close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Патент BY 15979

код для вставкиСкачать
ОПИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ПАТЕНТУ
РЕСПУБЛИКА БЕЛАРУСЬ
(46) 2012.06.30
(12)
(51) МПК
НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР
ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ
СОБСТВЕННОСТИ
(54)
A 61K 31/7088 (2006.01)
(2006.01)
A 61P 35/02
ОЛИГОНУКЛЕОТИДЫ И СПОСОБ ИНГИБИРОВАНИЯ
В-КЛЕТОЧНОЙ НЕОПЛАЗМЫ
(21) Номер заявки: a 20071552
(22) 2006.02.13
(31) 200510069576.4 (32) 2005.05.17 (33) CN
(85) 2007.12.17
(86) PCT/CN2006/000215, 2006.02.13
(87) WO 2006/122463, 2006.11.23
(43) 2008.10.30
(71) Заявитель: Чанчунь Хуапу Биотекнолоджи Ко., Лтд. (CN)
BY 15979 C1 2012.06.30
BY (11) 15979
(13) C1
(19)
(72) Авторы: ВАН Ли-ин; БАО Му-шэн;
Юй Юн-ли (CN)
(73) Патентообладатель: Чанчунь Хуапу
Биотекнолоджи Ко., Лтд. (CN)
(56) CN 1526718 A, 2004.
JAHRSDORFER B. et al. Clinical Cancer Research, 2005. - V. 11. - P. 14901499.
(57)
1. Способ ингибирования роста В-клеток неоплазмы млекопитающего, при котором
осуществляют контактирование В-клеток неоплазмы с олигонуклеотидом, имеющим последовательность, выбранную из SEQ ID NO:1-9.
2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что предусматривает индуцирование апоптоза
В-клеток неоплазмы.
3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что предусматривает увеличение экспрессии
CD-40 на В-клетках неоплазмы.
4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что предусматривает стимулирование продукции IL-10 В-клетками неоплазмы.
5. Способ по п. 1, отличающийся тем, что В-клетки неоплазмы представляют собой
В-клетки лейкемии, В-клетки лимфомы или В-клетки миеломы.
6. Способ по п. 5, отличающийся тем, что В-клетки лейкемии представляют собой
В-клетки хронической лимфоцитарной лейкемии или В-клетки острой лимфоцитарной
лейкемии.
7. Способ по п. 5, отличающийся тем, что В-клетки лимфомы представляют собой
В-клетки мелкоклеточной лимфоцитарной лимфомы.
8. Способ индуцирования апоптоза В-клеток неоплазмы, при котором осуществляют
контактирование В-клеток неоплазмы с олигонуклеотидом, имеющим последовательность, выбранную из SEQ ID NO:1-9.
9. Способ по п. 8, отличающийся тем, что В-клетки неоплазмы представляют собой
В-клетки хронической лимфоцитарной лейкемии, В-клетки острой лимфоцитарной лейкемии или В-клетки мелкоклеточной лимфоцитарной лимфомы.
10. Способ экспрессии CD-40 на В-клетках неоплазмы, при котором осуществляют
контактирование В-клеток неоплазмы с олигонуклеотидом, имеющим последовательность, выбранную из SEQ ID NO:1-9.
11. Способ по п. 10, отличающийся тем, что В-клетки неоплазмы представляют собой В-клетки хронической лимфоцитарной лейкемии, В-клетки острой лимфоцитарной
лейкемии или В-клетки мелкоклеточной лимфоцитарной лимфомы.
BY 15979 C1 2012.06.30
12. Способ индуцирования продукции IL-10 В-клетками неоплазмы, при котором осуществляют контактирование В-клеток неоплазмы с олигонуклеотидом, имеющим последовательность, выбранную из SEQ ID NO:1-9.
13. Способ по п. 12, отличающийся тем, что В-клетки неоплазмы представляют собой В-клетки хронической лимфоцитарной лейкемии, В-клетки острой лимфоцитарной
лейкемии или В-клетки мелкоклеточной лимфоцитарной лимфомы.
Настоящее изобретение относится к медицине, а именно к онкологии, и предусматривает девять олигонуклеотидов с последовательностями, которые показаны в SEQ ID NO:1
до 9 для ингибирования В-клеточной неоплазмы млекопитающего.
Основываясь на системе классификации WHO [1] лимфоидная злокачественность
группируется на три главных класса: В-клеточную неоплазму, Т-клеточную неоплазму
(естественные киллеры) (NK) и лимфому Ходжинкса. В дальнейшем В-клеточная неоплазма делится на две группы: предшественники В-клеточной неоплазмы и периферическая В-клеточная неоплазма. Предшественники В-клеточной неоплазмы включают в себя
предшественники В-клеточной острой лимфобластной лейкемии (В-клеточная острая
лимфобластная лейкемия, B-ALL)/ лимфобластная лимфома (LBL). Периферическая
В-клетка неоплазмы включают в себя В-клетку хронической лимфоцитарной лейкемии
(В-CLL), мелкоклеточную лимфоцитарную лимфому, В-клеточную пролимфоцитарную
лейкемию, лимфоплазматическую лимфому/иммуноцитому, Mantle-клеточную лимфому,
фолликулярную лимфому, кожную фолликулярную лимфому, экстраузловую В-клеточную маргинальную зону лимфомы типа MALT, узловую В-клеточную лимфому маргинальной зоны ( + /- моноцитоид В-клеток), лимфому селезеночную маргинальной зоны
( + /-ворсинчатые лимфоциты), волосатоклеточную лейкемию, плазмоцитому/плазмаклетку миеломы, диффузную крупноклеточную В-лимфому, медиастинальную В-клеточную лимфому, интраваскулярную крупноклеточную В-лимфому, первичную лимфому
и лимфому Беркитта.
В-клеточная хроническая лимфоцитарная лейкемия (B-CLL) и В-клеточная острая
лимфобластическая/лимфоцитарная лейкемия (B-ALL) являются двумя типами В-клеточной лейкемии.
B-CLL клетки экспрессируют CD19, CD5 и CD23. B-ALL клетки экспрессируют
CD19 + CD10 + маркеры.
Мелкоклеточная лимфоцитарная лимфома является В-клеточной неоплазмой. Моноклональная популяция В-клеток в мелкоклеточной лимфоцитарной лимфоме экспрессирует CD19, CD5 и CD23.
CD40, экспрессируемая на клеточной поверхности нормальных В-лимфоцитов и дентрических клеток, принадлежит к группе рецепторов фактора некроза опухолей (TNFR).
CD40L (CD154), экспрессируемая на Т-лимфоцитах, принадлежит к группе рецепторов
фактора некроза опухолей. Взаимодействие CD40L и CD40 способствует пролиферации,
дифференцировке и антигенной презентации В-лимфоцитов, дендрических клеток и моноцитов. CD40 также экспрессируется на неопластических В-клетках. Увеличение экспрессии CD40 вызывает апоптоз неопластических В-клеток.
В экспериментах как in vivo, так и in vitro было показано, что стимуляция и увеличение CD40 вызывает замедление роста неопластических В-клеток [2, 3].
Известно, что стимулирование экспрессии CD40 на неопластических В-клетках усиливает антигенные свойства неопластических В-клеток и, следовательно, стимулирует
производство специфических к этим клеткам Т-лимфоцитов (CTL). CTL могут эффективно убивать неопластические В-клетки [4]. В присутствии экспессирующих CD40L, CD40
В-клетки хронической лимфоцитарной лейкемии могут быть убиты CD4 цитотоксическими Т-лимфоцитами. Взаимодействие между D40L и CD40 на клетках лимфомы Буркетта
2
BY 15979 C1 2012.06.30
может провоцировать клетку на презентирование опухолевых атигентов специфическим
CTL. В экспериментах in vivo и клинических исследованиях также было продемонстрировано, что активация CD40 может улучшать иммуногенность клеток В-клеточной хронической лимфоцитарной лейкемии (B-CLL) и, следовательно, вызывать размножение CTL,
специфических для этих клеток [5].
В то же время эти данные показывают, что увеличение экспрессии CD40 на неопластических В-клетках может стимулировать антиопухолевый иммунитет по отношению к
В-клеточной неоплазме. Антиопухолевый иммунитет включает, но не ограничивается следующим:
1. Стимулирование апоптоза неопластических В-клеток.
2. Подавление роста неопластических В-клеток.
3. Улучшение иммуногенности неопластических В-клеток и, следовательно, стимулирование размножения CTL, специфических для этих клеток.
Интерлекин-10 (IL-10) является гомодимером цитокина, продуцированного некоторыми Т-клетками, моноцитами, макрофагами и некоторыми неопластическими клетками,
происходящими из В-клеток, Т-клеток или NK-клеток [6]. Активность IL-10 опосредуется
специфическим поверхностным клеточным рецептором, экспрессируемым на антигенпрезентирующих клетках, лимфоцитах, а также В-клетках хронической лимфоцитарной
лейкемии (B-CLL). Было обнаружено, что добавление экзогенной IL-10 ингибирует разрастание B-CLL клеток, свежевыделенных от больных [7].
Сообщается также о том, что IL-10 ингибирует разрастание В-CLL клеток и усиливает
апоптоз В-CLL клеток [8]. Иммуностимулирующие антираковые свойства IL-10 дают
предположение о том, что избыточная экспрессия IL-10 в опухолевом микроокружении
может катализировать раковое иммунное отторжение.
Задача, на решение которой направлено предлагаемое изобретение, заключается в создании способа ингибирования В-клеток неоплазмы млекопитающего, индуцирование
апоптоза В-клеток неоплазмы, увеличение экспрессии IL-10 в опухолевом микроокружении и стимулирование продукции IL-10 В-клетками неоплазмы.
Поставленная задача решается предлагаемым способом ингибирования В-клеточной
неоплазмы путем контактирования В-клеток неоплазмы с олигонуклеотидами, имеющими
последовательность, продемонстрированную в SEQ ID NO1-9 соответственно, и их функциональными гомологами, используя олигонуклеотиды, которые вызывают апоптоз
В-клетки в неопластических клетках, улучшают экспрессию CD40 на В-клетках неоплазмы и индуцирует В-клетки неоплазмы для воспроизведения IL-10.
Олигонуклеотиды или их функциональные гомологи могут использоваться индивидуально либо в совместно, либо быть использованы в комбинации с химиотерапией, иммунотерапией и облучением для лечения В-клеточной неоплазмы.
Способ поясняется следующими примерами и иллюстрациями, представленными на
фиг. 1-3, где:
в первом примере представлен способ, который осуществляют путем контактирования
В-клеток неоплазмы с олигонуклеотидом, имеющим последовательность, выбранную из
девяти олигонуклеотидов, таких как Oligo 1, Oligo 3, Oligo 4, Oligo 5, Oligo 6, Oligo 7,
Oligo 8, Oligo 9, Oligo 10 с последовательностью, продемонстрированной в SEQ ID NO 1,
2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 соответственно, и их функциональными гомологами.
Олигонуклеотиды или их функциональные гомологи могут иметь модификацию фосфатной цепи, которая проявляется в частичной или полной модификации фосфоротиата
или фосфородитиата. Олигонуклеотиды или их функциональные гомологи могут иметь
химические модификации или иметь замещения с превосходящими основаниями. Олигонуклеотиды или их функциональные гомологи могут быть функциональной частью любого другого олигонуклеотида или фрагмента ДНК или быть клонированы в плазмид,
бактериальный вектор, вирусный вектор или вакцину ДНК соответственно. Олигонуклео3
BY 15979 C1 2012.06.30
тиды с последовательностью SEQ ID NO:1-9 могут быть модифицированы путем добавления одного или двух оснований (предпочтительнее от 1 до 10 оснований) к концу каждого
олигонуклеотида или заменой одного или более оснований в них. Специалисты могут определить использование олигонуклеотидов с последовательностью SEQ ID NO:1-9 или их
функциональных гомологов индивидуально или совместно, или использовать фрагменты
ДНК, включающие в себя олигонуклеотиды с последовательностью (SEQ ID NO:1-9) соответственно для достижения цели изобретения, основанной на хорошо известных фактах
и рассматриваемых в данном изобретении.
В-клеточная неоплазма включает, но не ограничивается В-клеточной лейкемией,
В-клеточной лимфомой или миеломой.
Во втором примере осуществления настоящее изобретение предусматривает способ
ингибирования В-клеточной неоплазмы, используя олигонуклеотиды или их функциональные гомологи индивидуально или совместно в объекте исследования. Объектом является человек или животное. В-клеточная неоплазма включает, но не ограничивается Вклеточной лейкемией, В-клеточной лимфомой или миеломой.
В третьем примере осуществления настоящее изобретение предусматривает способ
ингибирования В-клеток неоплазмы, используя олигонуклеотиды или их функциональные
гомологи индивидуально или совместно путем индуцирования апоптоза неопластических
В-клеток.
В четвертом примере осуществления настоящее изобретение предусматривает способ
ингибирования В-клеток неоплазмы, используя олигонуклеотиды или их функциональные
гомологи индивидуально или совместно путем увеличения экспрессии CD40 на неопластических В-клетках.
В пятом примере осуществления настоящее изобретение предусматривает способ ингибирования роста В-клеток неоплазмы, используя олигонуклеотиды или их функциональные гомологи индивидуально или совместно путем стимулирования продукции IL-10
неопластическими В-клетками.
В остальных примерах осуществления настоящее изобретение предусматривает способ ингибирования В-клеток неоплазмы, заключающийся в контактировании В-клеток неоплазмы с эффективным количеством олигонуклеотидов или их функциональных
гомологов по данному изобретению.
Краткое описание чертежей.
Фиг. 1. Эффект уменьшения CD40 на неопластических B-CLL клетках.
B-CLL клетки были инкубированы с или без олигонуклеотидов в течение 7 дней и затем были окрашены с помощью FITC-CD40 антител для анализа экспрессии CD40 с использованием проточной цитометрии. Уровень экспрессии был указан с помощью
показателей MFI.
Фиг. 2. Влияние олигонуклеотидов на содержание CD40 на мелкоклеточной лимфоидной лимфоме.
Клетки мелкоклеточной лимфоидной лимфомы были инкубированы с или без олигонуклеотидов. На 7-й день клетки были окрашены с помощью FITC-CD40 антител для анализа экспрессии CD40 с использованием проточной цитометрии. Уровень экспрессии
указывался с помощью показателей MFI.
Фиг. 3. Влияние олигонуклеотидов на пролиферацию обычной человеческой PBMC.
Обычные человеческие PBMC культивировались с или без олигонуклеотидов и затем
клеточная пролиферация была оценена по инкорпорации [3H] меченого тимидина. Разрастание клеток было выражено как cpm.
Подробное описание изобретения.
Определения.
В данном изобретении используются термины со следующими определениями:
4
BY 15979 C1 2012.06.30
"Олигонуклеотид" представляет собой множество нуклеотидов (например, молекулы,
содержащие сахар (например, дезоксирибоза), связанные с фосфатной группой и взаимозаменяемым органическим основанием). Существует четыре органических основания: цитозин (C), тимин (T), аденин (A) и гуанин (G). Олигонуклеотид можно синтезировать с
помощью автоматического синтезированного олигонуклеотида, который может быть доступен на рынке или может быть приготовлен из имеющихся последовательностей нуклеиновых кислот используя известный метод.
А "back bone modification" олигонуклеотида означает, что олигонуклеотидом может
быть фосфороциатно модифицированное фосфатное основание (где, например, по крайней мере один из кислородов фосфата замещается серой) или другое модифицированное
основание.
Химическая модификация олигонуклеотида означает модификацию путем использования активных групп нуклеотида или создание аналогов нуклеотида. Модификации могут иметь место или в течение или после синтеза олигонуклеотида. Во время синтеза
модифицированные основания (включающие, но не ограничивающиеся аналогами тимидина) могут быть встроены внутрь или к 5' окончанию. После синтеза модификация может
быть проведена с использованием активных групп (посредством амино-модификатора или
3' или 5' гидроксильной группы или через фосфатную группу).
В-клеточная неоплазма означает заболевания, развивающиеся вследствие патологической пролиферации клеток В-лимфоцитарного ряда. В-клеточная неоплазма может быть
подразделена на В-клеточную лейкемию, В-клеточную лимфому и миелому (плазмоцитома/плазмоклеточная миелома). В-клеточная лейкемия включает В-клеточную хроническую лимфоцитарную лейкемию (B-CLL), острую лимфобластную лейкемию (В-предшественник), В-клеточная острая лимфоцитарная лейкемия (B-ALL), В-клеточную
пролимфоцитарную лейкемию и волосатоклеточную лейкемию. В-клеточная лимфома
включает мелкоклеточную лимфоцитарную лимфому, лимфоплазмацитарную лимфому/
иммуноцитому, Mantle-клеточную лимфому, фолликулярную лимфому, кожную фолликулярную лимфому, экстраузловую В-клеточную лимфому маргинальной зоны типа MALT,
узловую В-клеточную лимфому маргинальной зоны ( + /- моноцитоидных В-клеток), лимфому селезеночной маргинальной зоны ( + /- ворсинчатые лимфоциты), диффузную крупноклеточную В-лимфому, медиастинальную (тимусную) крупноклеточную В-лимфому,
внутрисосудистую крупноклеточную В-лимфому, первичновыпотную лимфому и лимфомы Беркетта.
Объект означает млекопитающее, включающее, но не ограничивающееся человеком,
обезьяной, собакой, кошкой, лошадью, коровой, свиньей, козлом, овцой, мышью и крысой.
Олигонуклеотиды по представленному изобретению могут быть введены объекту с
В-клеточной неоплазмой.
Фактор анти-В-клеточной неоплазмы означает фактор, используемый при леченияи
В-клеточной неоплазмы в объекте. Фактор включает олигонуклеотиды данного изобретения, химиотерапевтические, иммунотерапевтические средства и средства, используемые в
радиотерапии. Олигонуклеотиды данного изобретения могут назначаться до, во время или
после введения одного или более антинеопластических агентов для достижения синергичного эффекта при лечении В-клеточной неоплазмы.
Олигонуклеотиды по данному изобретению в комбинации с другим агентом могут
быть отдельными композициями и использоваться в качестве следующего: (1) олигонуклеотиды, которые смешаны со вторым агентом перед введением; (2) олигонуклеотиды и
второй агент вводятся объекту в разное время; (3) олигонуклеотиды и второй агент вводятся в различные части объекта. Кроме того, композиция может содержать плазмиду,
бактериальные векторы, вирусные векторы и вакцину нуклеиновой кислоты для осуществления последовательности олигонуклеотидов по данному изобретению.
5
BY 15979 C1 2012.06.30
Примеры.
Нижеприведенные примеры являются пояснительными и не должны ограничивать
объем данного изобретения. Целесообразные вариации, которые относятся к целесообразным мелким производителям, могут быть сделаны без отклонения от объема изобретения.
Пример 1.
Синтез олигонуклеотида.
В способе используют разработанные и синтезированные олигонуклеотиды со следующими последовательностями и номенклатурами:
Oligo 1:5'-TCgACgTTCgTCgTTCgTCgTTC-S' (обозначенные в SEQ ID NO:1),
Oligo 3:5'-TCggCACgCgACgTgCTggCCgTCgTTTCC-3' (обозначенные в SEQ ID NO:2),
Oligo 4:5'-TCgTCgTCgTCgTTggTCgTTgggg-3' (обозначенные в SEQ ID NO:3),
Oligo 5:5'-TCgTTgCCgTCgg-3' (обозначенные в SEQ ID NO:4),
Oligo 6:5'-TCgTCggg TgCgACgTCgC Agggggg-3' (обозначенные в SEQ ID NO:5),
Oligo 7:5'-TCgTCgggTgCgATCgCAgggggg-3' (обозначенные в SEQ IDNO:6),
Oligo 8:5'-TCgTCgggTgCATCgATgCAgggggg-3' (обозначенные в SEQ ID NO:7),
Oligo 9:5'-tcgtcgggtgcgacgtcgca-3' (обозначенные в SEQ ID NO:8),
Oligo 10:σ'-TCgggACgATCgTCgggggg-S1 (обозначенные в SEQ ID NO:9).
Для анализа функций всех вышеобозначенных Oligos были синтезированы два контрольных олигонуклеотида 2006 с последовательностью 5'-tcgtcgttttgtcgttttgtcgtt-3' и 2216 с
последовательностью 5'-gggggacgatcgtcgggggg-3'. Каждый из олигонуклеотидов был синтезирован в Sangon Biotech Company (Shanghai, China), проверен на эндотоксичность с
помощью лизата Limulus amebocyte (Associates of Cape Cod, Tnc) и превращен в апирогенные реагенты. 2006 (J Immunol 2000:164:1617) является хорошо изученным олигонуклеотидом, который интенсивно активизирует нормальные В-клетки. 2216 (Eur J Immunol
2001; 31:2154) является еще одним хорошо изученным олигонуклеотидом, который индуцирует высокий уровень количества интерферона типа I в дентрических плазмацитоидных
клетках.
Методы синтезирования олигонуклеотида хорошо известны специалистам, и наряду с
другими обычно используется твердофазный синтез Js. В качестве твердого носителя используется пористое стекло с определенным размером гранул. Эти гранулы имеют поверхность с отверстиями и каналами, и это дает возможность прикрепиться защищенному
нуклеотиду.
Синтез олигонуклеотида начинается с 3'-most нуклеотида и протекает через серию
циклов, составляет 5 шагов, которые повторяются до тех пор, пока не прикрепится 5'-most
нуклеотид. Этими шагами являются депротекция, активация, сцепление, закрытие и стабилизация.
Шаг 1. Депротекция.
Защитная группа в охраняемом нуклеозиде, прикрепленном к грануле CPG (controlled
pore glass), удаляется при помощи трихлоруксусной кислоты, оставляя реактивную
5'-гидроксильную группу.
Шаг 2. Активация.
На данном шаге тетразол действует на фосфорамидит нуклеозид сцепление, формируя
промежуточную форму - тетразолил фосфорамидит.
Шаг 3. Сцепление.
Промежуточная форма тетразолил фосфорамидита взаимодействует с гидроксильной
группой реципиента и формируется связь между 5' и 3'. В результате восстанавливается
тетразол и процесс продолжается.
Шаг 4. Закрытие.
На данном шаге ацетилирующий реагент, состоящий из уксусного ангидрида и
N-метил имидазола, используется для блокирования реактивной гидроксильной группы на
5'-most конце олигонуклеотида для предупреждения последующей ошибки сцепления.
6
BY 15979 C1 2012.06.30
Шаг 5. Стабилизация.
Как только завершается этап (шаг) закрытия, последним шагом в цикле является оксидация, которая стабилизирует фосфатную связь между растущей цепью олигонуклеотида
и последним добавленным основанием. Данный шаг проводится в присутствии йода как
слабого оксиданта в тетрагидрофуране (THF) и воде. Если придерживаться данного последнего шага, то идет повторение цикла для каждого нуклеотида в последовательности.
По окончании синтеза одиночно скрученная молекула ДНК очищается с помощью таких методов, как HAP, PAGE, HPLC, C18 и OPC.
Пример 2.
Апоптоз человеческих B-CLL клеток, индуцированных олигонуклеотидами.
1. Подготовка человеческих B-CLL клеток.
Были отобраны образцы крови у не леченных B-CLL (патологически идентифицированных) больных (The First Hospital, JiNn University, China) после получения письменного
подтверждения согласия. Периферические мононуклеарные клетки крови (PBMCs) были
изолированы путем центрифугирования в градиенте плотности Ficoll-Paque (Pharmacia).
Клетки CD5 + CD19 + CD23 + B-CLL в периферических мононуклеарных клетках крови
(PBMCs) были очищены с помощью В-клеточного изолирующего набора (Miltenyi Biotec,
Bergisch Gladbach, Germany) с содержанием CD5 + CD19 + CD23 + cells (B-CLL cells) более 95 %. Клеточный препарат был сделан по руководству Miltenyi Biotec.
Пример 3.
Апоптоз человеческих B-CLL клеток, индуцированных олигонуклеотидами.
Клетки B-CLL инкубировались с Oligo 1, Oligo 3, Oligo 4, Oligo 5, Oligo 6, Oligo 7,
Oligo 8, Oligo 9, Oligo 10, 2006 или 2216 в конечной концентрации 3 µg/ml в 10 % человеческой AB сывороточной среде RPMI 1640 (способ) (HyClone) в 106 клеток на лунку в 48луночной плашке. Олигонуклеотиды были разбавлены в сывороточной среде RPMI 1640
(HyClone). Такой же объем был использован в качестве контрольного.
На 3, 5 и 7 день инкубации клетки были посчитаны и окрашены с помощью тетраметил-родамин этилового эфира (TMRE) (Molecular Probes lnc) [Lena Thyrell, et al. The Journal of Biological Chemistry. - Vol. 279. - No. 23. - Issue of June 4. - P. 24152-24162. - 2004] в
течение 10 минут. TMRE-положительные (жизнеспособные) и TMRE-отрицательные (апоптические) B-CLL клетки были определены с помощью проточной цитометрии (B. D. FACS
Aria). Количество жизнеспособных B-CLL клеток было определено путем умножения общего количества клеток на процент TMRE-положительных клеток в каждый отрезок времени. Эксперимент был повторен на десяти образцах крови от B-CLL больных и общий
результат показал (n = 10), что олигонуклеотиды значительно индуцируют апоптоз B-CLL
клеток (табл. 1).
Таблица 1
Апоптоз B-CLL клеток, индуцированных олигонуклеотидами
Viable B-cell chronic lymphocytic leukemia cells (%), (n = 10)
Time of incubation (day)
Groups
3
5
7
Oligo 1
55,7
27,7
19
Oligo 3
85,5
37,3
31,6
Oligo 4
60,1
38,8
27,5
Oligo 5
58,1
38,1
23,2
Oligo 6
52,3
34,9
31,7
Oligo 7
59,6
38,4
30,2
Oligo 8
51,1
34,2
29,6
Oligo 9
52,8
37,9
24,3
Oligo 10
54,6
35,4
28,3
7
BY 15979 C1 2012.06.30
Продолжение таблицы 1
Viable B-cell chronic lymphocytic leukemia cells (%), (n = 10)
Time of incubation (day)
Groups
3
5
7
Medium
82,2
79,5
81,3
2006
66,5
44,4
40,2
2216
67,7
57,7
50,7
Табличные надписи: Жизнеспособные B-CLL клетки лимфоцитарной
лимфомы (%), n = 10
Группы
Время инкубации (дни)
Среда
Пример 4.
Увеличение экспрессии CD40 на человеческих B-CLL клетках с помощью олигонуклеотидов.
1. Приготовление человеческих B-CLL клеток. Человеческие B-CLL клетки были изъяты у B-CLL больных с помощью процедуры, описанной в примере 2.
2. Увеличение экспрессии CD40 на человеческие B-CLL клетки с помощью олигонуклеотидов.
B-CLL клетки инкубировались с Oligo 1, Oligo 3, Oligo 4, Oligo 5, Oligo 6, Oligo 7,
Oligo 8, Oligo 9, Oligo 10, 2006 или 2216 в конечной концентрации 3 µg/ml в 10 % человеческой AB сывороточной среде RPMI 1640 (HyClone) в 106 клеток на лунку в 48-луночной
плашке. Олигонуклеотиды были разведены бессывороточной средой RPMI 1640
(HyClone). Такой же объем разбавителя (serum free RPMI 1640 medium (HyClone)) был использован как контрольный (Medium). На седьмой день инкубации клетки были посчитаны и окрашены с помощью антител FITC-CD40 (Becton ickinson) (Molecular Probes Inc)
[Lena Thyrell, et al. The Journal of Biological Chemistry. - Vol. 279. - No. 23. - Issue of June 4. P. 24152-24162. - 2004] в течение 10 минут. B-CLL клетки, окрашенные антителами к
CD40, были обнаружены с помощью проточной цитометрии (B. D. FACS Aria). Результат
(фиг. 1) показывает, что олигонуклеотиды значительно увеличивает экспрессию CD40 на
B-CLL клетки, свидетельствуя о том, что олигонуклеотиды могут использоваться для лечения B-CLL путем экспрессии CD40 на клетки. Экспрессия CD40 вызывает апоптоз
B-CLL клеток, приводит к ингибированию роста B-CLL клеток и приводит B-CLL клетки
в более иммуногенное состояние для стимуляции размножения CTLs, специфических для
B-CLL клеток. Эксперимент был повторен как минимум на десяти образцах крови от
B-CLL больных с похожими результатами.
Пример 5.
Стимулирование продуцирования IL-10 из B-CLL, индуцированных олигонуклеотидами.
1. Подготовка человеческих B-CLL клеток.
Человеческие B-CLL клетки были изъяты у B-CLL больных с помощью процедур,
описанных в примере 2.
2. Продукция IL-10 клетками B-CLL, индуцированными олигонуклеотидами.
B-CLL клетки были культивированы с Oligo 1, Oligo 3, Oligo 4, Oligo 5, Oligo 6, Oligo
7, Oligo 8, Oligo 9, Oligo 10 в конечной концентрации 3 µg/ml в 10 % человеческой AB сывороточной среде RPMI 1640 (HyClone) в 106 клеток на лунку в 48-луночной плашке в
трех экземплярах. Олигонуклеотиды были разбавлены в бессывороточной среде RPMI
1640 (HyClone). Такой же объем разбавителя (serum free RPMI 1640 medium (HyClone))
был использован как контроль (Medium). Супернатант культуры был собран через 24 часа
или в заданное время и оценен на предмет IL-10 в системе Fluorokine MAP Immunoarray
(R&D Systems). Наши данные показали, что олигонуклеотиды инициируют продукцию до
8
BY 15979 C1 2012.06.30
высокого уровня IL-10 B-CLL клетками (табл. 5). Кроме того, наши данные впоследствии
показали, что добавление экзогенного rh-IL-10 (Schering Corp) в культуру B-CLL клеток
индуцировало апоптоз B-CLL клеток дозазависимым от IL-10 способом, который мог
быть специфически блокирован антителами IL-10 (R & D Systems). Эксперимент был повторен с использованием по крайней мере десяти образцов изъятых у B-CLL больных. С
аналогичными результатами.
Таблица 5
Продукция интерлейкина-10 клетками B-CLL, индуцированными
олигонуклеотидами
IL-10 production by B-CLL cells
Group
pg/ml
Oligo 1
800
Oligo 3
621
Oligo 4
469
Oligo 5
523
Oligo 6
112
Oligo 7
576
Oligo 8
502
Oligo 9
455
Oligo 10
752
Medium
01,2
Табличные надписи: Продукция интерлейкина-10 (IL-10) клетками B-CLL
Группа
Среда
Пример 6.
Апоптоз клеток человеческой мелкоклеточной лимфоцитарной лимфомы, вызванных
олигонуклеотидами.
1. Подготовка клеток человеческой мелкоклеточной лимфоцитарной лимфомы. Клетки мелкоклеточной лимфоцитарной лимфомы были выделены путем биопсии лимфотического узла от больных (The First Hospital, Jilin University, China) с мелкоклеточной
лимфоцитарной лимфомой (патологически идентифицированной) после получения информированного письменного согласия. Биоптат был измельчен с помощью шероховатой
поверхности предметного стекла для выделения клеток в 5 ml 10 % человеческой AB сывороточной среде RPMI 1640 (HyClone) в 6-сантиметровую плашку для культивирования.
Отделенные клетки были профильтрованы через ячейки нержавеющей стали и собраны в
50 ml коническую пробирку, содержащую 15 мл бессывороточной среды RPMI 1640 (HyClone). Пробирка была центрифугирована при 300 Xg в течение 10 минут и затем надосадочная жидкость была слита. CD5 + CD19 + CD23 + клетки мелкоклеточной лимфоцитарной лимфомы были очищены с использованием изоляционного комплекта (Miltenvi
Biotec, Bergisch Gladbach, Germany) до содержания CD5 + CD19 + CD23 + cells (small lymphocytic lymphoma cells) более 95 %. Клеточный препарат был сделан по руководству
Miltenyi Biotec.
2. Апоптоз клеток мелкоклеточной лимфоцитарной лимфомы, вызванный олигонуклеотидами.
Клеткимелкоклеточной лимфоцитарной лимфомы инкубировались с помощью Oligo 1,
Oligo 3, Oligo 4, Oligo 5, Oligo 6, Oligo 7, Oligo 8, Oligo 9, Oligo 10, 2006 или 2216 в конечной концентрации 3 µg/ml в 10 % человеческой AB сывороточной среде RPMI 1640
(HyClone) в 106 клеток на лунку в 48-луночной плашке. Олигонуклеотиды были разбавлены в бессывороточной среде RPMI 1640 (HyClone). Такой же объем разбавителя (serum
free RPMI 1640 medium (HyClone)) был использован как контроль (Medium). На 3, 5 и
9
BY 15979 C1 2012.06.30
7 день инкубации клетки были посчитаны и окрашены с помощью тетраметил-родамин
этилового эфира (TMRE) (Molecular Probes inc) [Lena Thyrell, et al. The Journal of Biological
Chemistry. - Vol. 279. - No. 23. - Issue of June 4. - P. 24152-24162. - 2004) в течение
10 минут. TMRE-положительные (жизнеспособные) и TMRE-негативные (апоптические)
B-CLL клетки были определены с помощью проточной цитометрии (B. D. FACS Aria).
Число жизнеспособных B-CLL клеток было рассчитано путем умножения общего количества клеток на процент TMRE-положительных клеток в каждый отрезок времени. Эксперимент был повторен на пяти образцах, изъятых у больных с мелкоклеточной лимфоцитарной лимфомой, и общий результат (n = 5) показал, что олигонуклеотиды
значительно индуцируют апоптоз клеток мелкоклеточной лимфоцитарной лимфомы
(табл. 2), что свидетельствует о том, что олигонуклеотиды могут быть использованы для
лечения мелкоклеточной лимфоцитарной лимфомы путем индуцирования апоптоза клеток
мелкоклеточной лимфоцитарной лимфомы.
Таблица 2
Апоптоз мелкоклеточной лимфоцитарной лимфомы, индуцированной
олигонуклеотидами
Viable small lymphocytic lymphoma cells (%), (n = 5)
Time of Incubation (day)
Groups
3
5
7
Oligo 1
53,5
26,7
18
Oligo 3
83,9
38,4
29,1
Oligo 4
61,1
36,9
29,7
Oligo 5
57,2
37,4
21,3
Oligo 6
56,2
36,1
32,1
Oligo 7
60,5
40,3
31,1
Oligo 8
50,2
37,4
30,2
Oligo 9
54,2
39,7
25,4
Oligo 10
56,5
37,6
29,3
Medium
81,2
78,4
77,1
2006
67,6
45,3
41,1
2216
68,5
58,7
52,1
Табличные надписи: Жизнеспособные мелкие клетки лимфоцитарной лимфомы (%), n = 10
Группы
Время инкубации (дни)
Среда
Пример 7.
Влияние олигонуклеотидов на экспрессию CD40 на клетках мелкоклеточной лимфоцитарной лимфомы.
1. Подготовка клеток человеческой мелкоклеточной лимфоцитарной лимфомы.
Клетки человеческой мелкоклеточной лимфоцитарной лимфомы были изъяты у больных с помощью методов, описанных выше.
2. Влияние олигонуклеотидов на экспрессию CD40 на клетках мелкоклеточной лимфоцитарной лимфомы.
Клетки мелкоклеточной лимфоцитарной лимфомы были инкубированы с Oligo 1,
Oligo 3, Oligo 4, Oligo 5, Oligo 6, Oligo 7, Oligo 8, Oligo 9, Oligo 10, 2006 или в конечной
концентрации 3 µg/ml в 10 % человеческой AB сывороточной среде RPMI 1640 (HyClone)
в 106 клеток на лунку в 48-луночной плашке. Олигонуклеотиды были разбавлены в бессывороточной среде RPMI 1640 (HyClone). Такой же объем разбавителя (serum free RPMI
1640 medium (HyClone)) был использован как контроль (Medium). На седьмой день инку10
BY 15979 C1 2012.06.30
бации клетки были посчитаны и окрашены с антителом FITC-CD40 (Becton ickinson) (Molecular Probes Inc) [Lena Thyreil, et al. The Journal of Biological Chemistry. - Vol. 279. No. 23. - Issue of June 4. - P. 24152-24162. - 2004] в течение 10 минут. Клетки мелкоклеточной лимфоцитарной лимфомы, окрашенные антителом CD40, были детерминированы с
использованием проточной цитометрии (B. I), FACS Aria). Результат (фиг. 2) показал, что
олигонуклеотиды значительно увеличивают экспрессию CD40 на клетки мелкоклеточной
лимфоцитарной лимфомы, показывая, что олигонуклеотиды могут использоваться для лечения мелкоклеточной лимфоцитарной лимфомы путем регуляции воздействия CD40 на
клетки. Увеличение количества CD стимулирует апоптоз клеток мелкоклеточной лимфоцитарной лимфомы, индуцирует ингибирование клеток мелкоклеточной лимфоцитарной
лимфомы и приводит клетки мелкоклеточной лимфоцитарной лимфомы в более иммуногенное состояние для стимулирования генераций, специфических для этих клеток CTLs.
Эксперимент был повторен на 5 образцах с похожими результатами.
Пример 8.
Апоптоз клеток человеческой острой B-ALL острой лимфоцитарной лейкемии, индуцированных олигонуклеотидами.
1. Подготовка человеческих B-ALL клеток.
Были изъяты образцы крови от необработанных B-ALL (патологически идентифицированных) больных (The First Hospital, Jim University, China) после получения информированного письменного согласия. PBMCs были изолированы с помощью Ficoll-Paque (Pharmacia)
центрифугирования в градиенте плотности. CD19 + CD10 + B-ALL клетки в PBMCs были
очищены с использованием В-клеточного изолирующего набора (Miltenyi Biotec, Bergisch
Gladbach, Germany) до содержания CD19 + CD10 + клеток (B-ALL клетки) более 95 %. Подготовка клетки осуществлялась в соответствии с руководством Miltenyi Biotec.
2. Апоптоз B-ALL клеток, индуцированных олигонуклеотидами.
B-ALL клетки были инкубироавны с Oligo 1, Oligo 3, Oligo 4, Oligo 5, Oligo 6, Oligo 7,
Oligo 8, Oligo 9, Oligo 10, 2006 или 2216 в конечной концентрации 3 µg/ml в 10 % человеческой AB сывороточной среде RPMI 1640 (HyClone) в 106 клеток на лунку в 48-луночной
плашке. Олигонуклеотиды были разбавлены в бессывороточной среде RPMI 1640 (HyClone). Такой же объем разбавителя (serum free RPMI 1640 medium (HyClone)) был использован как контроль (Medium).
На 3, 5 и 7 день инкубации клетки были посчитаны и окрашены с помощью тетраметил-родамин этилового эфира (TMRE) (Molecular Probes inc) [Lena Thyrell, et al. The Journal of Biological Chemistry. - Vol. 279. - No. 23. - Issue of June 4. - P. 24152-24162. - 2004] в
течение 10 минут. TMRE-положительные (жизнеспособные) и TMRE-негативные (апоптические) B-CLL клетки были определены с помощью проточной цитометрии (B. D. FACS
Aria). Число жизнеспособных B-CLL клеток было рассчитано путем умножения общего
количества клеток на процент TMRE-положительных клеток в каждый отрезок времени.
Эксперимент, проведенный на десяти образцах крови, изъятых у больных, с получением
подобных результатов (n = 10), показал, что олигонуклеотиды значительно индуцируют
апоптоз B-ALL клеток (табл. 3) и доказывает, что олигонуклеотиды могут быть использованы для лечения B-ALL путем индуцирования апоптоза B-ALL клеток.
Таблица 3
Апопотоз B-ALL клеток, индуцированных олигонуклеотидами
Viable B-ALL cells (%), (n = 10)
Time of Incubation (days)
Groups
3
5
7
Oligo 1
66,9
60,1
59,5
Oligo 3
67,9
64,1
65
Oligo 4
69,2
66,2
65,7
11
BY 15979 C1 2012.06.30
Продолжение таблицы 3
Groups
Oligo 5
Oligo 6
Oligo 7
Oligo 8
Oligo 9
Oligo 10
Medium
2216
2006
Табличные надписи:
Viable B-ALL cells (%), (n = 10)
Time of Incubation (days)
3
5
70,6
68,2
66,4
61
75,9
70,1
80,1
74,9
67,2
63,1
72,6
68,1
91,5
92,7
94,9
95
62,9
58,4
Жизнеспособные B-ALL клетки (%), n = 10
Группы
Время инкубации (дни)
Среда
7
67
60,3
69,2
72,3
62,9
65,3
93,1
93,5
59
Пример 8.
Увеличение экспрессии CD40 на B-ALL клетки олигонуклеотидами.
1. Подготовка человеческих B-ALL клеток.
Человеческие B-ALL клетки были подготовлены из образцов крови больных с помощью процедур, описанных в примере 6.
B-ALL клетки были инкубированы с Oligo 1, Oligo 3, Oligo 4, Oligo 5, Oligo 6, Oligo 7,
Oligo 8, Oligo 9, Oligo 10, 2006 или 2216 в конечной концентрации 3 µg/ml в 10 % человеческой AB сывороточной среде RPMI 1640 (HyClone) в 106 клеток на лунку в 48-луночной
плашке. Oligo 2, 2006 или 2216 были разбавлены в бессывороточной среде RPMI 1640
(HyClone). Такой же объем разбавителя (serum free RPMI 1640 medium (HyClone)) был использован как контроль (Medium). На 3, 5 и 7 день инкубации клетки были посчитаны и
окрашены с помощью FITC-CD40 антител (Becton ickinson) (Molecular Probes lnc) [Lena
Thyrell, et al. The Journal of Biological Chemistry. - Vol. 279. - No. 23. - Issue of June 4. P. 24152-24162. - 2004] в течение 10 минут. Клетки мелкоклеточной лимфоидной лимфомы, окрашенные с помощью антител CD40, были детерминированы с помощью проточной цитометрии (B. D. FACS Aria). Эксперимент, проведенный на десяти образцах крови,
изъятых у больных, с получением таких же результатов (табл. 4), показал, что олигонуклеотиды значительно увеличивают экспрессию CD40 на B-ALL клетки, показывая, что
олигонуклеотиды могут быть использованы для лечения B-ALL путем увеличения количества CD 40 на клетки. Экспрессия CD40 способствует апоптозу B-ALL клеток, индуцируя ингибирование B-ALL клеток, и приводит B-ALL клетки в более иммунногенное
состояние для стимулирования генерации CTLs, специфических для B-ALL клеток.
Таблица 4
Экспрессия CD40 на B-ALL клетках олигонуклеотидами
CD40 expression on B-cell acute lymphocytic leukemia cells (MFI), (n = 10)
Time of Incubation (days)
Groups
3
5
7
Oligo 1
33,6
33,9
34,2
Oligo 3
29,9
29,1
30,2
Oligo 4
30,1
29,9
31,6
Oligo 5
25,3
26,6
26,9
Oligo 6
32,9
32,8
33,1
Oligo 7
27,8
28,1
29,2
12
BY 15979 C1 2012.06.30
Продолжение таблицы 4
CD40 expression on B-cell acute lymphocytic leukemia cells (MFI), (n = 10)
Time of Incubation (days)
Groups
3
5
7
Oligo 8
15,9
17,2
17,8
Oligo 9
28,2
28,1
29,2
Oligo 10
26,9
27,4
27,8
Medium
7,2
7,9
8,5
2216
9,9
9,5
10,6
2006
33,7
33,8
34,1
Табличные надписи:
Экспрессия CD40 на В-клеточную острую лимфоцитарную
лейкемию (MFI), n = 10
Группы
Время инкубации (дни)
Среда
Пример 9.
Эффект олигонуклеотидов на пролиферацию человеческой нормальной PBMC.
Человеческие PBMCs были изолированы от лейкоцитарного слоя нормальной донорской крови (The Blood Center of Jilin Province, China) с помощью центрифугирования градиента плотности Ficoll-Hypaque (Pharmacia). Жизнеспособность PBMCs составляла 9599 % по методу вытеснения трипаново синего.
The PBMCs (6X105/well) были размещены в 96-луночной плошке с U-образным дном
(Costar) и культивированы с или без Oligo 1, Oligo 3, Oligo 4, Oligo 5, Oligo 6, Oligo 7,
Oligo 8, Oligo 9, Oligo 10, 2006 или 2216 относительно конечной концентрации 6 µg/ml в
трех экземплярах в течение 36 ч с последующей обработкой [3H] тимидином (New England
Nuclear, Boston, MA) в течение 16 ч. Клетки были собраны на стекловолоконных фильтрах
и измерены сцинтилляционным счетчиком. Пролиферация клеток была выражена через SI
(stimulation index) (из трех лунок). Были представлены данные от 5 нормальных образцов
крови. 2006 и 2216 были использованы как контроль. Результаты показали, что олигонуклеотиды могут отчетливо стимулировать пролиферацию PBMCs (фиг. 3), показывая, что
олигонуклеотиды, вместо индуцирования апоптоза, стимулируют пролиферацию нормальных человеческих PBMCs и нетоксичны для культивированных клеток.
На основании детального описания изобретения и в соответствии с его реализацией
(воплощением) специалисту в соответствующей области будет очевидно, что модификации и вариации возможны без выхода за рамки данного изобретения, как это определено в
нижеследующих прилагаемых пунктах формулы изобретения.
Источники информации:
1. Система классификации WHO // American Journal of Surgical Pathology. - 1997. No. 21 (1). - P. 114-121.
2. Funakoshi et al., Blood 83, 1994. -P. 2787-2794; Murphy et al., Blood 86, 1995. P. 1946-1953; Eliopoulos, A. G., et al., 1996.
3. Oncogene 13:2243; Hirano, A.,et al. 1999. Blood 93:2999; Tong, A. W., M et al., 2001.
Clin. Cancer Res. 7:691.
4. Dilloo D., et al. Blood, 1997; 90: 1927-1933; Kate K., et al. J. Clin Invest, 1998;
101:1133-1141; Wierda W. G., et al. Blood, 2000; 96:2917-2924.
5. Kato, K.,et al. 1998. J. din. Invest. 101:1133; Wierda, W. G.,et al., 2000. Blood 96: 2917.
6. Kitabayashi et al., 1995; Masood et al., 1995; Sjoberg et al., 1996; Beatty et al., 1997;
Boulland et al., 1998; Jones et al., 199).
13
BY 15979 C1 2012.06.30
7. Jesper Jurlander, Chun-Fai Lai, Jimmy Tan, et al. Characterization of interleukin-10 receptor expression on B-cell chronic lymphocytic leukemia cells. Blood. Vol 89. - No. I 1 (June
1), 1997. - P. 4146-4152.
8. Anne-Catherine Fluckiger, Isabella Durand and Jacques Banchereau. Interleukin 10 Induces Apoptotic Cell Death of B-Chronic Lymphocytic Leukemia Cells. J. Exp. Med, Vol. 179
January, 1994. - P. 91-99.
Фиг. 1
Фиг. 2
Фиг. 3
Национальный центр интеллектуальной собственности.
220034, г. Минск, ул. Козлова, 20.
14
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
0
Размер файла
283 Кб
Теги
15979, патент
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа