close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Патент BY 6679

код для вставкиСкачать
ОПИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ПАТЕНТУ
РЕСПУБЛИКА БЕЛАРУСЬ
7
(51) C 12N 1/20,
(12)
НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР
ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ
СОБСТВЕННОСТИ
(54)
BY (11) 6679
(13) C1
(19)
C 12P 13/06
// (C 12N 1/20,
C 12R 1:15)
ШТАММ БАКТЕРИЙ CORYNEBACTERIUM GLUTAMICUM
АС-L - ПРОДУЦЕНТ L-ЛЕЙЦИНА
(21) Номер заявки: a 20000900
(22) 2000.09.29
(46) 2004.12.30
(71) Заявитель: Государственное научное
учреждение "Институт физико-органической химии Национальной академии наук Беларуси" (BY)
(72) Авторы: Якимович Николай Николаевич (BY); Гринько Вячеслав Николаевич
(BY); Якимович Ирина Васильевна (BY);
Чаевский Сергей Иванович (BY); Музыченко Леонид Афанасьевич (RU);
Гусельникова Татьяна Владимировна
(RU); Солдатов Владимир Сергеевич
(BY); Куваева Зоя Ивановна (BY);
Иванов Юлиан Григорьевич (BY)
(73) Патентообладатель: Государственное
научное учреждение "Институт физико-органической химии Национальной
академии наук Беларуси" (BY)
(57)
Штамм бактерий Corynebacterium glutamicum AC-L КМБУ B 1011 - продуцент Lлейцина.
BY 6679 C1
(56)
US 3668073, 1972.
US 3865690, 1975.
US 3970519, 1976.
US 5763231 A, 1998.
US 5705370 A, 1998.
RU 2059726 C1, 1996.
Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается нового
штамма бактерий - продуцента незаменимой аминокислоты L-лейцина, которую используют в фармацевтической промышленности, медицине, в качестве добавки в пищевые
продукты и в корма животным, а также в качестве компонента питательных сред при выращивании определенных видов микроорганизмов.
Известны ауксотрофные мутанты и прототрофы, устойчивые к аналогам лейцина, которые способны накапливать в ферментационной среде до 11-16 г/л лейцина [1-3].
Наиболее высокий уровень биосинтеза лейцина (34,0 г/л) обеспечивает штамм Brevibacterium lactofermentum - аналогорезистентный и ауксотрофный по изолейцину и метионину [4]. Для достижения высоких показателей биосинтеза лейцина штамм Brevibacterium
lactofermentum нуждается в дорогостоящем источнике углеродного питания - глюкозе.
При замене глюкозы на мелассу активность продуцента снижается до 15,8 г/л лейцина [5].
BY 6679 C1
Недостатком штамма Brevibacterium lactofermentum является то, что при использовании в составе питательной среды относительно дешевого источника углеродного питания,
- мелассы, вместо глюкозы, биосинтетическая активность продуцента значительно снижается. Кроме этого, продуценту необходимо присутствие в питательной среде дефицитных
аминокислот - изолейцина и метионина.
Наиболее близким к изобретению является штамм-продуцент L-лейцина Corynebacterium sp. ВНИИ генетика - 127 [6], который способен накапливать в ферментационной среде 23,7 г/л лейцина при использовании питательных сред, содержащих мелассу. Для роста
и максимального накопления лейцина штамм нуждается в тиамине и биотине. Необходимо отметить, что уровень накопления лейцина в ферментационной среде данным продуцентом недостаточно высокий.
Задачей изобретения является создание нового штамма бактерий, продуцирующего Lлейцина в высоких концентрациях независимо от присутствия в составе питательных сред
сложного по химическому составу источника углеродного питания - мелассы, или простого химически чистого источника углерода, например сахарозы (сахара-песка).
Для получения нового штамма использовали продуцент L-лизина Corynebacterium glutamicum Т-3 (Т-3), ауксотрофный по гомосерину или треонину и метионину. На первом
этапе от исходного штамма Т-3 были отобраны спонтанные мутанты устойчивые к S-(2аминоэтил)-L-цистеину (AEC) в концентрации 2 мг/мл. Отобранные колонии выращивали
в мясопептонном бульоне, в логарифмической фазе роста отмывали от среды ацетатным
буфером, ресуспендировали в том же буфере, содержащим 500 мкг/мл N-метил-N-нитроN-нитрозогуанидина и инкубировали 15 мин при 37 °С в водяной бане. Мутагенизированную культуру дважды отмывали ацетатным буфером и высевали на чашки с минимальной
средой состава, (г/л): глюкоза - 20,0; аммоний сернокислый - 10,0; калий фосфорнокислый
однозамещенный - 1,0; мочевина - 2,5; магний сернокислый семиводный - 0,05; марганец
сернокислый четырехводный - 0,01 мг; железо сернокислое семиводное - 0,01 мг; биотин 0,1 мг; тиамин - 0,4 мг; агар-агар - 20; вода дистиллированная - остальное; рН - 7,0-7,2.
В минимальную среду добавляли аналог лейцина D,L - 4 гидроксилейцин (ГOKJI) в
концентрации 4 мг/мл.
Через трое суток отбирали полученные колонии и проверяли на лейцинпродуцирующую способность ферментацией с использованием питательных сред, содержащих в качестве источников углеводов мелассу или сахар-песок. Ферментации проводили в колбах
Эрленмейера объемом 750 см3, в которые вносили по 15 см3 питательных сред. Скорость
вращения качалки 250 об/мин, температура 31±1,0 °С, время ферментации 72-96 ч. Посевной материал вносили в колбы в виде суспензии клеток, выращенных на косяках с МПА в
течение 24 ч при 31±1,0 °С. Содержание лейцина в культуральной жидкости определяли с
помощью тонкослойной хроматографии с последующим окрашиванием нингидрином,
элюированием и определением интенсивности окрашивания на фотоэлектроколориметре.
Отобранный таким образом мутант АС-71 в указанных условиях синтезировал в ферментационную среду при биосинтезе на питательной среде, содержащей мелассу 18,2 г/л
лейцина, и на среде с сахаром-песком - 13,6 г/л лейцина.
Далее для повышения лейцинпродуцирующей активности мутант Corynebacterium glutamicum AC-71 был обработан ультрафиолетовыми лучами по следующей схеме. Культуру продуцента в логарифмической фазе роста отмывали от среды центрифугированием и
ресуспендированием в физиологическом растворе. Суспензию клеток разливали по 2 мл в
чашки Петри диаметром 5 см и облучали под лампой УФ-ПРК-4. Интенсивность облучения 60 Дж/м2. Выживаемость составляла порядка 3 %.
Облученную культуру центрифугировали, ресуспендировали в мясопептонном бульоне
и инкубировали в течение 8 ч на качалке. Далее культуру вновь отмывали от бульона
физиологическим раствором, соответствующие разведения культуры высевали на чашки с
мясопептонным агаром и выращивали в течение трех суток при температуре 31±1,0 °С.
2
BY 6679 C1
Полученные колонии проверяли на приобретение признака АЕЦ- и ГОКЛ-устойчивости.
После проверки отобранных колоний на способность к накоплению лейцина был выделен
штамм Corynebacterium glutamicum AC- L.
Проведено депонирование полученного штамма в коллекции культур микроорганизмов Белорусского государственного университета. Штамм депонирован под порядковым
номером В 1011.
Штамм Corynebacterium glutamicum AC-L КМБУ В 1011 имеет следующие характеристики:
Культурально-морфологические признаки:
Клетки овальные, размером 0,5-1,0 мкм, спор не образуют, неподвижные, грамположительные.
При росте на мясопептонном бульоне штамм образует равномерную интенсивную
суспензию без формирования видимого осадка и пленки на поверхности жидкости.
Через 3-5 суток роста при 30 °С на мясопептонном агаре и на минимальной агаризованной среде, содержащей биотин и тиамин, колонии диаметром 0,5-1,5 мм, светлокремовые, поверхность гладкая, форма выпуклая, край ровный.
Физиолого-биохимические признаки.
Отношение к источникам углерода.
Использует глюкозу, мальтозу, сахарозу, фруктозу.
Отношение к источникам азота. Использует аммонийный азот, мочевину, аминокислоты. Для роста нуждается в биотине, тиамине, устойчив к АЕЦ и ГОКЛ.
Рост возможен в диапазоне 5-35 °С, оптимум - 29-31 °С. Оптимум рН для роста 6,8-7,2.
Штамм хранится в столбиках полужидкого мясопептонного агара под слоем вазелинового масла в течение 4-6 месяцев или в лиофильно высушенных ампулах в течение 1 года.
Получение лейцина с использованием штамма Corynebacterium glutamicum AC-L
КМБУ В 1011 осуществляют следующим образом.
Пример 1.
Культурой штамма Corynebacterium glutamicum AC-L засевают пробирки со скошенным мясопептонным агаром и выращивают в термостате при 30 °С в течение 24 ч. Затем
культуру смывают стерильным физиологическим раствором и засевают колбы объемом
750 см3, содержащие 50 см3 посевной среды. Состав посевной среды, (г/л): сахар-песок - 50,0;
кукурузный экстракт - 60,0; сернокислый аммоний - 15,0; мел - 15,0; вода водопроводная
питьевая - остальное, рН среды до стерилизации 7,5-7,7. Колбы устанавливают на круговую качалку (250 об/мин) и инкубируют в течение 20-24 ч при температуре 31±1,0 °С.
Выращенный посевной материал в количестве 200 см3 вносят в лабораторный ферментер
вместимостью 5,0 дм3, содержащий 1,8 дм3 ферментационной среды следующего состава,
(г/л): сахар-песок - 130,0; кукурузный экстракт - 18,0; сернокислый аммоний - 15,0; калий
фосфорнокислый однозамещенный - 1,5; сернокислый магний семиводный - 0,5; дестиобиотин - 200 мкг; тиамин - 600 мкг; рH - 7,2.
Ферментацию проводят при перемешивании и аэрации ферментационной среды воздухом, температуре 31±1,0 °С, рН 7,2-7,4. Пеногаситель (пропинол Б-400) задают в ферментатор по мере вспенивания среды, рН поддерживают автоматически, подавая по сигналу
датчика рН 25 %-ный раствор аммиака. С помощью датчика замеряют содержание кислорода воздуха в ферментационной среде в % от насыщения и поддерживают его значение
на уровне 15-20 % путем регулирования оборотов мешалки и количеством воздуха, подаваемого на аэрацию.
В процессе ферментации при остаточном содержании редуцирующих веществ в ферментационной среде в пределах 1,5-3,0 % в ферментатор с помощью перистальтического
насоса непрерывно подают питательную среду следующего состава, (г/л): сахар-песок 600,0; кукурузный экстракт - 25,0; сернокислый магний семиводный - 2,0; калий фосфорнокислый двухзамещенный - 6,5; тиамин - 400 мкг; дестиобиотин - 150 мкг; рН - 7,6.
3
BY 6679 C1
Питательную среду подают со скоростью, обеспечивающей содержание редуцирующих веществ в ферментационной среде на уровне 0,8-1,5 %. Через 60-65 ч биосинтеза концентрация L-лейцина достигает 34,5 г/л.
Пример 2.
Выращивание посевного материала и процесс биосинтеза лейцина проводят аналогично примеру 1 при следующих составах начальной и подпиточной питательных сред.
Состав начальной питательной среды, (г/л): сахар-песок - 130,0; сернокислый аммоний 15,0; калий фосфорнокислый однозамещенный - 1,5; сернокислый магний семиводный 0,2; дестиобиотин - 0,4 мг; тиамин - 0,8 мг; рН - 7,2.
Состав подпиточной среды, (г/л): сахар-песок - 600,0; дестиобиотин - 1,5 мг; тиамин 1,5 мг; вода водопроводная питьевая - остальное; рН - естественный. Через 55-60 ч биосинтеза концентрация лейцина составляет 35,0 г/л.
Пример 3.
Выращивание посевного материала проводят аналогично примеру 1 при использовании посевной среды следующего состава, (г/л): меласса - 100; кукурузный экстракт - 40;
сернокислый аммоний - 15; мел -15; рН после стерилизации - 7,2.
Процесс биосинтеза лейцина проводят аналогично примеру 1 при следующем составе
питательной среды, (г/л): меласса - 225,0; сернокислый аммоний - 25,0; калий фосфорнокислый однозамещенный - 2,0; сернокислый магний семиводный - 1,0; дестиобиотин 200 мкг; тиамин - 600 мкг; рН после стерилизации - 7,2.
Состав подпиточной питательной среды, (г/л): меласса - 700; дестиобиотин - 200 мкг;
тиамин - 600 мкг; рН после стерилизации - 7,4. Через 60-65 ч ферментации концентрация
лейцина составляет 33,5 г/л.
Штамм Corynebacterium glutamicum AC-L КМБУ В 1011 по сравнению со штаммом
Corynebacterium sp. ВНИИ генетика - 127 имеет более высокий уровень активности при
использовании питательных сред, содержащих мелассу (в среднем на 30 %). Вместе с тем
новый штамм способен продуцировать L-лейцин в высоких концентрациях и на питательных средах, содержащих чистые углеводы, например сахарозу (сахар-песок).
Источники информации:
1. Патент США 3668073, МПК С 12Р 13/06, 1972.
2. Патент США 3865690, МПК С 12Р 13/06, 1975.
3. Жданова Н.И., Козырева Л.Ф., Леонова Т.В. Биологические науки. - 1979. - № 4. С. 80-86.
4. Патент США 3970519, МПК С 12Р 13/06, 1976.
5. Патент США 3959075, 195-29, 1976.
6. Патент РФ 2059726, МПК6 С 12P 13/06, С 12N 1/20, 1996.
Национальный центр интеллектуальной собственности.
220034, г. Минск, ул. Козлова, 20.
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
0
Размер файла
177 Кб
Теги
6679, патент
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа