close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Патент BY 4448

код для вставкиСкачать
ОПИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ПАТЕНТУ
РЕСПУБЛИКА БЕЛАРУСЬ
BY (11) 4448
(13)
C1
(51)
(12)
НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР
ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ
СОБСТВЕННОСТИ
(54)
(19)
7
C 12P 21/08,
C 12N 5/20,
C 07K 16/28 //
(C 12P 21/08,
C 12R 1:91)
МОНОКЛОНАЛЬНОЕ АНТИТЕЛО, РЕАГИРУЮЩЕЕ НА
ПОВЕРХНОСТНЫЕ АНТИГЕНЫ СТРОМАЛЬНЫХ КЛЕТОК, И
ПРОДУЦИРУЮЩАЯ ЕГО ЛИНИЯ КЛЕТОК ГИБРИДОМЫ
(21) Номер заявки: 960568
(22) 1996.03.01
(86) PCT/JP 94/01452, 1994.09.02
(31) 5/242109
(32) 1993.09.03
(33) JP
(46) 2002.06.30
(71) Заявитель: ЧУГАЙ
СЕЙЯКУ
КАБУСИКИ
КАЙСЯ (JP)
(72) Авторы: ФУКУШИМА, Наоши (JP)
(73) Патентообладатель: ЧУГАЙ
СЕЙЯКУ
КАБУСИКИ КАЙСЯ (JP)
(57)
1. Моноклональное антитело, ингибирующее хоминг гематопоэтических стволовых клеток и распознающее поверхностные антигены стромальных клеток селезенки, полученное с использованием клеток селезенки млекопитающего, которому вводили rG-CSF.
2. Моноклональное антитело по п. 1, отличающееся тем, что относится к классу IgG.
3. Линия клеток гибридомы, продуцирующая моноклональное антитело по п. 1.
(56)
US 4626507 A, 1986.
US 4361549 A, 1982.
US 4892828 A, 1990.
Фиг. 1
BY 4448 C1
Настоящее изобретение относится к новым моноклональным антителам, которые обладают способностью ингибировать хоминг гематопоэтических стволовых клеток и распознавать стромальные клетки селезенки, которые, в свою очередь, могут поддерживать хоминг гематопоэтических стволовых клеток, кроме
того, изобретение относится также к гибридоме, продуцирующей моноклональные антитела.
Поскольку моноклональные антитела по настоящему изобретению могут распознавать вещество, важное
для осуществления хоминга клеток костного мозга на гематопоэтической ткани в качестве антигена, и обладают свойством ингибировать хоминг гематопоэтических стволовых клеток, то они могут рассматриваться
как перспективный лекарственный препарат, позволяющий повысить эффективность действия антиракового
средства, в частности, за счет усиления действия антиракового средства для лечения лейкоза посредством
высвобождения миелоидных лейкозных клеток из костного мозга.
Гранулоцитарные колониестимулирующие факторы, такие, например, как рекомбинантные гранулоцитарные колониестимулирующие факторы rG-CSF, были известны вначале как гуморальные факторы, стимулирующие дифференциацию и пролиферацию гранулоцитарных клеток, при этом в экспериментах на мышах
in vivo было показано, что введение rG-CSF стимулирует гематопоэз в костном мозге и, кроме того, вызывает выраженный экстрамедуллярный гематопоэз, осуществляемый в селезенке при пролиферации гематопоэтических стволовых клеток и всех клеток-предшественников, имеющихся в процессе кроветворения в селезенке. Считается при этом, что механизм гематопоэза в селезенке, будучи экстрамедуллярным по своей
природе, осуществляется благодаря модификациям в микросреде в процессе кроветворения в селезенке, которые возникают в связи со стимулирующим действием rG-CSF, повышающим гематопоэтический потенциал.
Исходя из этого, авторы настоящего изобретения пометили стромальные клетки селезенки, в которые
был введен rG-CSF, с целью выяснения уровня гематопоэтического потенциала в селезенке, далее выделили
гематопоэтическую клеточную линию стромы (CF-1 клетки) из селезенки мышей, которым был введен rGCSF, для исследования повышения гематопоэтического потенциала под воздействием стромальных клеток,
содержащих введенный rG-CSF, исследовали потенциальное влияние применения гематопоэтических стромальных клеток на гематопоэз и в результате определили колониестимулирующую активность in vitro, а
также способность поддерживать гематопоэтические стволовые клетки in vivo (Blood, 80, 1914, 1992).
Поскольку поддерживающая способность гематопоэтических стволовых клеток in vivo проявляется в том
случае, когда CF-1 клетки трансплантируют вместе с клетками костного мозга на трансплантанте костного
мозга, то было сделано предположение, что вышеупомянутая гематопоэтическая стромальная клеточная линия (CF-1 клетки) экспрессирует указанную функцию в виде фактора клеточной адгезии, позволяющего гематопоэтическим стволовым клеткам осуществлять хоминг на гематопоэтической ткани.
Однако, несмотря на то, что на основе ряда стромальных клеток селезенки, обладающих способностью
поддерживать хоминг гематопоэтических стволовых клеток, удалось получить стабильные клеточные линии
(CF-1 клетки) и определить их цитологические характеристики, до сих пор еще не были получены специфические антитела, распознающие поверхностные антигены этих клеток, как неизвестны до настоящего времени и их характеристики.
В связи с этим, на основе приведенной выше информации о стромальных клетках селезенки и результатов исследований, авторы настоящего изобретения провели скрупулезное исследование с целью выделения
специфических антител, способных распознавать стромальные клетки селезенки, обладающие способностью
поддерживать хоминга гематопоэтических стволовых клеток и вывели линию стромальных клеток селезенки,
обладающих способностью поддерживать хоминга гематопоэтических стволовых клеток, и получения препарата моноклональных антител с использованием линии стромальных клеток селезенки в качестве антигенов для
иммунизации; в результате было получено новое, ранее не описанное моноклональное антитело.
Кроме того, авторы настоящего изобретения установили, что упомянутое антитело обладает способностью
распознавать поверхностный антиген стромальной клетки селезенки, поддерживающей хоминг гематопоэтических стволовых клеток, а также ингибировать хоминг гематопоэтических стволовых клеток, что завершило исследования относительно настоящего изобретения.
Задачей настоящего изобретения является создание новых моноклональных антител, распознающих поверхностные антигены стромальных клеток селезенки, которые обладают способностью поддерживать хоминг гематопоэтических стволовых клеток, а также обладающие способностью ингибировать хоминг гематопоэтических стволовых клеток. Кроме того, другой задачей настоящего изобретения является получение
гибридомы, способной продуцировать данное моноклональное антитело.
Моноклональное антитело по настоящему изобретению является новым моноклональным антителом к
поверхностному антигену стромальных клеток селезенки, обладающих способностью поддерживать хоминг
гематопоэтических стволовых клеток, кроме того, упомянутое антитело обладает свойством распознавать
стромальную клетку селезенки, что связано с повышением гематопоэтического потенциала селезенки, при
этом упомянутое антитело является чрезвычайно полезным для его применения в качестве вещества, способного ингибировать хоминг гематопоэтических стволовых клеток. При этом под хомингом гематопоэтических стволовых клеток понимается процесс, при котором под влиянием стромальных клеток гематопоэти2
BY 4448 C1
ческой ткани происходит адгезия гематопоэтических стволовых клеток, при этом клетки дифференцируются
и пролиферируют в виде КОЕ-С (колониеобразующих единиц в селезенке, CFU-S) колоний.
В общих чертах, моноклональное антитело по настоящему изобретению может быть получено в соответствии с описанной ниже процедуре.
А именно: моноклональное антитело по настоящему изобретению может быть получено, например, с использованием в качестве антигена стромальных клеток селезенки, взятых от животных, которым вводили rGCSF, в частности, CF-1 клеток (стромальных клеток селезенки), выделенных авторами настоящего изобретения в виде клеточной линии, с последующей их иммунизацией по традиционно принятой методике, затем
проводят слияние иммунизированных клеток, согласно стандартной процедуры слияния, и после этого клонируют слитые клетки с использованием стандартной техники клонирования.
В качестве предпочтительного способа получения моноклональных антител по настоящему изобретению
может быть служить способ, включающий использование в качестве антигена CF-1 клеток, представляющих
собой стромальные клетки селезенки животного, которому вводят rG-CSF, и которые выведенных авторами
настоящего изобретения в качестве культуральной клеточной линии (Blood, 80, 1914, 1992), слияние плазматических клеток (иммуноцитов) млекопитающего, иммунизированного антигеном, с миеломными клетками
млекопитающего, в частности мыши, клонирование полученных слитых клеток (гибридом), селекцию клонов, продуцирующих антитело настоящего изобретения, которое способно распознавать указанную клеточную линию среди других, и культивирование их с получением целевого антитела.
Однако указанный способ приведен лишь в качестве одного из возможных примеров, так что в данном
случае для получения целевых антител на основе того же способа, что и в случае CF-1 клеток, могут быть
использованы не только вышеупомянутые CF-1 клетки, но также другие стромальные клетки гематопоэтической ткани, полученные по способу, аналогичному примененному в случае CF-1 клеток, или стромальные
клетки гематопоэтической ткани, полученные из клеток селезенки человека.
В соответствии со способом получения таких моноклональных антител использование тех или иных млекопитающих, которые могут быть иммунизированы вышеупомянутым антигеном, особо не ограничено, однако предпочтительно осуществлять отбор с учетом точки зрения пригодности миеломных клеток для процедуры слияния клеток, при этом предпочтительным является использование клеток мышей, крыс и
хомяков.
Иммунизацию осуществляют обычным путем, например посредством введения с помощью инъекции
стромальных клеток селезенки, таких как вышеупомянутые CF-1 клетки, в брюшную полость млекопитающего. В частности, предпочтительно вводить их животному при разбавлении или суспендировании в соответствующем количестве фосфатно-буферного раствора (ФБР) или изотонического раствора хлорида натрия
несколько раз в месяц. Предпочтительно, кроме того, использовать в качестве иммуноцитов клетки селезенки, отобранные по завершению последнего введения вышеупомянутых клеток.
В качестве миеломной клетки млекопитающих, как другой родительской клетки, сливаемой с вышеупомянутыми иммуноцитами, можно использовать ряд известных клеточных линий, которые включают
P3(P3X63Ag8.653) [J.Immunol., 123, 1548 (1978)], P3-U1 [Current Topics in Micro-biology and Immunology, 81,
1-7 (1978)], NS-1 [Eur. J. Immunol., 6, 511-519 (1976)], MPC-11 [Cell, 8, 405-415 (1976)], Sp2/0-Ag14 [Nature,
276, 269-270 (1978)], FO [J. Immunol. Meth., 35, 1-21 (1980)], S194 [J. Exp. Med., 148, 313-323 (1978)] и R210
[Nature, 277, 131-133(1979)].
Слияние клеток при использовании вышеупомянутого иммуноцита и миеломной клетки может быть произведено в основных чертах с помощью одного из традиционных способов, например по методу Milstein и
др. (Methods Enzymol., 73, 3-46, 1981).
Более подробно, вышеупомянутое слияние клеток может быть выполнено, например, в простой питательной среде в присутствии вещества, ускоряющего слияние. В качестве такого ускоряющего слияние клеток агента может быть использован полиэтиленгликоль (ПЭГ) и вирус Sendai (HVJ), а кроме того, если требуется усилить эффективность слияния, применяется добавление адъювантов, таких как диметилсульфоксид.
Что касается соотношения иммуноцитов и миеломных клеток, то предпочтительно использование первого из
них в 1-10-кратном количестве относительно второго компонента смеси для слияния клеток. В качестве
примеров среды, применимой для осуществления вышеупомянутой процедуры слияния, можно привести
среду RPMI-1640 и MEM среду (минимальную незаменимую среду), которые хорошо подходят для осуществления пролиферации упомянутых миеломных клеток, а также ряд других сред, традиционно используемых
для культивирования такого рода клеток, которые, кроме того, могут содержать дополнительно сыворотку, в
частности фетальную телячью сыворотку (ФТС).
Клеточное слияние выполняют при смешивании описанных выше количеств вышеупомянутых иммуноцитов и миеломных клеток в вышеупомянутой среде, при добавлении в среду, обычно в концентрации 3060 % (вес/объем), раствора ПЭГ, предварительно нагретого до температуры около 37 °С, например такого
ПЭГ, который имеет средний молекулярный вес в диапазоне от 1000 до 6000, с последующим перемешиванием. Затем последовательно, при повторении процедур добавления соответствующих сред друг за другом,
3
BY 4448 C1
центрифугировании реакционной смеси и удалении супернатантов могут быть получены целевые гибридомы.
Упомянутые гибридомы подвергают селекции при культивировании на обычной селективной среде, в частности на ГАТ среде (среде, содержащей гипоксантин, аминоптерин и тимидин). Культуру выдерживают на
ГАТ среде в течение периода времени, достаточного для того, чтобы клетки, отличные от гибридом (неслитые клетки), погибли, обычно этот процесс занимает от нескольких дней до нескольких недель. Затем с применением обычного метода ограниченных разведений проводят скрининг и клонирование гибридом.
Полученные гибридомы, способные к продуцированию моноклональных антител по настоящему изобретению, могут быть далее подвергнуты субкультивированию, после чего они могут храниться в жидком азоте
в течение длительного времени.
Для целей получения моноклональных антител по настоящему изобретению от гибридом может быть
применен способ, включающий культивирование гибридом по обычной методике с получением их из супернатантов, или метод, включающий введение гибридомы с целью ее пролиферации в организм подходящего
млекопитающего с получением их из асцита. Первый способ применяется для получения антител высокой
чистоты, тогда как второй - для целей массовой продукции антител.
Кроме того, антитела, получаемые вышеописанными способами, могут быть очищены до высокой степени чистоты с помощью традиционных способов очистки, таких как техника высаливания, гель-фильтрация и
аффинная хроматография.
Поскольку моноклональное антитело по настоящему изобретению обладает способностью ингибировать
хоминг гематопоэтических стволовых клеток, то они могут найти применение в качестве лекарственного
препарата, усиливающего действие антиракового средства при лечении лейкоза; в частности, в связи с упомянутой функцией, из костного мозга происходит высвобождение миелоидных лейкозных клеток, что сказывается на повышении эффективности действия антиракового препарата при лечении лейкоза.
Нет необходимости говорить о том, что создание на основе моноклональных антител настоящего изобретения специфичной системы для использования в медицине на основе ее свойства усиливать действие лекарственного средства при лечении лейкоза, а также все виды модификации и применения такой системы включены в рамки настоящего изобретения, в той мере, в какой все они практически применимы с
использованием способа, очевидного для каждого специалиста, обладающего средним уровнем знаний в
данной области.
Ниже приведено детальное описание настоящего изобретения со ссылками на фиг. 1-8.
На фиг. 1 приведены результаты иммунофлюоресцентного анализа (контроль в отсутствие антитела, CF-1
клетка).
На фиг. 2 приведены результаты исследования способности к связыванию GSPST-1 антитела с CF-1 клетками на основе иммунофлюоресцентного анализа.
На фиг. 3 приведены результаты исследования способности к связыванию HMS-1 антитела с CF-1 клетками на основе иммунофлюоресцентного анализа.
На фиг. 4 приведены результаты иммунофлюоресцентного анализа (контроль в отсутствие антитела,
клетка костного мозга).
На фиг. 5 приведены результаты исследования способности к связыванию GSPST-1 антитела с клетками
костного мозга на основе иммунофлюоресцентного анализа.
На фиг. 6 приведены результаты исследования способности к связыванию HMS-1 антитела с клетками
костного мозга на основе иммунофлюоресцентного анализа.
На фиг. 7 показан метод количественного определения моноклональных антител (GSPST-1), ингибирующих трансплантацию костного мозга.
На фиг. 8 показан метод количественного определения моноклональных антител (HMS-1), ингибирующих трансплантацию костного мозга.
Создание линии стромальных клеток селезенки и ее характеристика.
1. Создание линии стромальных клеток селезенки.
Линию стромальных клеток селезенки, обладающих способностью поддерживать гематопоэтические
стволовые клетки, создают на основе первичной культуры клеток селезенки мыши C57BL/6J, которой вводили rG-CSF в дозе 100 мкг/кг в течение 5 дней.
Процедура заключалась в следующем: после завершения введения rG-CSF в асептических условиях из животного удаляют селезенку, культивируют ее в инкубаторе при температуре 37 °С в условиях 5 % содержания
CO2 в течение 6 недель в пластиковой колбе с площадью основания 25 см2 (Corning Co.), используя среду Dulbecco
в модификации Isocove (IMDM) (Boehringer-Mannheim Co.), в которую внесены инактивированная нагреванием
10 % фетальная телячья сыворотка ФТС (F BS) (Sanko Junyaku, Tokyo), 100 Ед/мл пенициллина и 100 мкг/мл
стрептомицина, при этом указанную среду заменяют свежей ростовой средой два раза в неделю.
В конфлюентной культуре популяции слипшихся клеток (стромальных клеток) отбирают из колбы с применением ФБР, не содержащего Са и Mg, в который внесены 0,05 % трипсина и 0,02 % EDTA (Sigma Chemical Со.)), и переносят в новые колбы. Такую процедуру повторяют один или два раза в неделю. Сначала
4
BY 4448 C1
(первые десять раз) коэффициент расщепления клеток составляет от 1/4 до 1/8, впоследствии он снижается
до величин в диапазоне от 1/16 до 1/32. Приблизительно после 10-го переноса стромальные клетки становятся гомогенными и фибробластоидными.
К 20-му разу проведения вышеуказанной процедуры стромальные клетки отбирают указанным выше способом и направляют на клеточное клонирование с использованием техники ограниченных разведений; клеточное клонирование повторяют дважды с установлением линии стромальных клеток (клеточная линия CF1).
Далее эти клетки поддерживают в колбе с площадью основания 25 см2 (Корнинг Ко.) в 5 мл среды IMDM
с добавлением 10 % инактивированной нагреванием ФТС и проводят субкультивирование каждые пять дней
при коэффициенте расщепления 1/32. Линии стромальных клеток селезенки могут быть созданы не только
на основе мыши, но и из других животных; так, например, с использованием вышеописанного способа могут
быть получены стромальные клеточные линии человека посредством трансформации клеток аденовирусным
вектором SV-40 (J.Cell. Physiol., 148, 245, 1991).
2. Характеристика CF-1 клеток CF-1.
Клетки, установленные описанным выше способом в виде стабильной клеточной линии, исследовали с
применением стандартной цитохимической технологии на содержание щелочной фосфатазы, кислой фосфатазы, β-глюкуронидазы, α-нафтил-ацетат-эстеразы и масла красного О. При изучении CF-1 клеток методами
иммуноферментной гистохимии использовали следующие моноклональные и поликлональные антитела:
macI (Sero Tec.); антиген, связанный с фактором VIII (Dacopatts); коллаген типа I, коллаген типа III и фибронектин (Chemicon International Inc.). Фагоцитоз исследовали по поглощению латексных гранул (размер частиц 1,09 мкм; Сигма), а способность CF-1 клеток превращаться в адипоциты определяли при воздействии
гидрокортизона фосфата (Sigma) в дозе 10-6 моль/л в течение 4 недель на конфлюентную культуру, находящуюся в колбе с площадью основания 25 см2.
В результате проведенных исследований было показано, что CF-1 клетки не содержат щелочной фосфотазы, антигена, связанного с фактором VIII, mac I, кроме того, при исследовании фагоцитоза были получены
отрицательные результаты, тогда как положительные данные были показаны при тестировании их на наличие коллагена типа I, коллагена типа III и фибронектина. CF-1 клетки не показывали трансформации в адипоциты в течение 4 недель в конфлюентной культуре при наличии гидрокортизона в дозе 10-6 моль/л, хотя
CF-1 клетки содержат, как было показано, следы липида. На основании этих результатов был сделан вывод о
том, что CF-1 клетки не обладают свойствами преадипоцитов, макрофагов и эндотелиальных клеток, и в этой связи
очевидно их происхождение от других клеток, а именно от стромальных клеток.
3. Поддержание гематопоэтических стволовых клеток клетками CF-1
Для того чтобы определить, способны ли CF-1 клетки поддерживать рост гематопоэтических стволовых
клеток, с помощью техники Тилля и Макаллоха (Till and McCulloch) было проведено тестирование на образование КОЕ-С (тест на колониеобразующую способность селезеночных клеток). В ходе тестирования группу из 10 мышей облучали дозой в 900 cGy (MBR-1520R; Hitachi, Tokyo), после чего животным инъецировали
внутривенно моноядерные клетки костного мозга (ВМ клетки) (1,0х105/организм, 5,0х104/организм или 2,5х
104/организм) и CF-1 клетки (1,0х105/организм), а на 12-й день в селезенке подсчитывали количество образовавшихся колоний в виде КОЕ-С клонов (селезеночные колонии).
Было показано, что при трансплантации в организм облученных мышей моноядерных клеток костного
мозга (ВМ клеток) и CF-1 клеток количество колоний каждой группы ВМ клеток значительно возрастает (от
1,4 до 1,8 раз) в сравнении с мышами, которым не вводили CF-1 клетки, при этом происходит также снижение уровня смертности, поскольку на 12-й день после трансплантации коэффициент выживания мышей с
трансплантированными ВМ клетками и CF-1 клетками был выше, чем в случае мышей, несущих в качестве
трансплантированных только ВМ клетки; эти результаты демонстрируют очевидную способность CF-1 клеток поддерживать рост гематопоэтических стволовых клеток.
Оптимальным вариантом осуществления настоящего изобретения является следующий пример.
Получение моноклональных антител.
1. Антигены и иммунизация.
Иммунизацию проводят с применением в качестве антигенов CF-1 клеток, полученных по вышеприведенной стандартной процедуре. Клетки культивируют в инкубаторе при температуре 37 °С и содержании
5 % CO2 в среде Дульбекко в модификации Искова (IMDM среде) (Boehringer - Mannheim Co.), содержащей
10 % фетальную телячью сыворотку (ФТС; Sanko Junyaku).
Клетки обработали 1 мМ ЭДТА/ФБР и с помощью пипетки отобрали из культуральной колбы. Затем
клетки суспендировали в 1 мМ ЭДТА/ФБР до концентрации клеток примерно 1x107/мл, после чего полученную суспензию ввели крысам Wistar Imamich (крысы 7-недельного возраста, самки, полученные из Animal
Breeding Research Laboratory). Один мл клеточной суспензии, содержащей около 1107 клеток/мл, инъецировали в брюшную полость крысы в ходе первичной иммунизации, а через месяц ввели еще 1 мл клеточной
суспензии, содержащей примерно 1х107 клеток/мл. Далее с интервалом в один месяц вводили еще несколько
раз 1 мл клеточной суспензии, содержащей приблизительно 1х107 клеток/мл, а затем, после наблюдения ре5
BY 4448 C1
акции между антителом иммунизированной крысы и CF-1 клетками, ввели завершающую дозу иммунизации в
1 мл клеточной суспензии, содержащей около 1х108 клеток/мл. Спустя три дня после введения завершающей
дозы крыс забили и удалили из них селезенки.
2. Слияние клеток.
Селезенку после удаления из организма крысы измельчили, выделенные селезеночные клетки центрифугировали, суспендировали в IMDM среде (Boehringer - Mannheim Со.) и тщательно промыли. С другой стороны, клетки, полученные при культивировании миеломной клеточной линии мышей Sp2/O-Aq14 (Nature,
276, 269-270, 1978) и находящиеся в среде IMDM (Берингер-Маннгейм Ко.) с добавлением 10 % фетальной
телячьей сыворотки (ФТС; Санко Юниаку), также промыли в вышеприведенной IMDM среде, после чего из
них отобрали 1х108 клеток, а из описанных ранее селезеночных клеток отобрали соответственно 2х108 клеток и поместили обе аликвоты в центрифужную пробирку для осуществления по традиционной методике
процесса слияния клеток под влиянием полиэтиленгликоля 4000 (Nagarai Kadaku) (Clin. Exp. Immunol., 42,
458-462, 1980).
Далее полученные слитые клетки распределили по 96-гнездному планшету в IMDM среде, содержащей
20 % ФТС, и культивировали при температуре 37 °С и содержании 5 % CO2. На следующий день их осторожно перенесли на селективную ГАТ среду и продолжили на ней культивирование.
С момента начала культивирования два раза в неделю заменяли супернатанты на свежую ГАТ среду с целью продолжения роста культуры и поддержания пролиферации клеток.
После этого полученные слиянием гибридные клетки клонировали по традиционной методике с использованием способа ограниченных разведений. А именно: в соответствии с указанной традиционной методикой с применением способа ограниченных разведений клонируются только те клоны, которые обладают выраженными способностями к связыванию, при этом отслеживали их связывающую способность с
антигенами, которые соединяются с антителами, находящимися в супернатантах таких гибридных клеток.
3. Скрининг.
Скрининг слитых клеток (гибридом) проводили на основе опосредованной флюоресценции антител с использованием проточной цитометрии.
Скрининг клонов, продуцирующих целевые антитела, осуществляют с помощью CF-1 клеток в качестве
клеток-мишеней. При этом клетки, суспендированные в реакционном буфере (ФБР с добавлением 2 % ФТС
и 0,02 % NaN3), центрифугировали, а осадок вновь суспендировали в 100 мкл культурального супернатанта
от выращивания гибридом (примерно 1х106 клеток/100 мкл) и провели реакцию при температуре 4 °С в течение 1 ч. После этого клетки промыли еще раз вышеописанным буфером, добавили меченное флуоресцином козлиное антитело к IqG крысы (FC) (Кемикон) и инкубировали в течение 1 ч.
По окончании еще одной стадии промывания клетки анализировали методом проточной цитометрии
(FACScan Becton Dickinson).
4. Очистка антител.
После скрининга по приведенному в 3) методу слитые клетки культивировали с использованием обычной
методики, при этом образуемые антитела выделяли из супернатантов с помощью традиционной процедуры и
далее очищали.
В соответствии с этой процедурой гибридомы с высокими титрами антител к антигенам отбирали из ячеек, распределяли в культуре ткани на пластиковой чашке Петри (Corning Co.), культивировали с целью пролиферации при температуре 37 °С и содержании 5 % CO2 и затем очищали по обычной методике для получения моноклональных антител GSPST-1 и HMS-1.
Для выделения GSPST-1 и HMS-1 антител полученные клетки инъецировали в брюшную полость лишенных волосяного покрова ньюд мышей (nude) BALB/cAJc1-nu /мыши самцы, 8-недельного возраста, Nippon
Kurea, а возникший асцит вскрывали через 10-14 дней, высаливали с применением 33 % сульфата аммония и
диализовали против ФБР.
Далее, как было описано в примере, CF-1 клетки использовали в качестве антигенов для проведения иммунизации, однако возможно с применением того же способа получение моноклональных антител в случае
использования других стромальных клеток селезенки, которые включают стромальные клеточные линии гематопоэтической ткани, полученной из стромальных клеток селезенки человека, так что настоящее изобретение не ограничено вышеприведенными моноклональными антителами, но включает также все полученные
таким же способом моноклональные антитела, имеющие такие же характеристики, а также все гибридомы,
продуцирующие моноклональные антитела.
Гибридома, продуцирующая моноклональное антитело HMS-1 по настоящему изобретению, представляет собой новую гибридную клетку, полученную путем слияния селезеночной клетки от крысы Wistar
Imamich и миеломной клетки из клеточной линии мышей Sp2/0-Ag14, которая была депонирована 9 августа
1993 под названием HMS-1 (гибридома из материала крысы и мыши) под депозитным номером FPRM ВР4383 в Национальном Институте Биологических Наук и Технологии Исследования Человека Агентства Промышленной Науки и Технологии в Японии (адрес: 1-3, Хигаши 1-хом, Тсукубаши, Ибараки 305, Япония)
(National Institute of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology in Japan, 16
BY 4448 C1
3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki 305, Japan) международного депозитарного управления, действующего на основе Будапештского Договора по международной классификации депозитов микроорганизмов с целью их патентования.
5. Свойства антител.
(i) Реакционная способность антител.
(Реактивность относительно CF-1 клетки).
Результаты исследования с применением иммунофлюоресцентного анализа реакционной способности
моноклональных антител GSPST-1 и HMS-1 относительно CF-1 клеток показаны на фиг. 1-3. Так, на фиг. 1
приведены данные по изучению контроля в отсутствие антитела, на фиг. 2 представлены результаты исследования способности GSPST-1 к связыванию с CF-1 клетками, а на фиг. 3 - результаты анализа связывающей
способности HMS-1 также с CF-1 клетками. На фиг. 1-3 вертикальные оси показывают относительное количество клеток, тогда как на горизонтальных осях приведены данные по интенсивности флюоресценции.
Как следует из фиг. 1-3, моноклональные антитела GSPST-1 и HMS-1 обладают способностью как к связыванию с CF-1 клетками, так и к распознаванию поверхностных антигенов CF-1 клеток.
(Реактивность относительно клеток костного мозга) Далее на фиг. 4-6 представлены результаты исследования с применением метода проточной цитометрии (ФАКСкан, Бектон, Диккинсон (FACScan, Becton Dickinson)) реакционной способности GSPST-1 и HMS-1 относительно клеток костного мозга. Так, на фиг. 4
приведены данные по изучению контроля в отсутствие антитела, на фиг. 5 представлены результаты исследования способности GSPST-1 к связыванию с клетками костного мозга, а на фиг. 6 - результаты анализа
связывающей способности HMS-1 также с клетками костного мозга. На фиг. 4-6 вертикальные оси показывают относительное количество клеток, тогда как на горизонтальных осях приведены данные по интенсивности флюоресценции.
Как следует из фиг. 4-6, у GSPST-1 полностью отсутствует способность к связыванию с клетками костного мозга, тогда как для HMS-1 характерна способность к связыванию с некоторыми клетками костного мозга.
(ii) Типирование антител. Далее в результате типирования подкласса IgG полученных моноклональных
антител (с использованием набора Моно АБИД-Сп (Зимед) (Mono AbID-Sp, Zymed) и меченного биотином
мышиного антитела к lgG1 крысы (Зимед)) было показано, что GSPST-1 представляет собой IgG2a, а HMS-1
является IgG2b.
(Реактивность относительно клеток костного мозга).
Далее на фиг. 4-6 представлены результаты исследований реакционной способности GSPST-1 и HMS-1
относительно клеток костного мозга, выполненных с применением метода проточной цитометрии (FACScan,
Becton Dickinson). На фиг. 4 приведены данные по изучению контроля в отсутствие антитела, на фиг. 5 представлены результаты исследования способности GSPST-1 к связыванию с клетками костного мозга, а на
фиг. 6 - результаты анализа связывающей способности HMS-1 также с клетками костного мозга. По вертикальным осям фиг. 4-6 отложены относительные количества клеток, тогда как по горизонтальным осям данные по интенсивности флюоресценции.
Как следует из фиг. 4-6, у GSPST-1 вообще не обладает способность к связыванию с клетками костного
мозга, тогда как для HMS-1 характерна способность к связыванию с некоторыми клетками костного мозга.
(ii) Типирование антител
Далее в результате типирования подкласса IgG полученных моноклональных антител (с использованием
набора Mono AbID-Sp, Zymed и меченного биотином мышиного антитела к lgG1 крысы (Zimed)) было показано, что GSPST-1 представляет собой IgG2a, a HMS-1 является IgG2b.
(iii) Способность ингибировать трансплантацию костного мозга
С целью дальнейшего изучения антитела настоящего изобретения были использованы в экспериментах
по ингибированию трансплантации костного мозга. Полученные при этом результаты представлены на
фиг. 7 и 8. Как следует из данных фиг. 7 и 8, HMS-1 демонстрирует эффект ингибирования трансплантации
костного мозга, тогда как для GSPST-1 такое действие несвойственно. Указанные результаты получены при
введении через хвостовые вены мышам C57BL/6J, облученным летальной дозой радиации (900 cGy), клеток
костного мозга в количестве 1,0х105 в расчете на одно животное и моноклональных антител с последующим
подсчетом числа клеточных колоний в селезенке. Вариант "Не обработанные" на фиг. 8 относится к случаю,
при котором клетки костного мозга не вводились в исследуемое животное. В соответствии с этим, поскольку
моноклональное антитело HMS-1 по настоящему изобретению ингибирует трансплантацию костного мозга,
то очевидно, что упомянутое антитело ингибирует также хоминг гематопоэтических стволовых клеток и образование КОЕ-С колоний.
Для специалистов в данной области очевидно, что ингибирующее действие моноклонального антитела в отношении трансплантации костного мозга соответствует тем активностям, которые направлены на ингибирование хоминга гематопоэтических стволовых клеток и образования КОЕ-С колоний. Так, например, имеется сообщение о том, что моноклональное антитело (АСК-2 антитело, входящее в состав С-набора антител),
полученное с использованием в качестве антигена известных в технике мастоцитов, способно, аналогично мо7
BY 4448 C1
ноклональным антителам по настоящему изобретению, ингибировать трансплантацию костного мозга у мышей
(Blood, 78, 1706, 1991). В указанном сообщении, на основании результатов эксперимента по ингибированию
трансплантации костного мозга, был сделан вывод о том, что упомянутое антитело ингибирует хоминг гематопоэтических стволовых клеток и образование КОЕ-С колоний.
Вышеупомянутое известное антитело АСК-2 получают с использованием в качестве антигена мастоцита,
при этом тучная клетка представляет собой дифференцированную пролиферирующую гематопоэтическую
клетку, которая развилась из стволовой гематопоэтической клетки. С другой стороны, использованные в настоящем изобретении стромальные клетки гематопоэтической ткани являются не гематопоэтическими клетками, а клетками, поддерживающими дифференциацию и пролиферацию гематопоэтических клеток, и в этой
связи оба вида клеток существенно отличаются друг от друга.
Далее при введении гибридомы, продуцирующей HMS-1, в брюшную полость бесшерстной мыши было
показано, что упомянутая мышь не погибает от образовавшегося асцита. В этой связи есть основания полагать, что действие HMS-1 по ингибированию трансплантации костного мозга проистекает не благодаря так
называемому апоптозу (это явление называют также саморазрушением клеток, при котором ДНК ядерного
хроматина расщепляется в нуклеосоме (происходит образование так называемой "лэддерпоследовательности"), приводя в итоге к гибели клеток), но имеет отношение к феномену связывания моноклонального антитела с молекулой, необходимой для хоминга гематопоэтической стволовой клетки на гематопоэтической ткани. Исходя из этого, очевидно, что антиген, распознаваемый HMS-1, представляет собой
вещество, важное для осуществления хоминга гематопоэтических стволовых клеток на гематопоэтической
ткани.
Как было обнаружено в описанном выше эксперименте, моноклональное тело HMS-1 по настоящему
изобретению распознает поверхностный антиген стромальной клетки селезенки, которая обладает способностью поддерживать хоминг гематопоэтических стволовых клеток, а также имеет свойство ингибировать хоминг гематопоэтических стволовых клеток.
Таким образом, HMS-1 обладает способностью ингибировать хоминг клеток костного мозга на гематопоэтической ткани; имеется сообщение о том, что лейкозные клетки высвобождаются из костного мозга в связи со снижением уровня экспрессии адгезивных молекул VLA4 и VLA5 гематопоэтических клеток (экспрессия VLA молекулы может быть связана с процессом высвобождения из костного мозга миелоидных
лейкозных клеток (Leuk Res., 16, 5, 469-474, 1992)), при этом следует полагать, что VLA4 и VLA5 усиливают
действие лекарственных средств, используемых для лечения лейкоза, за счет высвобождения лейкозных клеток из костного мозга. Аналогично, можно сделать вывод о том, что вышеупомянутое антитело HMS-1 также может быть использовано для лечения лейкоза с получением сходного эффекта.
Моноклональные антитела по настоящему изобретению были подробно описаны в вышеизложенном примере; несмотря на это моноклональные антитела по настоящему изобретению не ограничены этим примерами,
а включает все полученные таким же способом моноклональные антитела, обладающие теми же характеристиками и функциями, независимо от вида антигенов.
Поскольку моноклональные антитела по настоящему изобретению способны распознавать как антиген
вещество, необходимое для хоминга клеток костного мозга на гематопоэтической ткани, а также обладают
свойством ингибировать хоминг гематопоэтических стволовых клеток, то они могут, на основе свойственной
им функции усиливать действие антиракового средства, в частности улучшать действие используемого для
лечения лейкоза антиракового средства за счет высвобождения из костного мозга миелоидных лейкозных
клеток, найти применение в медицине в качестве эффективного лекарственного препарата.
Фиг. 2
Фиг. 3
8
BY 4448 C1
Фиг. 4
Фиг. 5
Фиг. 6
Фиг. 7
Фиг. 8
Национальный центр интеллектуальной собственности.
220072, г. Минск, проспект Ф. Скорины, 66.
9
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
0
Размер файла
248 Кб
Теги
4448, патент
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа