close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Патент BY 2959

код для вставкиСкачать
ОПИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ПАТЕНТУ
РЕСПУБЛИКА БЕЛАРУСЬ
(19)
BY (11) 2959
(13)
C1
6
(51)
(12)
A 61K 39/04
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ПАТЕНТНЫЙ
КОМИТЕТ РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ
(54)
СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ ФАКТОРА VIII ИЗ ДРУГИХ БЕЛКОВ
В ПЛАЗМЕ КРОВИ
(21) Номер заявки: 766
(22) 1993.08.04
(86) PCT/DK90/00279, 1990.11.05
(31) 5621/89
(32) 1989.11.09
(33) DK
(46) 1999.09.30
(71) Заявитель: Ново Нордиск А/С (DK)
(72) Автор: Пер Каэрсгаард (DK)
(73) Патентообладатель: Ново Нордиск А/С (DK)
BY 2959 C1
(57)
1. Способ выделения фактора VIII из других белков в плазме крови, заключающийся в том, что фактор
VIII добавляют в колонку, содержащую гель-фильтрующую среду, элюируют с помощью буферного раствора и
затем очищают, отличающийся тем, что при выделении фактора VIII из больших объемов плазмы, плазму или
оттаявшую свежезамороженную плазму, возможно предварительно обработанную в течение такого периода
времени, чтобы не оказать значительного влияния на содержание фактора VIII данной плазмы, подвергают
непосредственно гель-фильтрации в условиях группового разделения, при которой объем добавленной плазмы
Фиг. 1
составляет по меньшей мере 5 % от объема слоя и скорость потока составляет по меньшей мере 0,15 объема слоя
в час, затем фактор VIII элюируют, используя буферный раствор при скорости потока по меньшей мере 0,3
объема слоя в час, при этом среда для гель-фильтрации состоит из частиц, инертных относительно фактора VIII и
имеющих диапазон фракционирования в интервале от 1.103 - 1.108, затем фракцию, содержащую фактор VIII,
BY 2959 C1
элюированный в одном общем пике в свободном объеме, причем коагулирующая активность определена
коагуляционным или хромогенным анализом, собирают.
2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что среда для гель-фильтрации состоит из материала геля,
имеющего диапазон фракционирования в интервале от 1.104 - 8.107.
3. Способ по п. 2, отличающийся тем, что среда для гель-фильтрации состоит из материала геля,
имеющего диапазон фракционирования в интервале от 5.104 - 4.107.
4. Способ по одному из пп. 1-3, отличающийся тем, что объем добавленной плазмы составляет 15-40 %
от объема слоя.
5. Способ по одному из пп. 1-4, отличающийся тем, что скорость потока составляет 0,5-20 объема слоя в
час.
6. Способ по одному из пп. 1-5, отличающийся тем, что для получения стабильного препарата
полученный фактор VIII затем подвергают очистке способом, аналогичным обычной очистке повторно
растворенного криопреципитата, например, хроматографической очисткой и лиофилизацией с
использованием обычных наполнителей.
(56)
Патент США 4675385, МКИ A 61K 37/547, 35/14, 1987.
Изобретение относится к способу выделения биологических соединений, таких, как сложные белки, в
частности коагулирующего фактора VIII из жидких содержимых организма, таких, как плазма крови, с
использованием гель-фильтрации на первой стадии выделения.
Фактор VIII, также известный в качестве интигемофильного фактора А или AHF, представляет собой
белок плазмы крови, который принимает участие в процессе коагуляции крови. Фактор VIII циркулирует в
плазме крови в исключительно низкой концентрации в виде нековалентного комплекса из двух протеинов,
имеющий активность коагулянта (фактор VIII:C) и активность кофактора ристоцетина (фактор ВанВиллебранда (vWF), соответственно, упомянутого комплекса, имеющего мол.м. порядка 1-20 х 106 D.
У лиц, страдающих от нарушения кровотечения - гомофилин А фактор VIII:C отсутствует или нарушен,
он поражает примерно 5 из 100000 людей.
Фактор Виллебранда связывается с активированными тромбоцитами таким образом, что агрегация
активированных тромбоцитов усиливается. Этот эффект может детектироваться вне организма агрегацией
индуцированных ристоцетином тромбоцитов. Наряду с болезнью Виллебранда, пролонгированное время
кровотечения наблюдается у пациентов из-за отсутствия или пониженного уровня биологической
активности фактора Виллебранда.
Лечение больных, страдающих от гемофилии А, и пациентов, страдающих от тяжелых случаев
заболевания болезнью Виллебранда, в настоящее время проводится концентратами, содержащими фактор
VII:C/vWF. Это лечение значительно повышает жизнеспособность и трудоспособность и способствует
увеличению продолжительности жизни этих пациентов.
Фармацевтические препараты, содержащие в себе фактор VIII (фактор VIII:C и/или vWF), могут
получаться из крови или плазмы крови. Производство таких препаратов может осуществляться различными
известными способами, которые характеризуются низким выходом особенно фактора VIII:C. Общим почти
для всех является стадия первоначальной очистки, включающая криопреципитацию. Посредством
криопреципитации замороженная плазма оттаивает при температуре 0-4 °С, что способствует повышению
выхода преципитата, содержащего фактор VIII, который может собираться, например, центрифугированием.
Даже если криопреципитация проводится относительно простым способом, она имеет существенный
недостаток, так как при использовании в большом объеме, т.е. пулов плазмы крови, содержащих более 5 кг, дает
низкий выход фактора VIII:C (30-45 % от содержания плазмы). Это означает, что выход конечного продукта
является низким независимо от того, какие стадии очистки будут использоваться в дальнейшем.
Далее, стадия инактивации вируса включается в производство препаратов, содержащих фактор VIII.
Приемы инактивации вирусов в значительной степени повышают безопасность препаратов относительно
вирусов, однако в большинстве случаев служат причиной дальнейшего понижения выхода фактора VIII:C.
Очень низкий общий выход фактора VIII привел к нехватке этих препаратов, и поэтому существует
необходимость в разработке новых способов очистки фактора VIII с высоким выходом в соответствии с
требованиями в факторе VIII или лечения больных гемофилией.
Новые способы выделения фактора VIII непосредственно из плазмы крови с высоким выходом могли бы
представлять большой интерес, поскольку вплоть до 70 % содержимого фактора VIII в плазме крови
теряется при криопреципитации или в процессе таковой.
Была сделана попытка выделить фактор VIII непосредственно из плазмы крови, пользуясь афинной
хроматографией (Thromb. Haemost. 61 (2), 234-237, 1989), однако выход составил менее 60 % и удельная
активность - порядка 1 иммунизирующей единицы фактора VIII/мг протеина фракции выделенного фактора VIII.
Гель-фильтрация, также называемая гель-проникающей хроматографией или хроматографией
2
BY 2959 C1
исключения размера, представляет собой процесс с управляемой диффузией, который используется для
сепарации растворенных веществ в соответствии с размером частиц. Растворенные вещества пропускаются
через аппарат колонного типа, заполненный в качестве насадочного материала инертными частицами
пористого геля, размер пор которого исключает прохождение самых крупных молекул, между тем как менее
крупные молекулы диффундируют в стационарную фазу внутри частиц геля. Таким образом, самые
крупные молекулы, будучи полностью исключенными из частиц геля, подвергаются элюции вначале
«свободным объемом», между тем как менее крупные молекулы тратят более продолжительное время,
проходя через аппарат колонного типа, и элюируют в соответствии с уменьшением размера при увеличении
«объемов элюирования».
Гель-фильтрация может осуществляться двумя различными способами.
1. Способ группового разделения.
В способе группового разделения растворенные вещества (сорбаты) разделяются на две группы,
имеющие большое различие размеров молекул, причем одна группа элюируется в свободном объеме, а
другая группа элюируется позже в гораздо большем «объеме элюирования», часто близком к общему
«объему слоя». Этот способ используется в основном для разделения белков и растворенных солей или для
обмена буферного вещества и называется «обессоливанием». Для «обессоливания» используются жесткие
гели, имеющие малый размер пор. Этот процесс может осуществляться с использованием больших
количеств материала (объем, составляющий 20-30 % от объема слоя) и с использованием высокой скорости
потока (примерно один объем буферного вещества в час). Таким образом, производительность аппарата
колонного типа достаточно велика.
2. Способ фракционирования.
Этим способом разделяются растворенные вещества, имеющие одинаковую молекулярную массу. Этот
способ часто используется для разделения белков. Для этой цели используются частицы геля, имеющие
большие поры, и выбирается такая гелевая фильтрующая среда, которая гарантирует элюирование белков
между свободным объемом и объемом элюирования, соответствующим общему объему слоя. Эти вещества
элюируются более строго, чем при групповом разделении и возможном перекрывании одного другим.
Кроме того, высокие скорости потока являются нежелательными, так как это не позволяет эффективно
отделять белки. Нагрузка аппарата колонного типа должна поддерживаться низкой для разделения
различных белков. Таким образом, гель-фильтрация, используемая в способе фракционирования, может
применяться только для сепарации белков в качестве последнего этапа, где объем фракционирования мал.
Уже делались попытки выделить фактор VIII из плазмы крови способом гель-фильтрации (J. Lab. Clin.
Med., 7236, 1968, 1007-1008 и J. Clin. Invest. 48, 1969, 957-962). Высокая степень очистки была достигнута во
время экспериментов, однако выход составил лишь около 40-50 %. Было установлено, что чистота
полученной фракции, содержащей фактор VIII, зависит от исходной плазмы, так как большое содержание
липидов и хилемикрон способствовало образованию мутной фракции фактора VIII, имевшей пониженную
специфическую активность. Применявшаяся техника гель-фильтрации не позволяла производить обработку
больших количеств плазмы, даже если предварительные эксперименты показывали, что гель-фильтрация
гораздо более концентрированной первой фракции Кона казалась возможной.
Кроме того, было ранее установлено, что фактор VIII мог бы выделяться из других белков плазмы крови
при использовании гeлевой среды - Сефарозы 6В. Однако хроматография с применением гель-фильтрации
казалась возможной только в больших объемах, когда повторно растворенный криопреципитат
использовался в качестве исходного материала.
Был раскрыт процесс для разделения компонентов крови, использующий гель-фильтрацию и
использующий пористые стеклянные шарики. Этот процесс специально предназначается для разделения
иммунологически активных материалов от других компонентов в иммунной сыворотке или плазме крови.
После этого предпринималось несколько попыток использовать гель-фильтрацию для очистки фактора
VIII, однако эти попытки сосредотачивались на гель-фильтрации частично очищенных фракций плазмы
крови (повторно растворенного криопреципитата и далее его очищенных фракций). Все исследования
проводились при использовании либо малых нагрузок аппарата колонного типа, либо малых скоростей
потоков, или комбинаций таковых.
Гель-фильтрация в качестве способа фракционирования белков была известна с 1959 года и широко
используется в биохимических исследовательских лабораториях для характеристики белков и для очистки
белков с малым объемом проб, например менее 1 л. Гель-фильтрация вплоть до предлагаемого способа не
использовалась в большом масштабе для фракционирования плазмы крови при разделении белков.
Единственным применением являлось обессоливание этанола и солей из альбуминных растворов. Таким
образом, как утверждалось ранее, основной причиной, почему гель-фильтрация не стала главным способом
для фракционирования плазмы крови, является низкий выход белка на объем аппарата колонного типа. К
сожалению, массы белков, которые могут обрабатываться, ограничены размерами аппаратов колонного
типа, при этом нельзя пренебрегать разведением пробы. Поэтому способ не используется широко для
фракционирования плазмы крови.
Известен процесс выделения прокоагулянта белка фактора VIII из препарата плазмы крови, содержащего
фактор VIII - компоненты с большой молекулярной массой и компоненты с малой молекулярной массой,
3
BY 2959 C1
последовательной высокоразрешающей хроматографией по размеру молекул путем приготовления, на
первой стадии, буферного водного раствора препарата плазмы крови и отделения компонентов с низким
молекулярным весом, посредством введения композиции в хроматографическую колонну
высокоразрешающей жидкостной хроматографии, заполненную пористыми шариками, имеющими размер
от около 13 мк до около 35 мк, и элюирования буферным водным элюентом. Для хорошего разделения в
данном случае предлагается использование колонок, имеющих отношение высоты к ширине не ниже, чем
между 10 и 40, что снижает пропускную способность, но не гарантирует хорошее отделение фактора VIII от
белков плазмы крови с низкой молекулярной массой. Однако первое отделение не гарантирует хорошего
разделения белков, показывающих активность фактора VIII:C, от других белковых компонентов препарата
плазмы крови, которая получается только проведением второй жидкостной хроматографии высокого
давления (ЖХВД).
Таким образом, вплоть до настоящего времени считалось, что гель-фильтрация является неприемлемым
способом для разделения белков при фракционировании плазмы крови, когда обрабатываются более
крупные объемы, например более 5 л.
Неожиданно было установлено, что выбирая материалы для гель-фильтрации, которые были разработаны для
высоких скоростей потока, представляется возможным выделить фактор VIII в виде чистой фракции с высоким
выходом непосредственно из плазмы крови посредством очень мягкого механического разделения, не принимая
в расчет первоначальную криопреципитацию.
Изобретение относится к способу выделения фактора VIII в виде комплекса фактор VIII:C и vWF из
других белков плазмы крови с использованием гель-фильтрации.
Способ, согласно изобретению, заключается в том, что выделенная плазма или размороженная
свежезамороженная плазма крови подвергается групповому разделению способом гель-фильтрации при
использовании большой нагрузки и высокой скорости потока, причем среда для гель-фильтрации состоит из
частиц, которые являются инертными относительно фактора VIII и имеют диапазон фракционирования в
интервале от 1 х 103 до 1 х 108 и более предпочтительно от 1 х 104 до 8 х 107. Диапазон фракционирования
может, например, находиться в интервале от 5 х 104 до 4 х 107.
В предпочтительном варианте осуществления изобретения объем добавленной плазмы крови составляет
по меньшей мере 5 % от объема слоя. Количество добавленной плазмы крови предпочтительно составляет
15-40 % от объема слоя.
Способ, согласно изобретению, осуществляется при скорости потока, равном по меньшей мере 0,3
объема слоя в час, более предпочтительно - 0,5-2 объемов слоя в час.
В изобретении используется среда для гель-фильтрации, имеющая такую жесткость, которая дает
быстрое элюирование. Более того, гель обязательно должен быть химически иммунологически инертным
относительно фактора VIII при проведении гель-фильтрации. Эксперименты показали, что способ, согласно
изобретению, может осуществляться при использовании таких гелей, как Сефароза CL-4B, Сефароза CL-6B,
Сефароза 4FF, Сефароза 6FF, Сефакрил S-400, Сефакрил S-500, Фрактогель TSK MW 65(F) и Матрекс
Целлюфин CGL2000, причем все эти гели пригодны для использования в изобретении. Подобные гели
имеют размер частиц (смоченных), находящийся в интервале от около 32 мк до около 200 мк.
Согласно одному из вариантов осуществления предлагаемого способа, замороженная плазма крови
оттаивается, при этом гарантируется, что весь фактор VIII растворяется, после чего размороженная плазма
подается в аппарат колонного типа сразу после полного растворения фактора VIII. Предпочтительно, чтобы
температура не поднималась слишком высоко во избежание слишком экстенсивного разложения фактора
VIII. Перед подачей в колонну плазма крови может быть предварительно обработана, например, гепарином,
цитратом, сахарозой, аминокислотой, солями или другими стабилизаторами и выборочно отфильтрована,
центрифугирована, концентрирована посредством ультрафильтрации, подвергнута предварительному
осаждению с использованием обычных предварительно осаждающих агентов или предварительно
обработана другим образом, но так, чтобы предварительная обработка не оказывала значительного влияния
на содержание фактора VIII плазмы крови.
Предлагаемый способ неожиданно обнаружил высокий выход фактора VIII. Обычно более 70 % фактора
VIII плазмы крови восстанавливается в конечном продукте, и этот способ позволяет получать очень чистые
препараты, имеющие удельную активность от 1 до примерно 4 иммунизирующих единиц фактора VIII:С/мг
белка. В некоторой степени это можно объяснить тем, что при использовании предлагаемого способа
фактор VIII также отделяется от протеолитических ферментов, которые обычно могут служить причиной
разложения фактора VIII:C в процессе выделения.
Предлагаемый способ позволяет обрабатывать большие количества плазмы крови при условии, что
плазма поступает на гель-фильтрацию при использовании больших нагрузок и высоких скоростей потока, в
результате получают высокую степень восстановления фактора VIII при высокой степени чистоты. Таким
образом, предлагается очень эффективный способ, имеющий промышленную применимость.
Фракция (фракции), содержащая фактор VIII после гель-фильтрации, или объединенные фракции после
многих гель-фильтраций затем могут концентрироваться и далее очищаться с использованием известных в
технике способов, таких, как ультрафильтрация, преципитация, ионный обмен, аффинная хроматография и
т.п.
4
BY 2959 C1
Оставшиеся белки плазмы крови, такие, как альбумин, иммуноглобулины, протромбиновый комплекс,
антитромбин III и другие, также могут быть выделены из более поздних фракций гель-фильтрации при
использовании известных способов, таких, как преципитация спиртом, преципитация полиэтиленгликолем,
хроматография и т.п.
Определение активности фактора VIII:C может осуществляться либо при использовании двухстадийного
анализа, либо одностадийного анализа. Установлено, что одностадийный и двухстадийный анализы могут
давать различные показатели активности фактора VIII:C в дроби. Более того, известно, что повторное
определение при использовании одинакового анализа на одинаковой пробе могут давать в результате вариации
в определении активности фактора VIII:C.
В данном описании используется выражение «плазма», что означает кровь, из которой удалены все
форменные элементы и тромбоциты, например, посредством центрифугирования. Фактор "VIII:Ag" означает
связанный с фактором VIII антиген, и "vWF-Ag" обозначает связанный с фактором Ван-Виллебранда
антиген.
«Объем слоя» определяется как объем уплотненной среды, содержащей гель, и межстеночной жидкости.
«Свободный объем» определяется как объем буферного раствора между частицами геля, а «объем
элюирования» представляет собой объем буферного раствора, используемого для элюирования
специфического материала. Выражение «нагрузка аппарата колонного типа» используется, чтобы
обозначать объем материала, добавленного к слою, подсчитанного как процент от объема слоя. Выражение
«диапазон фракционирования» обозначает диапазон молекулярных масс (глобулярных) белков или более
крупных молекул, для которых материал геля используется в качестве носителя.
На фиг. 1 показан график, иллюстрирующий элюирование фактора VIII посредством гель-фильтрации,
согласно изобретению, определенное в разных опытах; на фиг. 2 - порядок элюирования различных белков
плазмы крови посредством гель-фильтрации согласно изобретению.
Пример 1. Гель-фильтрация плазмы для выделения фактора VIII.
Аппарат колонного типа с диаметром колонки 2,6 см заполнялся Сефарозой С-4В в качестве насадочного
материала на высоту 60 см.
Замороженная плазма из датского банка крови оттаивалась до температуры 25 °С на водяной бане. После
добавления 1 иммунирующей единицы гепарина/мл 50 мл (16 % от объема слоя) плазмы направлялось в
аппарат колонного типа со скоростью потока 100 мл/ч, после чего аппарат колонного типа элюировался с
использованием усиленного потока буферного раствора со скоростью 200 мл/ч, соответствующего 0,63
объема слоя в час. Приведение в равновесие аппарата колонного типа и элюирование проводились с
использованием буферного раствора, 0,02 М цитрата, 0,13 М NaCl с рН 7,4. Затем к буферному раствору
добавлялось 2,55 мл 1 М CaCl2 на литр, в результате концентрация свободных ионов кальция (Са2+)
составляла примерно 7 х 10-5 М. Концентрация свободных ионов кальция проверялась с использованием
селективного электрода кальция фирмы Ingel ГмбХ (Франкфурт на Майне, ФРГ). Фракции собирались и для
каждой фракции определялись OD280 (OD - оптическая плотность), фактор VIII:С (с использованием как
одностадийного коагуляционного анализа, так и двухстадийного хромогенного анализа), фактор VIII:Ag,
альбумин, иммуноглобулин G, фабриноген, иммуноглобулин М, альфа-2-макроглобулин, фактор IX, фактор
X, протеин С и антитромбрин III. При измерении посредством OD280 белок элюировался при небольшом
пике в свободном объеме (фракции 10-1В), который сопровождается большим пиком с широкой вершиной
(фракция 19-60, cf на фиг. 1). Фактор VIII:C активностью 82 %, как было определено двухстадийным
анализом, и фактор VIII:C активностью 91 %, как было определено одностадийным коагуляционным
анализом, элюировались в одном общем пике в свободном объеме (основная фракция фактора VIII)
совместно с самым ранним малым пиком белка. Остаток фактора VIII элюировался в небольшом
последующем «хвосте» пика непосредственно за основной фракцией фактора VIII (фракция 19-26). Фактор
VIII:Аg и vWF:Ag элюировались вместе с фактором VIII:C в пике, имеющем до некоторой степени более
широкие последующие «хвосты». Все другие определяемые белки плазмы крови элюировались во фракции
после основной фракции фактора VIII - с большим широким пиком протеина (см. фиг. 2). Белки плазмы
крови отделялись от фактора VIII:C и имели следующие молекулярные массы:
антитромбин III
65,000 D
белок С
62,000 D
фактор X
59,000 D
фактор IX
57,000 D
альфа-2-макроглобулин
718,000 D
иммуноглобулин M
900,000 D
фибриноген
340,000 D
иммуноглобулин
150,000 D
альбумин
67,000 D.
Определение активности фактора VIII:C с использованием двухстадийного хромогенного анализа
проводилось с использованием способа хромогенного субстрата (КАВI coatest фактор VIII).
Первоначальный способ, в котором используют тестируемые пробирки при 37 °С, модифицировали, чтобы
проводить способ с использованием плашек или микротитрования с пониженным использованием
5
BY 2959 C1
реагентов. Использовали 50-микролитровую или стандартную пробу, которую после смешивания с 75 мкл
раствора фосфолипида, фактора IXа, фактора Х и CaCl2, инкубировали при температуре 37 °С в течение 15
мин, после чего добавлялось 50 мкл субстрата. После дальнейшей инкубации при 37 °С в течение 20 мин эта
реакция гасилась путем добавления 50 мкл 1 М лимонной кислоты. Проявление цвета считывалось при 405
нм, в то время как опорное считывание - при 492 нм.
Определение активности фактора VIII:C при использовании одностадийного анализа проводилось с
использованием АРТТ-способа (Activated Partlal Thromboplastin Time - время образования частично
активированного тромбопластина). Согласно этому способу, 100-микролитровая проба (или стандарт)
отмеривалась пипеткой в кюветы, после чего туда добавлялась 100-микролитровая проба недостающей плазмы
(недостающая плазма фактора VIII, общая диагностика) и этот раствор выдерживался в термостате при 37 °С в
течение 5 мин. Затем добавлялось 100 мкл 0,03 М CaCl2 и определялось время до наступления коагуляции
этого раствора.
Для количественных определений получают калибровочные кривые, описанные на серии разведений
внутреннего стандарта, который градуируется по стандарту Всемирной организации здравоохранения (3-й
Внутренний стандарт фактора VIII, плазмы крови человека, 3,9 иммунизирующей единицы/мл). Описанный
двухстадийный анализ имеет пониженный (примерно в 10 раз) предел детектирования по сравнению с
одностадийным анализом. При добавлении гепарина лучше использовать двухстадийный анализ, так как
любое возможное влияние гепарина на анализ может быть устранено разбавлением.
Фактор VIII:Ag определялся способом ферментного иммуносорбентного анализа, использующего
антитела от пациента ингибитора фактора VIII в качестве покрывающего материала на плашках или
микротитрования (Nunc, Kamstrup, 4000 Roskllde, Denmark) и использующего фрагменты пероксилазы,
маркированной F(AB2’) от того же самого пациента ингибитора для определения связанного фактора VIII
(Thromb. Haemost., 53 (3), 1985, 346-350). Стандартные кривые получались с использованием смешанной
нормальной плазмы, градуированной по стандарту ВОЗ (1S+ IRP. 1982).
Фактор vWT:Ag также определялся при использовании ферментного иммуносорбентного анализа
(ELISA), но с использованием кроличьего, противопоказанного для человека, фактора Ван-Виллебранда
(фирма «ДАКО», Дания) в качестве покрывающего материала и пероксилазу, маркированную – кроличий,
противопоказанный для человека, фактор Ван-Виллебранда - (фирма «ДАКО», Дания), для определения
связанного фактора Ван-Виллебранда (vWF). Получались стандартные кривые при использовании
одинаковой нормальной плазмы, как и для ферментного иммуносорбентного анализа для определения
фактора VIII:Ag.
Фактор IX определялся при использовании одностадийного коагуляционного анализа аналогично тому,
как определялся фактор VIII:C, только, пользуясь недостающей плазмой фактора IX. Иммуноглобулин G
определялся при использовании радиальной иммунодиффузии (Immunochemistry, 2. 1965, 235-254), при этом
альбумин, фибриноген, альфа-2-макроглобулин, фактор X, белок С и антитромбин III определялись,
пользуясь «ракетным» иммуноэлектрофорезом (Anal. Blochem, 15, 1966, с. 45-52).
OD280 определялась с использованием спектрофотометра (Spectronic 601 фирмы Milton Roy Company), а
белок, содержащий фактор Кджелдаля, определялся (согласно Ph. Eur. 2-е издание, 1, Y. 3,5,2) без
преципитации трикарбоновой (трихлоруксусной) кислотой. Удельная активность очищенных фракций
вычислялась в виде отношения концентрации фактора VIII:C либо к OD280, либо к концентрации белка,
который определен, пользуясь фактором Кджелдаля. При использовании OD280 для вычисления удельной
активности результаты различных экспериментов не могут сравниваться непосредственно, если только не
используется одинаковая исходная плазма, так как фракция, заключающая в себе фактор VIII, часто является
мутной.
Различные среды для гель-фильтрации, применявшиеся в этих экспериментах, находились из следующих
далее источников. Сефароза CL-6B, сефароза CL-4B, сефароза CL-2B, сефароза 6FF, сефароза 4FF, сефакрил
S-400 и сефакрил S-500 были получены из фармацевтического предприятия (Hillerd, Denmark), биогель A5m-сверхтонкий материал был получен от фирмы «БиоРад» (Bie and Bernten Rdovu, Denmark), фрактогель
TSK HW-65 был получен от фирмы «Мерк» (Struers, Rdovre, Denmark) и целлюфин «Матракс» GCL 2000
был получен от фирмы «Амикон» (Helsingborg, Sweden).
Пример 2. Гель-фильтрация плазмы, чтобы выделить фактор VIII, пользуясь различными средами для
гель-фильтрации.
Аппарат колонного типа, имеющий диаметр колонки 2,6 см, заполнялся различными средами для гельфильтрации, имеющими различный диапазон фракционирования и различную структуру. Во всех случаях
окончательная высота уплотненного слоя составляла 60 см. Плазма крови оттаивалась, как описано в
примере 1, и добавлялась 1 иммунизирующая единица гепарина на 1 мл. Для каждой среды при проведении
гель-фильтрации колонка нагружалась 50 мл плазмы (16 % объема слоя). Загрузка аппарата колонного типа
буферным раствором проводилась так, как описано в примере 1. Во всех случаях скорость потока была
одинаковой, как констатировалось в примере 1, за исключением опыта, в котором применялся биогель A5m, в этом опыте скорость потока понижалась до 50 мл/ч благодаря повышенному противодавлению.
Фракции накапливались и для каждой фракции определялись, пользуясь «Коатестом», OD280 и фактор
VIII:C. Удельная активность основной фракции фактора VIII вычислялась в виде отношения фактора
6
BY 2959 C1
VIII:С/мл к OD280. Эксперименты повторялись n раз, для каждой нагрузки использовались различные
плазмы и вычислялись средние значения выхода и удельной активности. Основная фракция фактора VIII
выбиралась одинаковым методом, как описано в примере 1, и выход определялся по содержанию фактора
VIII:C в основной фракции фактора VIII в процентном содержании фактора VIII:C добавленной плазмы.
Диапазон фракционирования и размер частиц различных сред и вычисленные средние значения
приводятся в табл. 1.
Пример 3. Гель-фильтрация плазмы для выделения фактора VIII с использованием различных нагрузок
аппарата колонного типа.
Аппарат колонного типа с диаметром колонки 2,6 см заполнялся в качестве посадочного материала
сефарозой 4FF до высоты 60 см. Плазма крови оттаивалась, как это описано в примере 1. После
размораживания рН плазмы доводилось до 7,0, для чего использовалась 0,5 М НСl, добавлялась 1
иммунизирующая единица гепарина и плазма фильтровалась через 10-микронный нейлоновый фильтр. В
аппарат колонного типа вводилось 30 мл, 40 мл, 50 мл, 60 мл и 70 мл плазмы, соответственно. Все операции и
элюирование проводились с использованием буферного раствора, как это описано в примере 1, хотя рН
буферного раствора доводилось до 7,0. Фракции собирались и для каждой фракции определялись OD280 и
фактор VIII:C, пользуясь «Коатестом». Удельная активность основной фракции фактора VIII вычислялась в
виде отношения фактора VIII:С/мл к OD280. Эти эксперименты повторялись три раза, используя три
различных плазмы крови для каждой нагрузки, и вычислялись средние значения (X). Объем основной
фракции фактора VIII (мл) представляет объем фракции, заключающей в себе фактор VIII, которая может
накапливаться перед большим широким пиком белка (OD280), затем элюируется и отделяется тем же
способом, как описано в примере 1. Выход представляет содержание фактора VIII:C в основной фракции
фактора VIII в виде процентного содержания фактора VIII:C добавленной плазмы.
Вычисленные показатели приведены в табл. 2.
Пример 4. Гель-фильтрация плазмы для выделения фактора VIII при использовании различных
скоростей элюирования.
В указанный аппарат колонного типа, аналогичный тому, который использовался в примере 3, добавлялось
50 мл плазмы, размороженной как описано выше. После размораживания рН плазмы доводилось до 7,0 при
использовании 0,5 М НС1, затем добавлялась 1 иммунизирующая единица гепарина/мл и плазма
фильтровалась через 10-микронный нейлоновый фильтр. Используя три различные части плазмы, проверялись
три скорости потока 100, 200 и 300 мл/ч, соответственно. Во время добавления плазмы и последующего
элюирования использовался одинаковый поток. Элюирование проводилось при использовании одного и того
же буферного раствора, который описан в примере 3. Фракции собирались и для каждой фракции
определялись OD280 и фактор VIII:C. Удельная активность и выход в основной фракции фактора VIII
рассчитывались так, как указано в примере 3. Вычислялись средние значения (X) объема основной фракции
фактора VIII, выхода к удельной активности. Эти результаты приведены в табл. 3.
Пример 5. Гель-фильтрация плазмы для выделения фактора VIII при различных нагрузках аппарата
колонного типа.
Аппарат колонного типа, имеющий диаметр колонки 2,6 см, заполнялся Сефарозой 4FF до высоты столба
60 см. Замороженная плазма из Датского банка крови оттаивалась при 30 °С в водной бане. 925 г, 1497 г и 2000
г, соответственно, подавались в аппарат колонного типа. Во время добавления и элюирования плазмы поток
подавался в количестве примерно 42000 мл/ч, пользуясь шланговым насосом модели «Мастерфлакс» (Buch &
Holm, Herlev, Denmark), что соответствует примерно 0,89 объема слоя в час. Для элюирования использовался
одинаковый буферный раствор, описанный в примере 1. Осуществлялся непрерывный контроль OD280,
использовался фармацевтический монитор модели UV-1. Когда OD280 начинала повышаться в свободном
объеме, начиналось накопление основной фракции фактора VIII, и оно заканчивалось тогда, когда OD280
показывала, что начинает элюироваться большой пик белка. В основной фракции фактора VIII, пользуясь
одностадийным коагуляционным анализом, определялись составляющие фракции фактора VIII:C, а белок
определялся методом Кижелдаля. Удельная активность вычислялась в виде отношения общего числа единиц
фактора VIII:C в основной фракции фактора VIII к общему числу миллиграммов белка в основной фракции
фактора VIII. Выход фактора VIII:C вычислялся в процентах как содержание фактора VIII:C в основной
фракции фактора VIII по отношению к содержанию фактора VIII:C в добавленной плазме.
Результаты приводятся ниже в табл. 4.
Пример 6. Гель-фильтрация плазмы или выделения фактора VIII в промышленном аппарате колонного
типа.
Аппарат колонного типа, имеющий диаметр колонны 29 см, заполнялся Сефарозой 4FF. После выхода на
режим при использовании буферного раствора, описанного в примере 1, высота столба геля составляла 53
см. 10 кг замороженной плазмы из Датского банка крови оттаивалось и нагревалось до 30 °С, после чего она
добавлялась в аппарат колонного типа. Это добавленное количество составляло 28,8 % от объема слоя. Во
время добавления и элюирования плазма поступала в количестве 30 л/ч, соответствующем 0,86 объемов
слоя в час, при этом использовался уравновешивающий буферный раствор. Величина OD280
контролировалась непрерывно при помощи фармацевтического монитора модели UV-1. Во время первой
индикации скачка OD280 в свободном объеме осуществлялось накопление основной фракции фактора VIII.
7
BY 2959 C1
Всего было собрано 11,73 кг основной фракции фактора VIII. Затем определялось содержание фактора
VIII:C посредством одностадийного коагуляционного анализа, а белок определялся по методу Кджелкаля. В
основной фракции фактора VIII было обнаружено всего 8798 иммунизирующих единиц фактора VIII:C и
менее чем 2346 мг белка, что составило выход фактора VIII:C порядка 880 иммунизирующих единиц на
килограмм плазмы, соответствующий 88 % выходу продукта, имеющего удельную активность более чем 3,75
иммунизирующих единиц на миллиграмм протеина.
Основная фракция фактора VIII, полученная в соответствии с предлагаемым способом, может затем
подвергаться очистке известковым способом для получения стабильного препарата. Например, очищают
повторно растворенный криопреципитат путем хроматографической очистки и лиофилизации с
использованием обычного наполнителя. Препарат повторно составляется с использованием подходящего
традиционного наполнителя.
Таблица 1
Среда для гельфильтрации
А
В
С
D
Е
F
G
Н
1
J
Диапазон
фракционирования, Mw
1 х 104 - 4 х 106
6 x 104 - 2 x 107
7 x 105 - 4 x 107
1 x 104 - 4 x 106
6 x 104 - 2 x 107
6 x 104 - 8 x 107
1 x 104 - 5 x 106
5 x 104 - 5 x 106
1 x 104 - 3 x 106
1 x 104 - 8 x 106
Номер
Выход,
эксперимента, n
%
3
95
4
82
3
68
3
96
3
86
3
91
1
71
2
84
2
92
3
101
Удельная
активность
0,16
0,88
0,24
0,71
1,35
0,28
0,12
0,18
0,18
0,75
Диаметр частиц
смоченных, мкм
40-165
40-165
60-200
40-165
40-165
40-105
40-80
32-63
45-105
40-105
А: Сефароза CL-6B; В: Сефароза CL-4В; С: Сефароза CL-2В;
D: Сефароза 6FF; Е: Сефароза 4FF; F: Сефакрил S-500;
G: Биогель А-5m сверхтонкий;
Н: Фрактогель TSK HW-65 (F);
I: Целлюфин «Матрекс» GCL 2000;
J: Сефакрил S-400.
Таблица 2
мл
30
40
50
60
70
Добавленное количество плазмы
% от объема слоя
номер порции
1
9,4
2
3
X
1
12,6
2
3
X
1
15,7
2
3
X
1
18,8
2
3
X
1
22,0
2
3
X
Основная фракция
фактора VIII, мл
70
70
70
70
70
70
70
70
80
80
80
80
80
80
80
83
80
100
100
93
8
Выход, %
86
95
90
91
76
85
98
85
91
90
85
89
79
85
95
86
85
90
93
89
Удельная
активность
0,81
0,18
0,63
0,54
0,68
0,17
0,61
0,49
0,57
0,20
0,53
0,43
0,81
0,16
0,61
0,53
0,82
0,21
0,53
0,52
BY 2959 C1
Таблица 3
мл/ч
Поток
объем слоя, в час
100
0,31
200
0,63
300
0,93
Номер порции
плазмы
1
2
3
X
1
2
3
X
1
2
3
X
Добавленное количество плазмы
г
% от объема слоя
925
19,6
1497
31,8
2000
42,4
Основная фракция
фактора VIII, мл
80
80
80
80
80
80
80
80
70
80
80
77
Основная фракция
фактора VIII, г
1192
1860
2200
Фиг. 2
Государственный патентный комитет Республики Беларусь.
220072, г. Минск, проспект Ф. Скорины, 66.
9
Выход, %
89
88
80
86
84
88
89
87
85
96
83
88
Выход, %
74
73
81
Удельная
активность
0,75
0,17
0,65
0,52
0,99
0,18
0,79
0,65
0,72
0,18
0,44
0,45
Таблица 4
Удельная
активность, ИЕ/мг
2,50
2,24
1,08
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
0
Размер файла
245 Кб
Теги
2959, патент
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа