до 24,1 дней при 25 мг/кг, в обоих случаях с
одним выжившим животным (10 %). Прогуанил вопреки его превосходной надежности (безопасности) для
человека является токсичным для мышей. При 25 мг/кг прогуанил обнаруживает признаки токсичности,
снижая среднее время до смерти до 9 дней, без выживших животных. Комбинация 25 мг/кг атовакуона и 25
мг/кг прогуанила дала увеличенное время до смерти, несмотря на токсичность прогуанила, и 80 % мышей
выжили по сравнению с минимальным выживанием 10 % мышей, которым давали один атовакуон.
Пример 5.
Сравнение активностей против Toxoplasma in vitro соединения примера 1, прогуанила и их комбинаций.
Исследования чувствительности к лекарственным средствам in vitro проводили при помощи полуавтоматического способа, основанного на способе, примененном при малярии (Desjardins et al., Antimicrobial Agents
and Chemotherapy, 1979, 16, (6), 710-718), но с применением избирательного включения 3[Н]-урацила T. gondii. Активность против Toxoplasma в этой системе оценивали по ингибированию поглощения радиоактивно
меченого урацила в паразитов градационными концентрациями лекарственных средств.
Лекарственные средства растворяли в DMSO и разведения готовили при помощи культуральной среды,
содержащей 3 %-ную сыворотку плода теленка. Для исследования комбинаций лекарственных средств растворы их при исходных концентрациях комбинировали в различных соотношениях: 1:1, 1:3, 3:1. Серийные
разведения 1:2 растворов лекарственных средств и комбинаций готовили и использовали в парных лунках
96-луночного планшета, засеянного предварительно клетками Hela и штамма RH T. gondii. Лекарственные
8
BY 4013 C1
средства добавляли через 2 часа после добавления паразита и планшет инкубировали при 37 °С в течение 24
часов, после чего добавляли 3[Н]-урацил и инкубирование продолжали еще 8 часов. Анализ завершали удалением супернатантной жидкости, разрушением содержащих T. gondii клеток в додецилсульфате натрия и
осаждением меченых белков при помощи ТХУ на фильтровальных подложках. Включение метки измеряли в
Beta plate сцинтилляционном счетчике. Процент ингибирования включения урацила рассчитывали для этих
соединений и комбинаций и IС50 рассчитывали при помощи программы GSI. IС50 нормализовали путем принятия за 1 IС50 для соединения примера 1 и прогуанила с нормализованными величинами для каждого отношения двух исследуемых лекарственных средств. Изоболограмму строили нанесением на график этих нормализованных IС50 друг против друга. Потенциирование было в том случае, когда эти величины находились
ниже линии изоболограммы, величины на линии свидетельствовали об аддитивном действии, а величины
выше линии свидетельствовали об антагонизме.
Планшеты применяли в трех повторностях и для построения изоболограммы использовали все величины.
Эти результаты представлены в таблице 5.
Таблица 5
Нормализованные IС50
Атовакуон
0,559278
0,196689
0,729381
0,345238
0,130952
0,233333
0,404959
0,229201
0,244904
Прогуанил
Потенциирование
0,583893
0,614094
0,253691
0,527273
0,6
0,118182
0,451538
0,768462
0,091538
Нет
Да
Да
Да
Да
Да
Да
Да
Да
Эти результаты показывают, что комбинации атовакуона и прогуанила проявляют потенциирование in
vitro против T. gondii.
Пример 6.
Сравнение активностей против Pneumocystis in vivo соединения примера 1, прогуанила и их комбинаций.
Активности этих соединений и их комбинаций испытывали в модели Scid mouse Pneumocystis пневмонии.
Уровень инфекции мышей в каждой группе измеряли при помощи стандартных легочных мазковотпечатков и иммунофлуоресцентных тестов. Был принят счет баллов для каждой мыши, в котором 0 = нет
и+4 = очень тяжелая инфекция.
Результаты представлены в таблице 6.
Обработка
Контроль (необраб.)
Атовакуон 50 мг/кг р.о. в день
Атовакуон 25 мг/кг р.о. в день
Прогуанил 25 мг/кг р.о. в день
Атовакуон и прогуанил
50+25 мг/кг р.о. в день
Атовакуон и прогуанил
25+25 мг/кг р.о. в день
Таблица 6
%от контроСредний балл ±SE
ля
3,70±0,14
100
2,50±0,16
68
3,10±0,17
84
3,80±0,13
85
0
0
0
0
0
+1
0
0
0
0
Баллы
+3
0
5
1
0
5
4
1
0
0
5/10
0,50±0,21
14
1
0
4
4
0
8/9
2,22±0,31
60
+4
3
5
7
2
+4
7
0
2
8
Число инфиц./
число испытан.
10/10
10/10
10/10
10/10
Атовакуон один давал уменьшение в балле инфекции. Прогуанил один при 25 мг/кг в день был неэффективен в профилактике РСР у мышей (Scid mouse). Прогуанил в комбинации с атовакуоном обнаруживал синергию.
Государственный патентный комитет Республики Беларусь.
220072, г. Минск, проспект Ф. Скорины, 66.
9
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
0
Размер файла
221 Кб
Теги
4013, патент
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа