close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Патент BY 5614

код для вставкиСкачать
ОПИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ПАТЕНТУ
РЕСПУБЛИКА БЕЛАРУСЬ
BY (11) 5614
(13) C1
(19)
7
(51) A 61K 9/127, 31/496,
(12)
A 61P 31/04, 31/06,
31/08
НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР
ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ
СОБСТВЕННОСТИ
(54)
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЛИПОСОМАЛЬНОЙ ФОРМЫ
РИФАМПИЦИНА
BY 5614 C1
(21) Номер заявки: a 19990770
(22) 1999.08.04
(46) 2003.12.30
(71) Заявитель: Государственное научное учреждение "ИНСТИТУТ ФОТОБИОЛОГИИ НАЦИОНАЛЬНОЙ
АКАДЕМИИ НАУК БЕЛАРУСИ"
(BY)
(72) Авторы: Матус Виль Константинович;
Царенков Валерий Минович; Гуревич
Геннадий Львович; Мартынова Мария
Алексеевна; Никольская Валентина
Петровна; Конев Сергей Васильевич
(BY)
(73) Патентообладатель: Государственное
научное учреждение "ИНСТИТУТ ФОТОБИОЛОГИИ НАЦИОНАЛЬНОЙ
АКАДЕМИИ НАУК БЕЛАРУСИ"
(BY)
(57)
1. Способ получения липосомальной формы рифампицина путем формирования сухой
липидной пленки из смеси липосомообразующих компонентов и рифампицина с последующим ее диспергированием в натрий-фосфатном буфере до получения липосом с включенным рифампицином, отличающийся тем, что в смесь липосомообразующих компонентов
вводят в качестве заряд-формирующего компонента стеариновую кислоту при мольном соотношении фосфатидилхолин : холестерин : стеариновая кислота равном 10,0:0,5:0,2, причем количество суммарных липидов составляет 20,0-75,0 мг на 1 мл буфера, рифампицин
вносят из расчета 3,75 мг на 1 мл буфера, дополнительно в качестве антиоксиданта в
смесь вводят α-токоферол из расчета 0,02-0,04 мг на 1 мг суммарных липидов, к полученной сухой пленке добавляют 0,1 М натрий-фосфатный буфер, содержащий 0,1 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты, полученную смесь прогревают, после чего инкапсулируют рифампицин методом высокоскоростного механического диспергирования в течение
10-15 минут до получения основной фракции мультиламелярных липосом с размером до
3,5 мкм, полученную суспензию липосомального рифампицина стабилизируют, причем
инкапсулирование и стабилизацию проводят в атмосфере инертного газа.
2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что количество суммарных липидов составляет
50,0 мг на 1 мл буфера.
3. Способ по п. 1 или п. 2, отличающийся тем, что α-токоферол вводят из расчета
0,02-0,04 мг на 1 мг суммарных липидов.
4. Способ по любому из пп. 1-3, отличающийся тем, что смесь прогревают при 60 °С
в течение 5 минут, полученную суспензию липосом стабилизируют при 40 °С в течение
1 часа, а в качестве инертного газа используют азот.
(56)
SAITO H. et al. Antimicrob. Ag. Chemother. - 1989.- V. 33. - № 4. - P. 429-433.
Курунов Ю.Н. и др. Проблемы туберкулеза. - 1992. - № 1-2. - С. 13-14.
BY 5614 C1
Ахрем А.А. и др. Весцi АН БССР, сер. хiм. н. - 1991. - № 5. - С. 58-61.
BERMUDEZ M. et al. J. Liposome Res. - 1996. - № 1. - P. 221-222.
RU 2122855 C1, 1998.
Гуревич Г.Л. и др. Антибиотики и химиотерапия. - 1992. - Т. 37. - № 7. - С. 25.
Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способам получения липосомальной формы антибиотиков.
Известен способ инкапсулирования рифампицина, предусматривающий получение
сухой липидной пленки, состоящей из фосфатидилхолина (ФХ), холестерина (ХЛ) и кардиолипина (КЛ) в мольном соотношении 7:2:1 с последующим ее эмульгированием и диспергированием ультразвуком в буферном растворе рифампицина [1]. Недостатками данного
способа являются низкая эффективность инкапсулирования антибиотика, недостаточная
стабильность лекарственной формы, а также сопутствующий аллергенный эффект препарата, обусловленный введением в липосомообразующую смесь кардиолипина в качестве
компонента, формирующего заряд на поверхности липосом.
Наиболее близким по технической сущности к предлагаемому изобретению является
способ получения липосомального рифампицина, основанный на эмульгировании в фосфатном буфере сухой липидной пленки, состоящей из ФХ, ХЛ и децитилфосфата (ДФ) в
мольном соотношении 7:1:2, содержащей рифампицин, с последующей ультразвуковой
обработкой полученной эмульсии [2] (прототип). Однако и данный способ имеет ряд недостатков. Это низкая эффективность включения в липосомы антибиотика, недостаточная
стабильность препарата при хранении и токсичность препарата за счет децитилфосфата и
модифицирующего действия ультразвука на липиды.
Задача изобретения - повышение эффективности инкапсулирования антибиотика,
улучшение стабильности препарата при хранении, а также повышение качества лекарственной формы.
Указанная задача решается тем, что оптимизируют состав липосомообразующей смеси и используют иной способ формирования липосом. Вместо аллергенного кардиолипина
или токсичного децитилфосфата в качестве компонентов, формирующих на поверхности
липосом заряд, используют стеариновую кислоту (СтК) и дополнительно вносят в липосомообразующую смесь антиоксидант DL-α-токоферол. В эту же смесь исходно вносят и
рифампицин. Поверхностный заряд препятствует агрегации липосом, а антиоксидант
удерживает процессы перекисного окисления липидов (ПОЛ) липосом на низком уровне.
Введение в липосомообразующую смесь антиоксиданта и проведение всех этапов инкапсулирования рифампицина в атмосфере инертного газа (азот) обеспечивают получение
стабильной и нетоксичной лекарственной формы.
Способ осуществляют следующим образом.
Компоненты липосомообразующей смеси - яичный фосфатидилхолин (ЯФХ), холестерин (ХЛ), стеариновую кислоту (СтК) в мольном соотношении 10:0,5:0,2 вместе с DLα-токоферолом (0,02-0,04 мг на 1,0 мг суммарных липидов) и рифампицином растворяют
в хлороформе (из расчета 500-750 мг суммарных липидов и 35-40 мг рифампицина на 10
мл хлороформа) и упаривают под вакуумом в роторном испарителе при температуре 3540 °С до образования сухой пленки. К полученной пленке добавляют 10 мл 0,1 М натрийфосфатного буфера, содержащего 0,1 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (рН 7,4),
смесь прогревают при 60 °С на водяной бане 5 мин. Затем на высокоскоростном механическом миксере смесь диспергируют в течение 10-15 мин до получения основной фракции
мультиламеллярных (МЛЛ) липосом размером до 3,5 мкм. Полученную суспензию липосомального рифампицина инкубируют в течение 1 часа при 40 °С для стабилизации
структуры липосомального "конверта", охлаждают до комнатной температуры, расфасовывают в ампулы и лиофилизируют. Все операции проводят в атмосфере азота.
Существенные отличия заявляемого способа от прототипа заключаются в следующем:
2
BY 5614 C1
Во-первых, для придания липосомам отрицательного заряда в состав липосомальной
мембраны вводят стеариновую кислоту вместо используемого в прототипе токсичного децитилфосфата. Она не токсична и полностью биодеградируема, поскольку продукты ее
распада легко включаются в обменные процессы клеток. Установлено, что отрицательно
заряженные липосомы более эффективно взаимодействуют с клеточными структурами
легких, чем нейтральные [3, 4], а поверхностный заряд препятствует их агрегации.
Во-вторых, в предлагаемом способе используют иное мольное соотношение липосомообразующих компонентов ЯФХ : ХЛ : СтК, равное 10:0,5:0,2, тогда как в прототипе соотношение ФХ : ХЛ : ДФ равно 7:1:2. В заявляемом способе заметно увеличена доля
ЯФХ, снижено содержание ХЛ и вместо ДФ используется СтК. Поскольку ЯФХ сам является биоантиоксидантом и иммуностимулятором, его можно рассматривать в качестве самостоятельного противовоспалительного средства [5, 6]. Увеличение доли ЯФХ и уменьшение ХЛ, обладающего атерогенным действием, обеспечивает существенное повышение
качества липосомальной формы рифампицина.
В третьих, в заявляемом способе для ингибнрования ПОЛ в липосомообразующую
смесь вводят 0,02-0,04 мг DL-α-токоферола на 1мг суммарных липидов, а ультразвуковую
обработку заменяют высокоскоростным механическим диспергированием и все процедуры инкапсулирования антибиотика выполняют в атмосфере инертного газа (азота). Использование указанных приемов обеспечивает повышение стабильности новой лекарственной формы при хранении.
Совокупность указанных признаков используют впервые, что обеспечивает положительные эффекты предлагаемого изобретения: увеличивает эффективность инкапсулирования антибиотика, повышает стабильность липосомального рифампицина, уменьшает
токсичность и, в целом, повышает качество лекарственной формы. Результаты патентных
исследований позволяют считать совокупность существенных признаков заявляемого
изобретения новой.
С целью выяснения достоинств предлагаемого способа получения липосомальной
формы рифампицина результаты испытания способа (в границах значений описанных в
формуле заявки) сопоставлены с аналогичными данными способа прототипа. Сопоставляют следующие параметры: эффективность инкапсулирования рифампицина, стабильность препарата, то есть длительность удержания антибиотика липосомами в процессе
хранения и содержание в липосомах продуктов ПОЛ, а также размер и состав (удельное
содержание типовых групп липосом) в полученных партиях. Учитывают три типовых
группы размеров липосом: мелкие (от 20 до 3500 нм); средние (от 3500 до 5000 нм) и
крупные (более 5000 нм).
Для определения количества рифампицина, инкапсулированного в липосомы, небольшое количество препарата наносят на колонку с сефадексом G-50 и определяют концентрацию антибиотика спектрофотометрически (в двухволновом режиме D 475/520) в
составе липосом и свободного, разделяя его путем гель-фильтрации (или, в другом варианте, центрифугированием). Стабильность липосомального рифампицина оценивают по
утечке антибиотика из липосом. Для этого хранящуюся в ампулах суспензию липосомального рифампицина через определенные сроки хранения пропускают через колонку с
сефадексом G-50 и по результатам спектрофотометрии рассчитывают процент связанного
с липосомами антибиотика по отношению к исходному уровню. Содержание в липосомах
продуктов ПОЛ определяют спектрофотометрически при длине волны 532 нм тиобарбитуровым методом.
Сущность предлагаемого способа и граничные значения, указанные в формуле заявки,
иллюстрируются следующими примерами.
Пример 1.
При постоянном мольном соотношении компонентов липосомообразующей смеси
ЯФХ : ХЛ : СтК - 10:0,5:0,2, заявленном в формуле, исследуют зависимость включения
рифампицина в липосомы от суммарной концентрации липидов. Готовят четыре варианта
3
BY 5614 C1
липосом с различной концентрацией суммарных липидов: а) 20; b) 50; с) 75; d) 100 мг на
1,0 мл натрий-фосфатного буфера; DL-α-токоферол вносят из расчета 0,02 мг/мг суммарных липидов. Во все варианты добавляют одинаковое количество рифампицина - 37,5 мг
на 10 мл натрий-фосфатного буфера. Указанные компоненты растворяют в хлороформе и
упаривают на роторном испарителе при температуре 35-40 °С до образования сухой пленки. К полученной пленке добавляют 10 мл 0,1 М натрий-фосфатного буфера, содержащего
0,1 мМ ЭДТА (pH 7,4). Полученную смесь нагревают до 60 °С в течение 5 минут и путем
механического диспергирования на высокоскоростном миксере в течение 10-15 мин получают суспензию мультиламеллярных (МЛЛ) липосом с включенным рифампицином. Суспензию липосомального рифампицина инкубируют в течение 1 часа при 40 °С для стабилизации структуры липосомального "конверта". Невключившийся в липосомы рифампицин отделяют путем гель-фильтрации на колонках с сефадексом G-50. Эффективность инкапсулирования рифампицина, рассчитанная по результатам спектрофотометрии липосомальных препаратов до и после гель-фильтрации, составляет в ряду вариантов: а) 38,2; b)
49,1; с) 53,8; d) 47,8 %, соответственно, от исходно взятого антибиотика. Суспензии полученных липосомальных препаратов лиофилизируют, запаивают в ампулы в атмосфере
азота и используют, спустя различные сроки хранения, для оценки стабильности препарата (по удержанию антибиотика), физических параметров липосом (с помощью световой и
электронной микроскопии) и активности процессов перекисного окисления липидов (по
накоплению малонового диальдегида - МДА).
Анализ результатов данного примера свидетельствует о том, что по мере увеличения
концентрации липидов до 75 мг на 1 мл натрий-фосфатного буфера включение антибиотика в липосомы возрастает и составляет, соответственно, 14,32; 18,41 и 20,20 мг рифампицина на 10 мл суспензии липосом. При увеличении концентрации суммарных липидов
до 100 мг/мл натрий-фосфатного буфера включение рифампицина снижается до 17,93 мг
на 10 мл суспензии.
В прототипе включение составляет 3,37 мг рифампицина на 10 мл суспензии липосом.
Следовательно, заявляемый способ позволяет увеличить эффективность включения антибиотика в 5,5-6,0 раз при использовании суммарной концентрации липидов 50 и 75 мг/мл
натрий-фосфатного буфера. Оценка "утечки" антибиотика из липосом при хранении липосомального рифампицина в течение 6-ти месяцев показывает, что она составляет по вариантам от 8 до 11 %. Содержание малонового диальдегида к концу периода хранения
увеличивается по вариантам на 7-9 %. Размер и состав (удельное содержание типовых по
размеру групп липосом) в процессе хранения препарата заметно не изменяется.
Пример 2.
Способ осуществляют аналогично примеру 1, используя заявленное в формуле соотношение ЯФХ : ХЛ : СтК - 10:0,5:0,2 и DL-α-токоферол в конечной концентрации 0,02 мг/мг
суммарных липидов. При концентрации суммарных липидов 50 мг/мл натрий-фосфатного
буфера в липосомообразующую смесь вносят различные количества рифампицина. Готовят три варианта липосом: а) 37,50; b) 18,75; с)56,25 мг на 10 мл натрий-фосфатного буфера. В указанных вариантах включение антибиотика, соответственно, составляет: 48,3 %;
15,4 % и 28,9 % от исходно внесенного в натрий-фосфатного буфера. Размер липосом по
данным микроскопии, как и в примере 1, практически не изменяется. Содержание продуктов ПОЛ в процессе хранения увеличивается на 5-8 % по отношению к исходному уровню.
Данные, полученные в примере 2, свидетельствуют о том, что включение рифампицина в липосомы имеет выраженную зависимость от содержания антибиотика в липосомообразующей смеси. Наиболее высокая эффективность его использования достигается при
внесении 37,5 мг рифампицина на 10 мл натрий-фосфатного буфера. Уменьшение доли
антибиотика в липосомообразующей смеси в два раза или увеличение в 1,5 раза приводит
к заметному снижению эффективности инкапсулирования рифампицина (в % %). Хотя в
3-ем варианте включение рифампицина оказывается достаточно высоким, однако при
этом неоправданно увеличивается расход липосомообразующих компонентов.
4
BY 5614 C1
Пример 3.
Способ осуществляют аналогично примеру 1, но в состав липосомообразующей смеси
вносят различные количества DL-α-токоферола. Готовят пять вариантов липосомообразующей смеси, различающихся между собой по содержанию антиоксиданта: 1) 0,01; 2)
0,02; 3) 0,03: 4) 0,04 и 5) 0,05 мг антиоксиданта на 1 мг суммарных липидов. В вариантах с
1-го по 5-ый включение рифампицина в липосомы, соответственно, составляет 22,5; 23,1;
32,2; 34,8 и 13,9 % от исходно внесенного в липосомообразующую смесь. Из примера 3
видно, что более высокая эффективность включения антибиотика достигается при введении в реакционную смесь 0,02 - 0,04 мг DL-α-токоферола на 1 мг суммарных липидов.
Уменьшение относительного содержания антиоксиданта до 0,01 мг/мг липидов, т.е. ниже
значения, указанного в формуле изобретения, равно как и увеличение его содержания до
0,05 мг/мг липидов, т.е. выше граничного значения, приводит к снижению эффективности
инкапсулирования рифампицина. Исследование стабильности липосомального рифампицина по "утечке" антибиотика из липосом после различных сроков хранения показывает,
что все варианты липосом за исключением 5-го, содержащего максимальную концентрацию антиоксиданта - 0,05 мг/мг липидов, имеют высокую стабильность по удержанию
рифампицина. За 6 месяцев хранения его выход составляет 6-9 % от исходного уровня.
Содержание МДА за 6 месяцев хранения различных вариантов препарата изменяется неодинаково. При внесении 0,03, 0,04 и 0,05 мг DL-α-токоферола на 1 мг липосомообразующей смеси содержание МДА увеличивается на 4-7 % по отношению к начальному уровню.
В 1 варианте, в который вносят 0, 01 мг DL-α-токоферола на 1 мг липида, т.е. ниже граничного значения, указанного в формуле заявки, содержание МДА увеличивается на 14-15 %.
Результаты примера 3 показывают, что для эффективного подавления процессов ПОЛ
и высокой эффективности инкапсулирования антибиотика в липосомообразующую смесь
следует вносить антиоксидант из расчета 0,02-0,04 мг на 1 мг суммарных липидов.
Таким образом, оптимизация состава липосомообразующей смеси и формирование
липосом с помощью механического диспергирования позволяет: а) в 5,5-6,0 раз увеличить
эффективность инкапсулирования рифампицина; б) исключить аллергенное или токсичное действие вводимых зарядоформирующих компонентов липосом - кардиолипина (аналог) или децитилфосфата (прототип); в) повысить стабильность липосомальной формы
рифампицина введением в липосомообразующую смесь 0,02-0,04 мг DL-α-токоферола на
1 мг суммарных липидов.
В комплексе указанные характеристики заявляемого способа получения липосомального рифампицина приводят к повышению качества новой лекарственной формы.
Источники информации:
1. Wasserman M. A simple technique for entrapping rifampicin and isoniasid into liposomes.
// Tubercle. - 1986. - V. 67. - P. 83-90.
2. Saito H., Tomioka H. Therapeutic efficacy of liposome entrapped rifampici against Mycobacterium avium complex infection induced in mice. // Antimicrob. Ag. Chemother. - 1989.
V. 33, n 4. - P. 429-433 (прототип).
3. Любешкин А.В., Себякин Ю.Л. // Успехи биол.химии. - 1994. - Т. 1. - № 3. - С. 131-165.
4. Саатов Т.С., Исаев Э.И., Бурханов С.А. // Вестник АМН СССР. - 1990. - № 8. - С. 47-49.
5. Ландышев С.Ю. // Пульмонология. - 1993, № 2. С. 66-69.
6. Архипенко И.В., Невзорова В.Н., Гельцер Б.И. // Терапевт. архив. - 1998. - № 3. С. 78-81.
Национальный центр интеллектуальной собственности.
220034, г. Минск, ул. Козлова, 20.
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
0
Размер файла
182 Кб
Теги
5614, патент
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа