close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Патент BY 4496

код для вставкиСкачать
ОПИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ПАТЕНТУ
РЕСПУБЛИКА БЕЛАРУСЬ
(13)
C1
7
НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР
ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ
СОБСТВЕННОСТИ
G 01N 33/53,
C 07K 16/24,
C 07K 17/02,
C 12P 21/08,
C 12N 5/10,
C 12N 5/20,
C 12N 15/13,
A 61P 37/00
РЕКОМБИНАНТНЫЕ IL4 АНТИТЕЛА, ПРИМЕНЯЕМЫЕ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ
ЗАБОЛЕВАНИЙ, ОПОСРЕДОВАННЫХ IL4
(21) Номер заявки: 960596
(22) 1996.04.05
(86) PCT/US94/10308, 1994.09.07
(31) 08/117,366, 08/136,783
(32) 1993.09.07, 1993.10.14
(33) US, US
(46) 2002.06.30
BY 4496 C1
BY (11) 4496
(51) A 61K 39/395,
(12)
(54)
(19)
(71) Заявители: СМИТКЛАЙН
БИЧЕМ
КОРПОРЕЙШН (US), СМИТКЛАЙН БИЧЕМ п.л.с.
(GB)
(72) Авторы: ХОЛМЕС, Стефен Д. (GB), ГРОСС,
Митчем, С., СИЛЬВЕСТЕР, Даниель Р. (US)
(73) Патентообладатели: СМИТКЛАЙН
БИЧЕМ
КОРПОРЕЙШН (US), СМИТКЛАЙН БИЧЕМ
п.л.с. (GB)
(57)
1. Белок слияния, обладающий специфичностью связывания в отношении человеческого интерлейкина-4
(IL4), содержащий области, определяющие комплементарность (CDR), происходящие из нейтрализующего
моноклонального антитела 3В9, характеризуемого константой диссоциации равной или меньшей 2 х 10-10 М
относительно человеческого IL4,
где аминокислотные последовательности CDR тяжелой цепи указанного белка слияния представляют собой:
(a) SEQ ID NO 22;
(b) SEQ ID NO 24 или
(с) SEQ ID NO 26;
аминокислотные последовательности CDR легкой цепи представляют собой:
(d) SEQ ID NO 16;
(e) SEQ ID NO 18; и
(f) SEQ ID NO 20 или
(g) SEQ ID NO 28,
и аминокислотные последовательности первого партнера слияния представляют собой: последовательность тяжелой цепи: аминокислоты 21-50, 56-71, 88-119 и 131-141 последовательности SEQ ID NO 12 или
последовательность легкой цепи: аминокислоты 20-42, 58-72, 80-111 и 121-131 последовательности SEQ ID
NO 14.
2. Белок по п.1, отличающийся тем, что последовательность указанного первого партнера слияния представляет собой последовательность тяжелой цепи: аминокислоты 21-50, 56-71, 88-119 и 131-141 последовательности SEQ ID NO 12.
3. Белок по п.1, отличающийся тем, что последовательность указанного первого партнера слияния представляет собой последовательность легкой цепи: аминокислоты 20-42, 58-72, 80-111 и 121-131 последовательности SEQ ID NO 14.
4. Фармацевтическая композиция для лечения аллергии и других болезненных состояний, связанных с
избыточной продукцией IgE в организме человека, содержащая терапевтически эффективное количество
BY 4496 C1
инженерного антитела и фармацевтически приемлемый носитель, отличающаяся тем, что инженерное антитело представляет собой белок слияния по п.1.
5. Способ лечения аллергии и других болезненных состояний, связанных с избыточной продукцией IgE в
организме человека, заключающийся во введении нуждающемуся в таком лечении пациенту терапевтически
эффективного количества белка слияния по п.1.
6. Изолированная нуклеиново-кислотная последовательность молекулы ДНК природного или синтетического происхождения, выбранная из группы, включающей:
a) нуклеиново-кислотную последовательность, кодирующую белок слияния по п.1;
b) нуклеиново-кислотную последовательность, комплементарную к (a);
c) нуклеиново-кислотную последовательность из 18 и более нуклеотидов, способную гибридизоваться с
(a) или (b) в строгих условиях; и
d) фрагмент или аналог (a), (b) или (c), который кодирует белок, характеризующийся специфичностью в
отношении человеческого IL4;
причем указанная последовательность необязательно содержит сайт рестрикции.
7. Последовательность по п.6, отличающаяся тем, что последовательность, кодирующая белок слияния,
содержит нуклеиново-кислотную последовательность SEQ ID NO 13.
8. Последовательность по п.6, отличающаяся тем, что последовательность, кодирующая белок слияния,
содержит нуклеиново-кислотную последовательность SEQ ID NO 11.
9. Последовательность по п.8, отличающаяся тем, что ее выбирают из группы последовательностей, кодирующих области, определяющие комплементарность легкой цепи, при этом указанная группа включает:
a) AAG GCC AGC CAA AGT GTT GAT TAT GAT GGT
GAT AGT TAT ATG AAC : SEQ ID NO 15,
b) AAG GCC TCC CAA AGT GTT GAT TAT GAT GGT
GAT AGT TAT ATG AAC : SEQ ID NO 53,
c) GCT GCA TCC AAT CTA GAA TCT : SEQ ID NO 17,
d) CAG CAA AGT AAT GAG GAT CCT CCG ACG : SEQ ID NO 19, и
e) CAG CAA AGT AAT GAG GAT CCT CCG AGG : SEQ ID NO 27.
10. Изолированная нуклеиново-кислотная последовательность молекулы ДНК природного или синтетического происхождения, выбранная из группы, включающей:
a) нуклеиново-кислотную последовательность, кодирующую область, определяющую комплементарность
(CDR), которую получают из нейтрализующего моноклонального антитела 3В9, специфичного в отношении
человеческого IL4 и имеющего константу диссоциации равную или меньшую 2 х 10-10М;
b) нуклеиново-кислотную последовательность, комплементарную к (a);
c) нуклеиново-кислотную последовательность из 18 и более нуклеотидов, способную гибридизоваться с
(a) или (b) в строгих условиях; и
d) фрагмент или аналог (a), (b) или (c), который кодирует белок, характеризующийся специфичностью в
отношении человеческого IL4.
11. Последовательность по п.10, отличающаяся тем, что ее выбирают из группы последовательностей,
кодирующих области, определяющие комплементарность тяжелой цепи, при этом указанная группа включает:
a) ACT TCT GGT ATG GGT GTG AGC : SEQ ID NO 21,
b) CAC ATT TAC TGG GAT GAT GAC AAG CGC TAT
AAC CCA TCC CTG AAG AGC : SEQ ID NO 23,
c) AGA GAG ACT GTG TTC TAC TGG TAC TTC GAT
GTC : SEQ ID NO 25,
d) ACC TCC GGT ATG GGT GTT TCC : SEQ ID NO 54,
e) CAC ATC TAC TGG GAC GAC GAC AAA CGT TAC
AAC CCG AGC CTG AAA TCC : SEQ ID NO 55, и
f) CGC GAA ACC GTT TTC TAC TGG TAC TTC GAC GTT : SEQ ID NO 56.
12. Рекомбинантная плазмида природного или синтетического происхождения с высоким уровнем конъюгативности, имеющая физическую карту согласно рис.9 и содержащая тяжелую цепь нуклеиновой кислоты
по п.6.
13. Рекомбинантная плазмида природного или синтетического происхождения с высоким уровнем конъюгативности, имеющая физическую карту согласно рис.10 и содержащая легкую цепь нуклеиновой кислоты
по п.6.
14. Рекомбинантная плазмида природного или синтетического происхождения с высоким уровнем конъюгативности, имеющая физическую карту согласно рис.9 и содержащая тяжелую цепь нуклеиновой кислоты
по п.10.
2
BY 4496 C1
15. Рекомбинантная плазмида природного или синтетического происхождения с высоким уровнем конъюгативности, имеющая физическую карту согласно рис.10 и содержащая легкую цепь нуклеиновой кислоты
по п.10.
16. Линия клеток E.coli для экспрессии белков слияния, содержащая нуклеиново-кислотную последовательность по п.6.
17. Линия клеток COS для экспрессии белков слияния, содержащая нуклеиново-кислотную последовательность по п.6.
18. Линия клеток CHO для экспрессии белков слияния, содержащая нуклеиново-кислотную последовательность по п.6.
19. Линия клеток E.coli для экспрессии белков слияния, содержащая нуклеиново-кислотную последовательность по п.10.
20. Линия клеток COS для экспрессии белков слияния, содержащая нуклеиново-кислотную последовательность по п.10.
21. Линия клеток CHO для экспрессии белков слияния, содержащая нуклеиново-кислотную последовательность по п.10.
22. Нейтрализующее моноклональное антитело, обладающее высоким титром в отношении человеческого IL4, его Fab фрагмент или F(ab)2 фрагмент, отличающееся тем, что оно получено путем скрининга библиотеки гибридомных продуктов с помощью альдегид-связанного человеческого IL4 или биотинизированного человеческого IL4.
23. Гибридома клеточной линии для получения антител, клеточная линия которой имеет идентифицирующие характеристики клеточной линии 3426А11С1В9, депонированной в Европейской коллекции культур
животных клеток под номером 93100620.
(56)
US 5041381 A, 1991.
EP 0162699 A2, 1985.
WO 90/07861 A1.
WO 91/09059 A1.
Настоящее изобретение относится к области слитых белков, а также к белкам, используемым для лечения
и диагностики болезненных состояний, связанных с действием IL4 и избытком продуцирования IgE, более
конкретно, настоящее изобретение относится к химерным и гуманизированным IL4 антителам.
Настоящая заявка является частично продолженной заявкой относительно заявки США с серийным номером 08/136,783 от 14 октября 1993 г., которая является продолжением заявки США с серийным номером
08/117,366 от 7 сентября 1993 г., причем на обе эти заявки ссылаются в настоящем изобретении.
Область атопических аллергических заболеваний охватывает как относительно незначительные болезни,
например такие как сезонные риниты и коньюктивиты, так и более серьезные заболевания, такие как атопический дерматит и атопическая астма, а также такие болезни, угрожающие жизни, как анафилактический
шок. Общим фактором таких болезненных состояний является иммунный ответ организма на аллергены,
причем такая реакция заключается в продуцировании иммуноглобулиновых E (IgE) антител у генетически
предрасположенных пациентов (атопия). Ингибирование продукции IgE в течение длительного времени составляло цель специфической иммунотерапии аллергических заболеваний с использованием десенсибилизирующих вакцин. Однако в последние годы безопасность и эффективность вакционной терапии стала вызывать сомнения, однако потребность понижения уровня IgE не отпала.
Интерлейкин 4 (IL4) представляет собой протеиновый медиатор в лимфоидной системе. Исследования
лимфоцитов, взятых у атопических пациентов, позволило обнаружить повышенное количество Тлимфоцитов, обладающих способностью секретировать IL4 в ответ на стимуляцию и повышенные количества IL4, секретированного после стимуляции.
Было обнаружено, что анти- IL4 антитело ингибирует IgE, но не ингибирует IgG1 или IgG2а (Finkelman с
сотр., Ann. Rev. Immunol. 8:303(1990)), а также продукцию IL5 секретирующих T-клеток (Maggi с сотр., J.
Immunol 148:2142 (1992)). Кроме этого, последние данные подтвердили, что IL4 может оказывать влияние на
аккумуляцию зозинофила в тканях. См., например, Терреr с сотр., Cell, 62:457(1990); Терреr с сотр., Cell,
57:503 (1989).
Задачей настоящего изобретения является создание высокоаффинного IL4 антагониста, способного снижать уровень зозинофильного воспаления в результате уменьшения пролиферации IL5 секретирующих клеток и ингибирования механизма адгезии, в результате чего зозинофилы могли бы аккумулироваться в тканях
и использоваться для лечения, профилактики и диагностики аллергических реакций.
Предметом изобретения является белок слияния, обладающий специфичностью связывания в отношении
человеческого интерлейкина-4 (IL4), содержащий области, определяющие комплементарность (CDR), про3
BY 4496 C1
исходящие из нейтрализующего моноклонального антитела 3В9, характеризуемого константой диссоциации
равной или меньшей 2×10-10 M относительно человеческого IL4, где аминокислотные последовательности
CDR тяжелой цепи указанного белка слияния представляют собой:
(a) SEQ ID NO 22;
(b) SEQ ID NO 24 или
(c) SEQ ID NO 26;
аминокислотные последовательности CDR легкой цепи представляют собой:
(d) SEQ ID NO 16:
(e) SEQ ID NO 18 и
(f) SEQ ID NO 20 или
(g) SEQ ID NO 28,
и аминокислотные последовательности первого партнера слияния представляют собой: последовательность тяжелой цепи: аминокислоты 21 - 50, 56 - 71, 88 - 119 и 131 – 141 последовательности SEQ ID NO 12
или последовательность легкой цепи: аминокислоты 20 - 42, 58 -72, 80 -111 и 121 - 131 последовательности
SEQ ID NO 14.
Предпочтительно что последовательность указанного первого партнера слияния представляет собой последовательность тяжелой цепи: аминокислоты 21 - 50, 56 - 71, 88 - 119 и 131 - 141 последовательности SEQ
ID NO 12.
А также предпочтительно что последовательность указанного первого партнера слияния представляет
собой последовательность легкой цепи: аминокислоты 20 - 42, 58 -72, 80 - 111 и 121 - 131 последовательности SEQ ID NO 14.
Еще один аспект настоящего изобретения относится к фармацевтической композиции для лечения аллергии и других болезненных состояний, связанных с избыточной продукцией IgE в организме человека, которая содержит терапевтически эффективное количество инженерного антитела и фармацевтически приемлемый носитель, при этом инженерное антитело представляет собой заявляемый белок слияния.
Следующий аспект настоящего изобретения предусматривает способ лечения аллергии и других болезненных состояний, связанных с избыточной продукцией IgE в организме человека, заключающийся во введении нуждающемуся в таком лечении пациенту терапевтически эффективного количества белка слияния по
изобретению.
Кроме того, предметом изобретения является изолированная нуклеиново-кислотная последовательность
молекулы ДНК природного или синтетического происхождения, выбранная из группы, включающей:
a) нуклеиново-кислотную последовательность, кодирующую белок слияния;
b) нуклеиново-кислотную последовательность, комплементарную к (а);
c) нуклеиново-кислотную последовательность из 18 и более нуклеотидов, способную гибридизоваться с
(а) или (b) в строгих условиях; и
d) фрагмент или аналог (а), (b) или (с), который кодирует белок, характеризующийся специфичностью в
отношении человеческого IL4;
причем указанная последовательность необязательно содержит сайт рестрикции.
В одном варианте заявляется последовательность, кодирующая белок слияния, содержащая нуклеиновокислотную последовательность SEQ ID NO 13.
В другом варианте - последовательность, кодирующая белок слияния, содержит нуклеиново-кислотную
последовательность SEQ ID NO 11.
В следующем варианте последовательность выбирают из группы последовательностей, кодирующих области, определяющие комплементарность легкой цепи, при этом указанная группа включает:
Еще один аспект настоящего изобретения предусматривает изолированную нуклеиново-кислотную последовательность молекулы ДНК природного или синтетического происхождения, выбранную из группы,
включающей:
а) нуклеиново-кислотную последовательность, кодирующую область, определяющую комплементарность
(CDR), которую получают из нейтрализующего моноклонального антитела 3В9, специфичного в отношении
человеческого IL4 и имеющего константу диссоциации равную или меньшую 2×10-10 M;
4
BY 4496 C1
b) нуклеиново-кислотную последовательность, комплементарную к (а);
c) нуклеиново-кислотную последовательность из 18 и более нуклеотидов, способную гибридизоваться с
(а) или (b) в строгих условиях; и
d) фрагмент или аналог (а), (b) или (с), который кодирует белок, характеризующийся специфичностью в
отношении человеческого IL4.
Причем ее выбирают из группы последовательностей, кодирующих области, определяющие комплементарность тяжелой цепи, при этом указанная группа включает:
Настоящее изобретение предусматривает также рекомбинантные плазмиды природного или синтетического происхождения с высоким уровнем коньюгативности, имеющие физическую карту согласно фиг. 9 и
содержащие тяжелые цепи нуклеиновой кислоты, описанные выше, рекомбинантные плазмиды природного
или синтетического происхождения с высоким уровнем коньюгативности, имеющие физическую карту согласно фиг. 10 и содержащие легкие цепи нуклеиновой кислоты, описанные выше.
Далее предметом изобретения являются следующие линии клеток:
линии клеток E.coli для экспрессии белков слияния, содержащие нуклеиново-кислотные последовательности, описанные выше,
линии клеток COS для экспрессии белков слияния, содержащие нуклеиново-кислотные последовательности, описанные выше,
линии клеток CHO для экспрессии белков слияния, содержащие нуклеиново-кислотные последовательности. описанные выше.
Настоящее изобретение предусматривает также нейтрализующее моноклональное антитело, обладающее
высоким титром в отношении человеческого IL4, его Fab фрагмент или F(ab)2 фрагмент, полученное путем
скрининга библиотеки гибридомных продуктов с помощью альдегид-связанного человеческого IL4 или биотинизированного человеческого IL4.
Последний аспект изобретения предусматривает гибридому клеточной линии для получения антител,
клеточная линия которой имеет идентифицирующие характеристики клеточной линии 3426А11С1В9, депонированной в Европейской коллекции культур животных клеток под номером 93100620.
Изобретение иллюстрируется следующими фигурами.
На фиг. 1 (последовательности SEQ ID NO: 1, 2) проиллюстрирован вариабельный участок легкой цепи
(аминокислоты 21-132) мышиного 114 антитела 3В9, человек/мышь 3В9 химерное антитело, а также нативная сигнальная последовательность (аминокислоты 1-20). Подчеркнутые участки обозначают CDR (последовательности SEQ ID NO: 15, 16; SEQ ID NO: 17 и 18; и SEQ ID NO: 19 и 20).
На фиг. 2 (SEQ ID NO: 3 и 4) проиллюстрированы вариабельный участок тяжелой цепи аминокислоты 20140) мышиного 3В9, а также нативная сигнальная последовательность (аминокислоты 1-19). Подчеркнутые
участки обозначают CDR (SEQ ID NO: 21, 22; SEQ ID NO: 23 и 24; и SEQ ID NO: 25, 26).
На фиг. 3 (SEQ ID NO: 9, 10) проиллюстрирован вариабельный участок тяжелой цепи (аминокислоты 21141) человек/мышь 3В9 химерного антитела и его сигнальная последовательность (аминокислоты 1-19; SEQ
ID NO: 5 и 6). Подчеркнутые части обозначают CDR, являющиеся производными 3В9 (SEQ ID NO: 21, 22;
SEQ ID NO: 23, 24 и SEQ ID NO: 25, 26).
На фиг. 4 проиллюстрированы (SEQ ID NO: 11, 12) вариабельный участок тяжелой цепи (аминокислоты
20-141) гуманизированного 3В9 антитела с сигнальной последовательностью (аминокислоты 1-19; SEQ ID
NO: 5, 6). Подчеркнутые участки обозначают CDR, являющиеся производными 3В9 (SEQ ID NO: 54, 22;
SEQ ID NO: 55, 24; и SEQ ID NO: 56 и 26).
На фиг. 5 (SEQ ID NO: 13, 14) проиллюстрирован вариабельный участок легкой цепи (аминокислоты 21131) гуманизированного 3В9 антитела и сигнальная последовательность (аминокислоты 1-20; SEQ ID NO: 7,
8). Подчеркнутые участки обозначают CDR, являющиеся производными 3В9 (SEQ ID NO: 53, 16; SEQ ID
NO: 17, 18 и SEQ ID NO: 27, 28).
5
BY 4496 C1
На фиг. 6А (SEQ ID NO: 5, 6) показана сигнальная последовательность тяжелой цепи, используемая в
приведенном ниже примере 4.
На фиг. 6В (SEQ ID NO: 7, 8) показана сигнальная последовательность легкой цепи, используемая в
представленном ниже примере 4.
На фиг. 7 дано схематическое изображение плазмиды pIL4chhc3-pcd, используемой для экспрессии химерной IL4 тяжелой цепи в клетках млекопитающих. Такая плазмида содержит бета-лактамазный ген (BETA
LAC), точку начала репликации SV-40 (SV40), цитомегаловирусную промоторную последовательность
(CMV), сигнальную последовательность, химерную вариабельную тяжелую цепь от SEQ ID NO: 9, 10, константный участок человеческой тяжелой цепи, поли А сигнал бычьего гормона роста (BGH), бетаглобиновый промотор (beto glopro), дигидрофолатредуктазный ген (DHFR) и другая BGH последовательность поли
А сигнала в среде pVC19.
На фиг. 8 представлена схема плазмиды pIL4chlc-pcdn, используемой для экспрессирования химерного
IL4 легко-цепного вариабельного участка SEQ ID NO: 1 и 2 в клетках млекопитающего. Эта плазмида отличается от изображенной на фиг. 7 тем, что она содержит химерный легко-цепной вариабельный участок, отличный от химерной тяжелой цепи, постоянный участок человеческой легкой цепи и неомициновый ген
(Neo) помимо DHFR.
На фиг. 9 представлена схема плазмиды pIL4hzhc-l-pcd, используемой для экспрессии синтетического IL4
вариабельного участка тяжелой цепи SEQ ID NO: 11 и 12 в клетках млекопитающего. Такая плазмида отличается от изображенной на фиг. 7 тем, что содержит вариабельный участок гуманизированной тяжелой цепи,
отличный от того, который присутствует в химерной тяжелой цепи.
На фиг. 10 представлена схема плазмиды pIL4hzlc-O-Pcn, используемой для экспрессии вариабельного
участка гуманизированной IL4 легкой цепи SEQ ID NO: 13 и 14 в клетках млекопитающего. Такая плазмида
отличается от той, что изображена на фиг. 8 тем, что содержит вариабельный участок гуманизированной
легкой цепи, отличающейся от той, что присутствует в химерной легкой цепи и не кодирует DHFR ген.
Настоящее изобретение обеспечивает ряд антител, их фрагментов и слитых белков, главным образом, гуманизированных антител, которые характеризуются связующей специфичностью в отношении человеческого IL4, нейтрализующей активностью и высоким сродством к человеческому IL4, как это показано в примерах, относящихся к мышиным MAb или крысиным MAb 6A1. Такие продукты находят применение в
терапевтических и фармацевтических композициях для лечения реакций, вызванных действием IL4 и IgE.
Такие продукты также используются для диагностики вызванного действием IL4 болезненного состояния в
результате измерений (например, методом твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA) циркуляционного эндогенного уровня IL4 у людей.
Принятые определения.
Термин "слитый белок" относится к белку, закодированному слитой молекулой, который может быть получен экспрессией в выбранной клетке-хозяине. Такие слитые белки представляют собой генно-инженерные
антитела, например, химерные или гуманизированные антитела, или фрагменты антитела, в которых полностью или частично отсутствует константный участок иммуноглобулина, например, Fv, Fab или F(ab)2 и т.д.
Термин "слитые молекулы" относится к нуклеиновокислотной последовательности, кодирующей участки, определяющие комплементарность (CDR), не-человеческого иммуноглобулина, которые вставлены в
первый партнер слияния, включающий человеческие вариабельные каркасные последовательности. Иногда
первый партнер слияния оперативно связан со вторым партнером слияния.
Термин "первый партнер слияния" относится к нуклеиновокислотной последовательности, кодирующей
человеческий каркас или вариабельный участок человеческого иммуноглобулина, где нативные (или встречающиеся в природе) СDR замещены СDR донорского антитела. Человеческая вариабельная область может
представлять собой иммуноглобулиновую тяжелую цепь, легкую цепь (или обе такие цепи), а также аналог
их функциональных фрагментов. Такие СDR (или СDR области), находящиеся внутри вариабельных участков антител (иммуноглобулинов), могут детерминироваться (определяться известными способами). Так например, Kabat c сотр. (Sequences of Protein of Immunological Interest, 4-е изд. Департамент здравоохранения
США, Национальный Институт здоровья (1987)), описывает правила расположения СDR. Кроме этого известны компьютерные программы идентификации участков или структур СDR.
Термин "высокий титр" относится к антителу с высокой аффиностью связывания, характеризующемуся
Кd равной или меньшей 2×10-10 M для человеческого IL4.
Под термином "специфичность связывания относительно человеческого IL4" подразумевается высокий
титр (или сродство) в отношении человеческого, но не в отношении бычьего или мышиного IL4.
Термин "второй партнер слияния" относится к другим нуклеотидным последовательностям, кодирующим
протеин или пептид, с которыми коньюгирован первый партнер слияния в рамке или с использованием необязательной традиционной линкерной последовательности (например, путем оперативного связывания).
Предпочтительно это вещество представляет собой иммуноглобулин. Второй партнер слияния может включать нуклеиново-кислотную последовательность, кодирующую полный константный район того же самого
(например, вариант гомологии, когда первый и второй белки слияния имеют одинаковое происхождение или
6
BY 4496 C1
дополнительного (например, гетерологичного) нужного антитела. Это вещество может представлять собой
иммуноглобулиновую тяжелую или легкую цепи (либо обе такие цепи, как часть единого полипептида). Второй партнер слияния не ограничивается конкретным классом иммуноглобулина или изотипом. Кроме этого,
второй партнер слияния может включать часть иммуноглобулинового константного участка, такого как Fab
или F(ab)2 (например, дискретную часть соответствующего человеческого константного участка или участка
каркаса). Такой второй партнер слияния может также включать последовательность, кодирующую интегрально-мембранный протеин, экспонированный на внешней поверхности клетки-хозяина, например, как
часть фаговой библиотеки, или последовательность, кодирующую белок в целях диагностики, например, пероксидазу хрена, β - галактозидазу и т.п.
Термины Fy, Fc, Fаb или F(аb)2 используются в стандартных значениях (см., например, Harlow с сотр.,
Antibodies Alaboratory Manual, лаборатория Колд Спринг Харбор (1988).
Используемый в тексте термин "инженерное антитело" относится к типу слитого белка, т.е. синтетического антитела (например химерного или гуманизированного антитела), в которых часть вариабельных доменов легкой и/или тяжелой цепей выбранного акцепторного антитела замещена на аналогичные части одного или более донорских антител, обладающих специфичностью в отношении выбранного эпитопа. Так
например, указанные молекулы могут включать антитела, характеризующиеся наличием гуманизированной
тяжелой цепи, связанной с немодифицированной легкой цепью (либо химерной легкой цепью) или наоборот.
Инженерные антитела могут также характеризоваться изменением нуклеиново-кислотных последовательностей, кодирующих вариабельные доменные каркасные участки легкой и/или тяжелой цепей акцепторного антитела с тем, чтобы сохранить специфичность к связыванию донорского антитела. Такие антитела могут
включать замену одного или более СDR (предпочтительно всех) от акцепторного антитела на СDR до донорского антитела, описанного в настоящем документе.
Термин "химерное антитело", используемый в данном тексте, относится к типу инженерных антител, которые содержат природные вариабельный район (легкая цепь и тяжелые цепи), произведенный из донорского антитела, ассоциированного с константными районами легкой и тяжелой цепей, произведенных из акцепторного антитела.
Термин "гуманизированное антитело" относится к антителу инженерного типа с его СDR от нечеловеческого донорского иммуноглобулина, причем другие оставшиеся иммуноглобулиновые части молекулы являются производными одного (или более) человеческого иммуноглобулина. Следует отметить, что
каркасные опорные остатки могут подвергаться изменению с тем, чтобы сохранить связующую аффинность
(см., например, Queen с сотр., Proc. Natl. Acad. Sci USA 86, 10029-10032 (1989), Hodgson с сотр.,
Bio/Technology, 9:421 (1991).
Используемый в тексте термин "донорское антитело" относится к антителу (поликлональному, моноклональному или рекомбинантному), которое способствует передаче нуклеиново-кислотным последовательностям его вариабельных участков, СDR или других его функциональных фрагментов или аналогов к первому
партнеру слияния, в результате чего образуется слитая молекула и экспрессированный слитый протеин с антигенной специфичностью и нейтрализующей способностью, характерными для донорского антитела. Примером донорского антитела, подходящего для использования в настоящем изобретении, может служить нечеловеческое нейтрализующее моноклональное антитело (например мышиное), обозначаемое, как 3В9. Антитело 3В9 определяется, как обладающее высоким титром, человеческий-IL4 специфичное (т.е. не распознающее бычий или мышиный IL4), нейтрализующее антитело изотипа IgG1, имеющее ДНК вариабельной
легкой цепи и аминокислотные последовательности SEQ 1Д № № 1 и 2, а также ДНК вариабельной тяжелой
цепи и аминокислотные последовательности SEQ 1Д № № 3 и 4 в константной области подходящего мышиного IgG.
Термин "акцепторное антитело" относится к антителу (поликлональному, моноклональному или рекомбинантному) гетерологичному донорскому антителу, которое способствует передаче всех (или любой их
части, но предпочтительно всех) нуклеиново-кислотных последовательностей, кодирующих каркасные районы его тяжелой и/или легкой цепи и/или константные районы его тяжелой и/или легкой цепи второму партнеру слияния. Предпочтительно, человеческое антитело представляет собой акцепторное антитело.
Термин "СDR" относится к определяющему комплементарность участку аминокислотных последовательностей антитела, которые представляют собой гипервариабельный участок иммуноглобулиновых легких
и тяжелых цепей. См., например, Kabat с сотр. Последовательности протеинов, имеющих иммунологическое
значение, 4-е изд., Департамент здравоохранения США, Национальный институт здоровья (1987). Имеется
по три СDR (или СDR районов) в тяжелой и легкой цепях в вариабельной части иммуноглобулина. В связи с
этим используемый в тексте термин "СDR" относится ко всем трем CDR тяжелой цепи или всем трем CDR
легкой цепи (либо ко всем CDR как легкой, так и тяжелой цепей).
CDR обеспечивают множество константных остатков для связывания антитела с антигеном или эпитопом. CDR настоящего изобретения являются производными последовательностей вариабельных тяжелой и
легкой цепей донорского антитела и содержат аналоги встречающихся в природе CDR, причем такие анало-
7
BY 4496 C1
ги обладают частью или сохраняют ту же антиген-связующую специфичность и/или нейтрализующую способность, что и донорское антитело, из которого они произошли.
Под термином "распределение антиген-связующей специфичности или нейтрализующей способности"
предполагается, например, что хотя МАb 3В9 может характеризоваться некоторым уровнем антигенного
сродства, а CDR, закодированный нуклеиново-кислотной последовательностью 3В9 в подходящем структурном окружении может обладать более низким или более высоким сродством, предполагается, что CDR
3В9 в таких условиях все-таки будут распознавать тот же эритоп, что и 3В9. Примерами тяжелоцепных CDR
3В9 могут служить последовательности 1Д № 22; последовательность 1Д № 24; последовательность 1Д
№ 26; а примерами легкоцепных CDR 3В9 могут служить последовательность 1Д № 16; последовательность
1Д № 18 и последовательность 1Д № 20.
Термин "функциональный фрагмент" относится к неполной вариабельной последовательности тяжелой
или легкой цепи (например, небольшие делеции на амино- или карбокси-концах иммуноглобулинового вариабельного участка), сохраняющей ту же антиген-связующую специфичность и/или нейтрализующую способность, что и антитело, из которого был получен данный фрагмент.
Термин "аналог" относится к аминокислотной последовательности, модифицированной, по меньшей мере, одной аминокислотой, причем указанная модификация может быть осуществлена химически, представлять собой замещение или перегруппировку нескольких аминокислот (как правило не более 10) и такая модификация позволяет аминокислотной последовательности сохранять биологические характеристики,
например, специфичность к антигену, высокий титр или аффинность, присущие немодифицированной последовательности. Так например, молчащие мутации могут реализоваться путем замещений с целью создания рестрикционных эндонуклеазных сайтов внутри или в пределах окружающих СDR области.
Аналоги могут также возникать в ходе аллельных вариаций. Под термином "аллельная вариация или модификация" подразумевается изменение нуклеиново-кислотной последовательности, кодирующей аминокислотную или пептидную последовательности изобретения. Такие вариации или модификации могут быть
связаны с дегенерацией генетического кода или достигнуты в результате обдуманного конструирования с
целью придания желаемых характеристик. Такие вариации или модификации могут в результате приводить
или не приводить к изменению в любой кодирующей аминокислотной последовательности. Так например,
аминокислотные последовательности CDR легкой цепи, последовательность 1Д № 16 идентична нативной
мышиной последовательности и гуманизированного 3В9 антитела. Однако такая СDR последовательность
закодирована как SEQ 1Д №: 15, так и SEQ 1Д №: 53. Аналогичным образом, CDR SEQ 1Д №: 22 закодирована как SEQ 1Д №: 21, так и SЕQ 1Д №: 54, CDR SEQ 1Д №: 24 закодирована как SEQ 1Д №: 23, так и SEQ
1Д №: 55; и СDR SEQ 1Д №: 26 закодирована, как SEQ 1Д №: 25, так и SEQ 1Д №: 56.
Термин "эффекторные агенты" относится к не-протеиновым молекулам-носителям, с которыми, обычными методами, могут быть связаны слитые протеины и/или природная или синтетическая, легкая или тяжелая цепь донорского антитела или других фрагментов донорского антитела. Такие не-белковые носители могут включать традиционные носители, используемые в области диагностики, например полистирол или
другие пластиковые шарики, полисахариды, например те, что используются в системе B1Acope /Pharmacia/
или другие не-белковые вещества, используемые в медицине и безопасные при применении на людях и животных. Другие агенты-эффекторы могут включать макроцикл для хелатирования атома тяжелого металла
или радиоизотопы. Такие эффекторы могут также использоваться для повышения времени полураспада слитых протеинов; к таким агентам относится полиэтиленгликоль.
Высокоаффинные IL4 моноклональные антитела
Для осуществления конструирования антител, фрагментов и слитых протеинов изобретения могут применяться не-человеческие разновидности (например материалы, полученные от коров, овец, приматов, грызунов (например мышей и крыс) и т.д.) и они используются для генерации желаемого иммуноглобулина путем представления с помощью нативного человеческого IL4 или его пептидного эпитопа. Традиционные
гибридомные методы используются для обеспечения гибридомной клеточной линии, секретирующей нечеловеческий MAb к IL4. Затем такие гибридомы подвергают скринингу с использованием IL4, ковалентно
связанного с 96-луночными пластинами или с использованием биотинилированного IL4, предназначенного
для применения в скрининге в соответствии с методикой, подробно описанной в следующем ниже примере
2. Таким образом, одним из отличительных признаков настоящего изобретения является способ детекции
MAb на человеческий IL4, в котором используемые аналитические средства позволяют избежать денатурацию IL4. Согласно такому способу было обнаружено, что могут детектироваться MAb с высоким титром
(или высоким сродством) к человеческому IL4.
В качестве одного из примеров вначале будет описано получение нейтрализующего MAb с высоким титром из мышиного донора. МАb 3В9, представляющие собой желательное мышиное донорское антитело для
использования в выработке химерного или гуманизированного антитела подробно описано в следующем
ниже примере 1. 3В9 МАb характеризуется антиген-связующий специфичностью на человеческий IL4 с Кd
менее 2,0×10-10 M (около 1,8×10-10 M) в отношении IL4. Kd для 114 фрагмента Fаb такого 3В9 имеет значение менее 3×10-10 M. Эпитоп такого антитела не может картироваться с помощью IL4 линейных пептидов и,
8
BY 4496 C1
следовательно, такой эпитоп рассматривается, как связывающийся с не-соприкасающимся эпитопом. Картина связывания предполагает наличие связующего сайта в области B-C петля (остатки 60-69) → С-спираль
(остатки 70-93). В отношении картированного обозначения таких участков можно сослаться на работы Cook
с сотр. J. Mol. Biol 218:675-678 (1991), Walter с сотр., J. Biol. Chem. 267:20371-20376 (1992), Wlodaver с
сотр., FEBS Left. 309:59-64 (1992), Redfield с сотр. Biochem 30:11029-11035 (1991), Smith с сотр., J. Mol. Biol.
224:899-904 (1992), Garrett с сотр., (1992) и Powers с сотр. Biochem 31:4334-4346 (1992) и Science 256:16731677 (1992).
Другим желаемым донорским антителом является крысиный МАb, 6A1. Получение такого MAb описано
ниже в примере 7. Такой МАb характеризуется тем, что является изотипом IgG2a и имеет константу диссоции
в отношении IL4 менее 2,0×10-10 М (около 1,6×10-10 M). Как и в случае 3В9, эпитоп-мишень такого 6A1 не
картируется с IL4 линейными пептидами и поэтому такой эпитоп рассматривается как не-соприкасающийся
и трехмерный. Картина связывания с IL4 мутеинами и его биологическая активность указывают на связывание в области Д-спирали человеческого IL4 (аминокислотные остатки 109-127), по-видимому в области тирозина на аминокислотном остатке # 124.
Настоящее изобретение не ограничивается использованием 3В9 Маb, 6A1 MAb или их гипервариабельных (т.е. СDR) последовательностей. Любые другие подходящие IL4 антитела с высоким титром, характеризующиеся константой диссоциации равной или меньшей 2,0×10-10 M в отношении человеческого IL4 и соответствующие анти-114 CDR могут служить заменой указанным материалам. В следующем ниже описании
донорское антитело идентифицируется, как 3В9 или 6A1, причем такое обозначение дается лишь в целях иллюстрации и упрощения описания.
Фрагменты антител
Настоящее изобретение также охватывает использованием Fаb фрагментов или Г(аb)2 фрагментов, являющихся производными МАb, направленных против человеческого IL4. Такие фрагменты используются в
качестве агентов, защищающих in vivo от IL4 - IgE - медиаторных состояний или in vitro в качестве части IL4
диагностического средства. Фрагмент Fаb содержит полную легкую цепь и амино-терминальную часть тяжелой цепи, а фрагмент F(аb')2 представляет собой фрагмент, образованный двумя фрагментами Fаb, связанными посредством дисульфидной связи. MAb 3B9, 6A1 и другие аналогичные высокоаффинные, IL4 связывающие антитела, представляют собой источники фрагментов Fab и F(аb'), которые могут быть получены
традиционными методами, например, расщеплением МАb с помощью соответствующих протеолитических
энзимов, папаина и/или пепсина, или рекомбинантными методами. Такие фрагменты Fab и F(аb')2 сами по
себе используются в качестве терапевтических, профилактических или диагностических агентов, а также в
качестве доноров последовательностей, включающих вариабельные участки и CDR последовательностей,
используемых для образования рекомбинантных или гуманизированных антител, как это описано в настоящем документе.
Анти-IL4 аминокислотная и нуклеотидные последовательности
MAb 3В9 или другие описанные выше антитела могут обеспечивать последовательности, например, вариабельные пептидные последовательности тяжелой и легкой цепей, рамочные последовательности, CDR
последовательности, их функциональные фрагменты и аналоги, а также иодирующие их нуклеиновокислотные последовательности, применяемые для конструирования и получения различных слитых протеинов (включая генно-инженерные антитела), которые характеризуются антиген-связующей специфичностью
донорского антитела.
Таким образом, в качестве одного из примеров, настоящее изобретение предусматривает последовательности вариабельной легкой цепи и вариабельной тяжелой цепи из IL4 мышиного антитела 3В9 и последовательности, являющиеся их производными. Вариабельный участок тяжелой цепи 3В9 характеризуется аминокислотными остатками 20-140 SEQ 1Д №: 4. CDR области указаны путем подчеркивания на фиг. 2 и
представлены в SЕQ 1Д №: 22; SEQ 1Д №: :24 и SEQ 1Д №: 26. Вариабельная область клона легкой цепи характеризуется аминокислотными остатками 21-132 на фиг. 1 /SEQ 1Д №: 2/. CDR области даны аминокислотными остатками 44-58 /SEQ 1Д №: 16/; 74-80 /SEQ 1Д №: 18/ и 113-121 /SEQ 1Д №: 20/.
Также предусмотрены вариабельная область химерной тяжелой цепи и сигнальная нуклеотидная и аминокислотная последовательности. Эти последовательности идентичны тяжелой цепи 3В9 за исключением
сигнальной последовательности. Сигнальная последовательность химерной тяжелой цепи показана в SEQ 1Д
№ №: 5 и 6. Области СDR подчеркнуты на фиг. 3 и они идентичны по аминокислотной последовательности
нативным мышиным CDR /SEQ 1Д №: 21-26/. Нуклеотидные и аминокислотные последовательности вариабельного района химерной легкой цепи идентичны немодифицированным 3В9 последовательностям (аминокислотные остатки 21-132 SEQ 1Д №: 2), что делает возможным использование природных мышиных сигнальных последовательностей (аминокислотные остатки 1-20 SEQ 1Д №: 2).
Вариабельная область гуманизированной тяжелой цепи и сигнальные последовательности проиллюстрированы на фиг. 4 /SEQ 1Д №: 11 и 12/. Сигнальная последовательность также показана в SEQ 1Д №: 5 и 6.
Другие подходящие сигнальные последовательности, известные специалистам в данной области, могут служить заменой сигнальным последовательностям, представленным в примерах. CDR аминокислотные после9
BY 4496 C1
довательности такой конструкции идентичны CDR нативной мышиной и химерной тяжелой цепи и они показаны в SEQ 1Д №: 22 (закодированной SEQ 1Д №: 54), SEQ 1Д №: 24 (закодированной SEQ 1Д №: 55) и
SEQ 1Д №: 56 (закодированной SEQ 1Д №: 26).
Приведенная в качестве примера (синтетическая) вариабельная последовательность гуманизированной
легкой цепи проиллюстрирована на фиг. 5 /SEQ 1Д № №: 13 и 14/. Такая сигнальная последовательность
включает аминокислотные остатки 1-19 последовательности 1Д №: 8. CDR последовательности на этом рисунке обозначены путем подчеркивания и они отличаются от CDR нативной мышиной CDR по сигнальной
аминокислотной последовательности SEQ 1Д №: 20. Таким образом, CDR гуманизированной легкой цепи
представлены SEQ 1Д №: 53 и 16, SEQ 1Д №: 17 и 18 и SEQ 1Д №: 27 и 28. Имеющееся отличие подробно
описано в примере 3.
Нуклеиново-кислотные последовательности настоящего изобретения или их фрагменты кодирующие
пептидные последовательности вариабельной легкой цепи и тяжелой цепи используются в немодифицированной форме или могут быть синтезированы с целью введения желаемых модификаций, например, рестрикционных сайтов. Выделенные нуклеиново-кислотные последовательности природного или синтетического происхождения, являющиеся производными MAb 3В9 или других желательных IL4 антител с высоким
титром, могут необязательно содержать рестрикционные сайты, облегчающие инсерцию или легирование в
подходящую нуклеиново-кислотную последовательность, например, ту, что кодирует каркасную область желаемого антитела, легирование с мутантными CDR или слияние с нуклеиново-кислотной последовательностью, кодирующей выбранный второй партнер слияния.
Принимая во внимание вырожденности генетического кода, могут быть сконструированы различные кодирующие последовательности, которые способны кодировать вариабельные аминокислотные последовательности тяжелой и легкой цепи, а также CDR последовательности изобретения и их функциональные
фрагменты и аналоги, которые делят антигенную специфичность донорского антитела. Выделенные нуклеиново-кислотные последовательности изобретения или их фрагменты, кодирующие пептидные последовательности вариабельной цепи или CDR, могут использоваться для получения слитых протеинов, химерных
или гуманизированных антител или других инженерных антител настоящего изобретения при оперативном
соединении со вторым партнером слияния.
Эти последовательности также используются для мутагенного введения специфических изменений в нуклеиново-кислотные последовательности, кодирующие CDR или каркасные области, а также для введения
полученной в результате модифицированной или слитой нуклеиново-кислотной последовательности в плазмиду для экспрессии. Так например, молчащие замещения в нуклеотидной последовательности каркасной и
CDR-кодирующей областей использовали для создания рестрикционных сайтов, которые облегчают вставку
мутагенизированных CDR (и/или каркасных) областей. Такие CDR области использовали для конструирования гуманизированного антитела изобретения.
Следует отметить, что помимо выделенных нуклеиново-кислотных последовательностей, кодирующих
части слитого белка и антител, описанных в настоящем документе, могут использоваться и другие нуклеиново-кислотные последовательности, например, комплементарные нативным последовательностям. Используемые ДНК последовательности включают такие последовательности, которые гибридизуются в строгих
условиях /см. T. Maniatis с сотр., Молекулярное клонирование (Лабораторное руководство), лаборатория
Колд Спринг Харбор (1982), стр. 387-389/ с ДНК-последовательностями. Одним из примеров такой гибридизации в строгих условиях является гибридизация при 4ХSSC при 65 °С с последующей промывкой в
0,1ХSSC при 65 °С в течение часа. Другим примером гибридизации в строгих условиях может служить обработка в 50 % формамиде, 4ХSSC при 42 °С. Предпочтительно, чтобы такие гибридные ДНКпоследовательности содержали, по крайней мере, 18 нуклеотидов, т.е. имели размер, близкий к размеру
CDR.
Слитые молекулы и слитые протеины
Слитые молекулы способны кодировать слитые белки, которые включают такие инженерные антитела,
как химерные антитела и гуманизированные антитела. Желательная слитая молекула содержит CDR. последовательности, кодирующие пептиды, обладающие антигенной специфичностью IL4 антитела предпочтительно высоко-аффинного антитела, предусматриваемого настоящим изобретением, вставленного в первый
партнер слияния (человеческая каркасная область или человеческая иммуноглобулиновая вариабельная область).
Предпочтительно, чтобы первый партнер слияния был оперативно связан со вторым партнером слияния.
Второй партнер слияния определен выше и он может включать последовательность, кодирующую область второго антитела, например Fc область. Вторые партнеры слияния могут также включать последовательности, кодирующие другие иммуноглобулины, с которыми, с сохранением рамки считывания, слита константная область
легкой или тяжелой цепи или такое слияние осуществляет с помощью линкерной последовательности. Инженерные антитела, направленные против функциональных фрагментов или аналогов IL4, могут быть сконструированы таким образом, чтобы обеспечивать усиленное связывание с тем же антителом.
10
BY 4496 C1
Второй партнер слияния может быть также связан с описанным выше агентом-аффектором, включающим
не-белковые молекулы-носители, с которыми второй партнер слияния может быть оперативно связан традиционными средствами.
Слияние или сцепление между вторыми партнерами слияния, например последовательностями антитела,
и агентом-аффектором может осуществляться любыми подходящими методами, например путем создания
традиционных ковалентных или ионных связей, слияния протеинов, или с использованием таких гетеробифункциональных сшивателей, как карбодиимид, глутаровый альдегид и т.п. Такие методики известны в
данной области и легко доступны из традиционной химической и биохимической литературы. Кроме этого,
традиционные линкерные последовательности, которые просто обеспечивают желаемое пространство между
вторым партнером слияния и агентом-аффектором также могут быть сконструированы в слитой молекуле.
Конструкция таких линкеров хорошо известна специалистам в данной области.
Следует отметить, что сигнальные последовательности молекул изобретения могут быть модифицированы с целью усиления экспрессии. В качестве одного из примеров можно отметить слитый белок, имеющий
аминокислотную последовательность последовательности мышиной тяжелой цепи, которая идентична химерной вариабельной тяжелой цепи (VН) фиг. 2 /SEQ 1Д №: 4/, содержит оригинальной сигнальный пептид,
замененный другой сигнальной последовательностью (аминокислотные остатки 1-20) /SEQ 1Д №: 6/.
Пример слитого белка содержит пептидную или протеиновую последовательность вариабельной тяжелой
и/или легкой цепи, обладающую антигенной специфичностью МАb 3В9, например, VН /аминокислотные остатки 21-141 последовательности SEQ 1Д №: 9 и 10/ и VL цепи /аминокислотные остатки 21-132 последовательностей SEQ 1Д № №: 1 и 2/. Еще один желательный слитый белок изобретения характеризуется аминокислотной последовательностью, содержащей по крайней мере одну, а предпочтительно все CDR
вариабельной области тяжелых и/или легких цепей мышиного антитела 3В9, причем оставшиеся последовательности имеют человеческое происхождение, либо их аналоги или функциональные фрагменты. См., например, гуманизированные VH и VL области SEQ 1Д № №: 11 и 12 и SEQ 1Д № №: 13 и 14 (фиг. 4 и 5).
Согласно еще одному воплощению изобретения, инженерное антитело может содержать присоединенный
к нему дополнительный агент. Так например, метод рекомбинантной ДНК технологии может быть использован для получения инженерного антитела изобретения, в котором Fc фрагмент СН3 домена молекулы всего
антитела заменен на энзим или другую детектируемую молекулу (например, полипептидный эффектор или
молекулу-репортер).
Второй партнер слияния может быть также оперативно связан с неиммуноглобулиновым пептидом, протеином или их фрагментом, гетерологичным CDR-содержащей последовательности, имеющей антигенную
специфичность мышиного 3В9. Полученный в результате белок может в ходе экспрессии проявлять как анти-IL4 антигенную специфичность, так и характеристики не-иммунноглобулина. Характеристики такого
партнера слияния могут включать такие функциональные характеристики, как другой связующий или рецепторный домен, или терапевтические характеристики, если партнер слияния сам по себе является терапевтическим белком, или дополнительные антигенные характеристики.
Другой желательный белок настоящего изобретения может содержать молекулу полного антитела,
имеющую легкие и тяжелые цепи полной длины, или любой ее дискретный фрагмент, например Fab или F
(аb')2, димер тяжелой цепи, или любые их минимальные рекомбинантные фрагменты, например FV. или одно-цепочечное антитело (SCA) либо любую другую молекулу с той же специфичностью, что выбранное донорское МАb например, МАb 3В9 или 6A1. Такой протеин может использоваться в виде слитого белка или
может применяться в не-слитой форме.
В каждом случае, когда второй партнер слияния происходит из другого антитела, например любого изотипа или класса иммуноглобулиновой каркасной или константной области, возникает генно-инженерное антитело. Инженерные антитела могут содержать иммуноглобулиновые (1g) константные области и вариабельные каркасные области из одного источника, например акцепторного антитела, и одну или более
(предпочтительно, все) CDR донорского антитела, например описанное в тексте анти-IL4 антитело. Кроме
этого, могут осуществляться изменения, например, делеции, замещения или вставки вариабельного домена
каркасной области тяжелой и/или легкой и/или тяжело цепной вариабельной доменной остовной области акцепторной цепи акцепторного MAb на нуклеиново-кислотном или аминокислотном уровнях или участков
донорского CDR с тем, чтобы сохранить антигенную связующую специфичность донорского антитела.
Такие инженерные антитела конструируются таким образом, чтобы использовать одну (или обе) вариабельные тяжелые и/или легкие цепи IL4 МАb (необязательно модифицированные, как это описано) или одну
или более ниже-идентифицированные CDR, тяжелой или легкой цепи (см. пример 3). Инженерные антитела
настоящего изобретения являются нейтрализующими антителами, т.е. они могут блокировать связывание с
рецептором IL4 протеина. Так например, антитело, происходящее из МАb 3В9, направлено против специфического третичного белкового эпитопа человеческого IL4, находящегося, как полагают, в области B-C петля
→ С-спираль, как это было отмечено выше.
Такие инженерные антитела могут включать гуманизированное антитело, содержащее каркасные участки
выбранного человеческого иммуноглобулина или субтипа, или химерное антитело, содержащее человече11
BY 4496 C1
ские константные области тяжелой или легкой цепи, слитые с функциональными фрагментами IL4 антитела.
Подходящее человеческое (или другого животного происхождения) ацепторное антитело может быть выбрано из традиционной базы данных, например базы данных KABAT, Лос-Аламоской базы данных и
Швейцарской белковой базы данных, по гомологии с нуклеотидными и аминокислотными последовательностями донорского антитела. Человеческое антитело, характеризующееся гомологией с каркасными областями донорского антитела (на аминокислотном базисе) может быть пригодным для обеспечения константной
области тяжелой цепи и/или вариабельной каркасной области тяжелой цепи для вставки донорских CDR.
Подходящее акцепторное антитело, способное быть донором константных или вариабельных каркасных областей легкой цепи, может быть выбрано аналогичным образом. Следует отметить, что тяжелые и легкие цепи акцепторного антитела необязательно должны иметь происхождение от одного и того же акцепторного
антитела.
Желательно, чтобы гетерологичные каркасные и константные области выбирались из человеческих иммуноглобулиновых классов и изотипов таких, как IgG (подтипы 1-4), IgM, IgА и IgE. Однако акцепторное
антитело необязательно должно содержать лишь человеческие иммуноглобулиновые белковые последовательности. Так например, может быть сконструирован ген, в котором ДНК последовательность, кодирующая
часть цепи человеческого иммуноглобулина слита, с ДНК-последовательностью кодирующей неиммуноглобулиновую аминокислотную последовательность, например, полипептидную эффекторную или репортерскую молекулу.
Один из примеров особенно желательного гуманизированного антитела содержит CDR 3B9, вставленные
в каркасные области последовательности выбранного человеческого антитела. В случае нейтрализующих
гуманизированных антител, один, два или, предпочтительно, три CDR из вариабельных областей тяжелой
и/или легкой цепи 1L4 антитела вставляются в каркасные области последовательности выбранного человеческого антитела, заменяя нативные CDR последнего антитела.
Предпочтительно, в гуманизированном антителе вариабельные домены как тяжелых, так и легких цепей
человека подвергаются генно-инженерным операциям путем замены одного или более CDR. Можно использовать все шесть CDR или различные комбинации из менее, чем шести CDR. Предпочтительно заменяют все
шесть CDR. Можно заменять CDR только в человеческой тяжелой цепи, используя в качестве легкой цепи
немодифицированную легкую цепь человеческого акцепторного антитела. С другой стороны совместимая
легкая цепь может выбираться из другого человеческого антитела, прибегая к помощи традиционной базы
данных антител. Оставшаяся часть инженерного антитела может быть производным любого подходящего
акцепторного человеческого иммуноглобулина.
Таким образом, генно-инженерное гуманизированное антитело предпочтительно имеет структуру природного человеческого антитела или его фрагмента и обладает комбинацией свойств, требуемых для эффективного
терапевтического использования, например, в лечении связанных с IL4 воспалительными заболеваниями людей
или для диагностического применения.
В качестве другого примера можно привести инженерное антитело, которое содержит три CDR вариабельной области легкой цепи 3В9 /SEQ 1Д 1:16, 18, 20 и 28/ и три CDR вариабельной области тяжелой цепи
3В9 /SEQ 1Д № 22, 24 и 26/.
Полученное в результате гуманизированное антитело характеризуется антиген-связующей специфичностью и высокой аффинностью MAb 3В9.
Специалистам в данной области должно быть понятно, что инженерное антитело может подвергаться дополнительным модификациям в результате изменений аминокислот вариабельных доменов, причем это необязательно должно оказывать влияние на специфичность и высокую аффинность донорского антитела (т.е.
аналога). Так например, были сконструированы гуманизированные моноклональные антитела, в которых
аминокислотный остаток в положении 120 легкой цепи представлял собой аргинин /SEQ 1Д №: 13 и 14/ или
треонин /SEQ 1Д №: 57 и 58/. Следует отметить, что аминокислоты тяжелой и легкой цепей могут быть замещены другими аминокислотами либо в вариабельном домене каркасов, либо в СDR, или в обеих указанных областях.
Кроме этого, константная область может подвергаться изменению, направленному на усиление или снижение селективных свойств молекул настоящего изобретения. В качестве примеров таких изменений можно
привести димеризацию, связывание с Fc рецепторами, или изменение способности связывать и активировать
комплемент (см., например, Angal с сотр. Mol. Immunol 30:105-108 (1993), Xu с сотр., J. Biol. Chem.
269:3469-3474 (1994), Winter с сотр., EP 307, 434-В).
Слитый протеин, представляющий собой химерное антитело, отличается от описанных выше гуманизированных антител тем, что имеет вариабельные области тяжелой и легкой цепи полностью нечеловеческого
донорского антитела, включает каркасные области, ассоциированные с человеческими иммуноглобулиновыми константными областями обеих цепей. Следует отметить, что химерные антитела, сохраняющие дополнительные не-человеческие последовательности относительно гуманизированных антител изобретения,
могут вызывать значительную иммунную реакцию у людей.
12
BY 4496 C1
Как обсуждается ниже, такие антитела полезны в профилактике и лечении связанных с действием IL4 аллергических расстройств.
Получение слитых протеинов и инженерных антител
Предпочтительно, вариабельные последовательности легкой и/или тяжелой цепи и CDR MAb 3В9 /SEQ
1Д №: 16, 18, 20, 22, 24 и 26/ или других подходящих донорских MAb (например, 6A1) и их кодирующие
нуклеиново-кислотные последовательности используются для конструирования слитых белков и инженерных антител, предпочтительно гуманизированных антител изобретения, с использованием следующего способа. Такой же или похожие методы могут использоваться для реализации других технических решений настоящего изобретения.
Гибридому, продуцирующую выбранное донорское МАb, например мышиное антитело 3В9, подвергают
общепринятому клонированию и ДНК ее вариабельных участков тяжелой и легкой цепи получают методами,
известными специалистам в данной области, например методами, описанными Sambrook с сотр., Молекулярное клонирование (Лабораторное руководство), 2-е изд., Лаборатория Колд Спринг Харбор (1989). Вариабельные области тяжелой и легкой цепи 3В9, содержащие, по крайней мере, CDR и те части вариабельного домена каркасной области легкой и/или тяжелой цепи акцепторного MAb, которые требуются для
сохранения связующей специфичности в отношении донорского MAb, а также оставшиеся иммуноглобулиновые части цепи антитела, происходящей из человеческого иммуноглобулина, получают с использованием
полинуклеотидных праймеров и обратной транскриптазы. CDR идентифицируют с использованием известной базы данных и сравнением с другими антителами.
Затем может быть получено мышь/человек химерное антитело и проведен его анализ на способность к
связыванию. Такое химерное антитело содержит VH и VL области полностью не-человеческого донорского
антитела, связанные с константными участками человеческого Ig. для обеих цепей.
Гомологичные каркасные области вариабельного участка тяжелой цепи человеческого антитела идентифицировали с использованием компьютеризированной базы данных, например, KABAT и человеческое антитело, обладающее гомологией к 3В9, выбирали в качестве акцепторного антитела. Последовательности
синтетических вариабельных участков тяжелой цепи, содержащих 3В9 СDR внутри каркасов человеческого
антитела, конструировали с необязательными заменами нуклеотидов в каркасных областях с целью введения
рестрикционных сайтов. Такую сконструированную последовательность затем синтезировали с помощью
перекрывающихся олигонуклеотидов, амплифицировали с помощью полимеразной цепной реакции (PCR) и
исправляли ошибки.
Аналогичным образом была сконструирована подходящая вариабельная каркасная область легкой цепи.
Гуманизированное антитело может происходить из химерного антитела или, предпочтительно, может
быть получено синтетически, вставкой CDR донорского MAb из тяжелых и легких цепей в выбранный каркас тяжелой и легкой цепи. С другой стороны гуманизированное антитело изобретения может быть получено
с использованием стандартных приемов мутагенеза. Таким образом, полученное в результате гуманизированное антитело содержит человеческие каркасные области и CDR донорского MAb. Могут быть осуществлены последующие манипуляции с остатками каркаса. Полученное гуманизированное антитело может быть
экспрессированo в рекомбинантных клетках-хозяевах, например, клетках СOS или CHO. Другие подробности такого метода представлены в примере 4. Другие гуманизированные антитела могут быть получены с
использованием такого метода на других подходящих IL4-специфичных, нейтрализующих, не-человеческих
антителах с высоким титром.
Традиционный вектор экспрессии или рекомбинантную плазмиду получают проводя оперативную ассоциацию таких кодирующих последовательностей для слитого белка с традиционными регуляторными контрольными последовательностями, способными контролировать репликацию и экспрессию в, и/или секрецию из, клетки-хозяина. Регуляторные последовательности включают промоторные последовательности,
например CMV промотор, и сигнальные последовательности, которые происходят из других известных антител. Аналогичным образом получают второй вектор экспрессии, содержащий ДНК последовательность,
кодирующую легкую или тяжелую цепь комплементарного антитела. Предпочтительно, такой второй вектор
экспрессии идентичен первому, за исключением тех случаев, когда кодирующие последовательности и способные к селекции маркеры предназначаются для максимально возможной функциональной экспрессии каждой полипептидной цепи.
Выбранную клетку-хозяин подвергают котрансфекции общепринятыми методами как с первым, так и со
вторым векторами или просто трансфицируют одним вектором с целью получения трансфицированной
клетки-хозяина настоящего изобретения, содержащей как рекомбинантную, так и синтетическую легкую и
тяжелую цепи. Трансфицированную клетку затем культивируют общепринятыми методами с получением
инженерного антитела изобретения. Гуманизированное антитело, включающее ассоциацию рекомбинантной
тяжелой цепи и/или легкой цепи тестируют из культуры с помощью соответствующих анализов, таких как
ELISA или RIA. Аналогичные традиционные приемы могут использоваться для конструирования других
слитых белков и молекул настоящего изобретения.
13
BY 4496 C1
Подходящие векторы для клонирования и субклонирования, а также конструкции композиций настоящего изобретения могут быть выбраны специалистами в данной области техники. Так например, могут применяться общепринятые рУС серии клонирующих векторов. Один из используемых векторов представляет собой рУС19 и он выпускается такими поставщиками, как Amersham (Букингхамшир, Великобритания) или
Pharmacia (Уппсала, Швеция). Кроме этого, любой вектор, способный легко реплицироваться, содержит
множество клонирующих сайтов и маркерных генов и в целях клонирования может легко осуществляться
любая манипуляция. Таким образом, выбор клонирующего вектора не является ограничивающим фактором
настоящего изобретения.
Аналогичным образом векторы, используемые для экспрессии инженерных антител согласно изобретению, могут быть выбраны специалистом в данной области из любого традиционного вектора.
Такие векторы также содержат выбранные регуляторные последовательности, находящиеся в оперативной ассоциации с ДНК-кодирующими последовательностями иммуноглобулиновых областей и способны
направлять репликацию и экспрессию гетерологических ДНК-последовательностей в выбранных клеткаххозяевах, например, CMV промоторы. Такие векторы содержат описанные выше ДНК-последовательности,
которые кодируют инженерное антитело слитой молекулы. С другой стороны, такие векторы могут содержать выбранные иммуноглобулиновые последовательности, модифицированные вставкой желаемых рестрикционных сайтов в целях облегчения манипуляции.
Векторы экспрессии могут также характеризоваться маркерными генами, подходящими для усиления
экспрессии гетерологичных ДНК-последовательностей, например, дигидрофолатредуктазный ген млекопитающего (ДНFР) или ген неомицин-устойчивости (neo). Другие предпочтительные векторные последовательности включают поли- А сигнальную последовательность, например бычьего гормона роста (BGH) и бетаглобинпромоторную последовательность (bеtаglopro). Используемые векторы экспрессии могут быть
синтезированы методами хорошо известными специалистам в данной области.
Компоненты таких векторов, например, репликоны, гены селекции, энхансеры, промоторы, сигнальные
последовательности и т.п. могут быть получены из природных источников или синтезированы известными
методами с целью их использования для направления экспрессии и/или секреции продукта рекомбинантной
ДНК в выбранном хозяине. Другие подходящие векторы экспрессии, многочисленные типы которых известны в данной области для экспрессии у млекопитающих, бактерий, насекомых, дрожжей и грибков, также могут быть выбраны для использования в указанных выше целях.
Настоящее изобретение также охватывает клеточную линию, трансфицированную рекомбинантной плазмидой, содержащей кодирующие последовательности инженерных антител или их слитых молекул. Клеткихозяева, используемые для клонирования и других манипуляций с такими клонирующими векторами, также
являются традиционными. Однако наиболее желательно использовать клетки различных штаммов E.coli для
репликации клонирующих векторов и других стадий конструирования слитых белков настоящего изобретения.
Подходящими клетками-хозяевами или клеточными линиями для экспрессии инженерных антител или
слитых белков изобретения, предпочтительно являются такие эукариотные клетки, как CHO, COS, фибробластная клетка (например, ЗТЗ) и миелоидные клетки, причем наиболее предпочтительной является такая
клетка млекопитающего, как CHO клетка или миелоидная клетка. Могут использоваться человеческие клетки, что позволяет модифицировать молекулу по профилям человеческого гликозилирования. Могут использоваться и другие эукариотные клеточные линии. Выбор подходящих клеток-хозяев от млекопитающих, методов их трансформации, культивирования, амплификации, скрининга, а также получения продукта и его
очистки известны из литературы. См., например, цитированную выше работу Sambrook с сотр.
Бактериальные клетки могут оказаться полезными в качестве клеток-хозяев, подходящих для экспрессии
рекомбинантных МAb настоящего изобретения. Однако в связи с тенденцией белков к экспрессии в бактериальных клетках в неуложенной или неправильно уложенной форме или в не-гликозилированной форме, любые рекомбинантные МАb, полученные в бактериальной клетке, должны быть подвергнуты скринингру на
сохранение способности связывать антиген. Если молекула, экспрессированная бактериальной клеткой, получена в правильно уложенной форме, то такая бактериальная клетка может считаться желательным хозяином. Так например, различные штаммы E.coli, используемые для экспрессии, как хорошо известно, могут
применяться в качестве клеток-хозяев в области биотехнологии. В этом методе могут также использоваться
различные штаммы B. Subtilis, Streptomyces другие бактерии и т.п.
Как известно специалистам, штаммы дрожжевых клеток также могут использоваться в качестве клетокхозяев, как и клетки насекомых, например, Drasophila и Lepidoptera, а также вирусные экспрессирующие
системы. См., например, Miller с сотр. Генная инженерия, 8:277-298, Пленум Пресс (1986) и цитированную в
этой работе литературу.
Основные методы конструирования векторов настоящего изобретения, методы трансфекции, требующиеся для получения клеток-хозяев изобретения, и методы культивирования, необходимо для получения слитого
белка или инженерного антитела настоящего изобретения из такой клетки-хозяина, являются хорошо известными приемами. Аналогичным образом, после получения, слитые белки или инженерные антитела изо14
BY 4496 C1
бретения могут быть очищены от компонентов клеточной культуры с помощью стандартных методов, включающих осаждение сульфатом аммония, очистку на аффинных колонках, хроматографических колонках,
гель-электрофорез и т.п. Эти методы известны специалистам и не ограничивают сферу изобретения.
Еще один способ экспрессии гуманизированных антител может состоять в экспрессии в трансгенном животном, в соответствии с описанным в патенте США № 4873316. Этот метод относится к экспрессирующей
системе, использующей казеиновый промотор животного, который при трансгенном введении в млекопитающее позволяет женской особи продуцировать желаемый рекомбинантный белок в ее молоке.
После экспрессии желательным методом инженерное антитело исследуют на in vitro активность с использованием соответствующего анализа. В настоящее время общепринятые схемы анализа ELISA используются для оценки качественного и количественного связывания инженерного антитела с IL4 эпитопом.
Кроме этого, другие in vitro анализы, например BIA core /Phaгmаcia/, могут также использоваться для проверки нейтрализующей эффективности перед последующим клиническом исследованием на людях, осуществляемом для оценки персистем инженерного антитела в организме человека в независимости от обычных
механизмов очистки.
Следуя методам, описанным для получения гуманизированных антител из 3В9, специалист в данной области может также сконструировать гуманизированные антитела из других донорских IL4 антител, последовательностей вариабельных областей и СDR пептидов, описанных в настоящей заявке. Инженерные антитела
могут быть получены с такими вариабельными каркасными участками, которые потенциально распознаются,
как "свои" реципиентами инженерного антитела. В вариабельной каркасной области могут быть произведены небольшие модификации с целью осуществления сильного увеличения антигенного связывания без ощутимого увеличения иммуногенности для реципиента. Такие инженерные антитела могут эффективно использоваться для лечения людей при болезненных состояниях, связанных с IL4. Эти антитела могут также
использоваться для диагностики указанных состояний.
Терапевтическое и профилактическое применения
Настоящее изобретение также относится к способу лечения людей, испытывающих аллергические нарушения, который заключается в применении эффективной дозы антител, включающей одно или более инженерных антител или слитых белков, описанных в настоящей заявке или их фрагментов.
Терапевтическая реакция, вызываемая применением молекул настоящего изобретения, возникает вследствие связывания с человеческим IL4 и последующим блокированием выделения IgE. Таким образом, молекулы настоящего изобретения в виде препаратов и рецептур для терапевтического использования весьма желательны для применения на пациентах с аллергическими нарушениями, такими как аллергический ринит,
конъюктивит, атопический дерматит, атоническая астма и анафилактический шок.
Слитые белки, антитела, инженерные антитела или их фрагменты настоящего изобретения могут также
использоваться совместно с другими антителами, особенно человеческими МАb, реактивными в отношении
других маркеров (эпитопов), ответственных за болезненное состояние, против которого направлено действие
инженерных антител изобретения. Аналогичным образом МАb, реакционноспособные в отношении эпитопов, ответственных за болезненное состояние выбранного животного, против которого направлено действие
антитела изобретения, также могут использоваться в ветеринарных композициях.
Предполагается, что терапевтические агенты настоящего изобретения окажутся полезными для лечения
аллергических состояний в течение периода времени от 2 дней до 3 недель, или по необходимости. Так например, более длительные времена лечения могут оказаться желательными при лечении сезонных ринитов и
т.п. Такой метод представляет собой значительный шаг вперед по сравнению с используемым в настоящее
время методом вливания в соответствии с известными приемами лечения нарушений, вызванных действием
IL4. Дозировка и длительность лечения зависят от относительной длительности пребывания молекул изобретения в организме человека и они могут регулироваться специалистом в зависимости от типа заболевания и
общего состояния здоровья пациента.
Тип применения терапевтического агента изобретения может быть любым, обеспечивающим доставку
такого агента в организм хозяина. Слитые белки, антитела, инженерные антитела и их фрагменты, а также
фармацевтические композиции изобретения особенно полезны при парентеральном применении, т.е. подкожно, внутримышечно, внутривенно или интраназально.
Терапевтические агенты настоящего изобретения могут быть приготовлены в виде фармацевтических
композиций, содержащих эффективное количество инженерного (например, гуманизированного) антитела
настоящего изобретения в качестве активного ингредиента в фармацевтически применимом носителе. При
профилактическом применении агента изобретения предпочитают использовать водную суспензию или раствор, содержащий инженерное антитело, предпочтительно в среде буфера при физиологическом значении
рН, в форме, готовой для инъекции. Композиции для парентерального применения обычно содержат раствор
инженерного антитела изобретения или его смесь, растворенную в фармацевтически применимом носителе,
предпочтительно в водном носителе. Может использоваться большое число водных носителей, например
0,4 % солевой раствор, 0,3 % глициновый раствор и т.п. Такие растворы должны быть стерильными и, как
правило, они не содержат мелких частиц вещества. Эти растворы могут быть простерилизованы хорошо из15
BY 4496 C1
вестными методами (например, фильтрацией). Такие композиции могут содержать фармацевтически применимые вспомогательные соединения, требующиеся для аппроксимации физиологических условий, и ими могут быть регуляторы рН, буфферные агенты и т.п. Концентрация антитела изобретения в такой фармацевтической рецептуре может изменяться в широких пределах, например, от значения менее 0,5 %, обычно, по
крайней мере 1 % до 15-20 вес. % и требуемую концентрацию выбирают основываясь на требуемом объеме
жидкости, вязкости и т.п., в соответствии с конкретным типом применения.
Так например, фармацевтическую композицию настоящего изобретения для внутримышечного вливания
готовят таким образом, чтобы она содержала 1 мл стерильной забуференной воды и 1 нг - 100 мг, как правило, 50 нг - 30 мг или, более предпочтительно, 5-25 мг инженерного антитела изобретения. Аналогичным образом, фармацевтическая композиция изобретения для внутривенного вливания должна содержать 250 мл
стерильного раствора Рингера и 1-30 мг, предпочтительно 5-25 мг инженерного антитела настоящего изобретения. Методы приготовления парентерально применяемых композиций хорошо известны специалистам
и более детально они описаны, например в Remingten's Pharmaceutical Science, 15-е изд. Мак Паблишинг
Компани, Истон, Пенсильвания.
Предпочтительно, чтобы терапевтический агент изобретения присутствовал в фармацевтическом препарате в виде единичной дозы. Соответствующая терапевтически эффективная доза может быть легко определена специалистом в данной области. Для эффективного лечения воспалительного расстройства у людей и
животных следует применять парентерально, предпочтительно, внутримышечно, единичную дозу, включающую примерно 0,1-20 мг на 70 кг веса тела белка или антитела настоящего изобретения. Такая доза, если
необходимо, может быть повторена через соответствующий период времени в ходе воспалительной реакции
в соответствии с предписаниями терапевта.
Настоящее изобретение также охватывает введение IL4 слитых белков настоящего изобретения одновременно или последовательно с другими антителами или слитыми белками, характеризующимися анти-IL4 активностью, например, фактором активности противоопухолевого некроза или другими фармацевтическими
активностями, совместимыми с IL4 рецепторной связующей способностью слитых белков изобретения. Такие другие антитела выпускаются промышленностью или могут быть сконструированы в соответствии со
способом, аналогичным описанному в настоящей заявке.
Слитые белки и инженерные антитела настоящего изобретения могут также использоваться в диагностических целях, например для определения расстройств, связанных с действием IL4 или слежения за ходом лечения таких нарушений. В качестве диагностических реагентов такие слитые белки могут быть традиционным образом помечены для использования в анализе ЕLISA и других общепринятых анализах,
предназначенных для измерения уровней IL4 в сыворотке, плазме или других соответствующих тканях. Такие анализы, где используются слитые белки, являются общепринятыми и не ограничивают сферу изобретения.
Антитела, инженерные антитела или их фрагменты, описанные в данной заявке, могут быть лиофилизированы для хранения и вновь составлены в подходящем носителе перед использованием. Было показано, что
такой прием эффективен для обычных иммуноглобулинов и известные методики лиофилизации и реконституции могут быть использованы.
Следующие ниже примеры иллюстрируют различные аспекты настоящего изобретения, включая конструирование представителей инженерных антител и их экспрессию в подходящих векторах и клетках - хозяевах, и такие примеры не ограничивают сферу изобретения. Все аминокислоты обозначены традиционными
трех-буквенным или одно-буквенным кодами. Все необходимые рестрикционные энзимы, плазмиды и другие реагенты и материалы получали из коммерческих источников, если это не оговорено особо. Все общие
методы клонирующего легирования и другие методы рекомбинантной ДНК-технологии осуществляли в соответствии с описанным в работе Т. Maniatis с сотр., цитированной выше, или вторым изданием этой книги
(1989), ред. Sambrook с сотр., тех же издателей ("Sambrook с сотр.).
Пример 1. Получение MAb 3B9
А. Методика иммунизации.
Четырех мышей (F1 гибриды ВаIb/с и С57В1/6) подкожно иммунизировали 50 мкг рекомбинантного
E.coli человеческого IL4 в полном адъюванте Фрейнда и через 4 недели проводили повторную внутрибрюшинную иммунизацию 50 мкг IL4 в неполном адъюванте Фрейнда. Основываясь на хорошем значении титра
сывороточного антитела по отношению к IL4, одну из мышей дополнительно иммунизировали через 8 недель 200 мкг IL4 (внутрибрюшинно, физиологический раствор), через два дня - 100 мкг IL4 (внутрибрюшинно, в физиологическом растворе) и спустя два дня - 50 мкг IL4 (внутрибрюшинно, в физиологическом растворе). Через два дня после финальной иммунизации проводили спленектомию.
В. Методика слияния и система скрининга.
Клетки мышиной селезенки использовали для получения гибридом (по стандартной методике, например,
описанной Kohler с сотр., Nature 256:495 (1975), из которых >250 клонов клеток подвергали скринингу на
секрецию антитела к IL4, с использованием выпускаемой промышленностью системы BIAcore и анализа
ELISA, как это описано ниже, в целях связывания IL4. В пяти лунках был получен положительный ответ.
16
BY 4496 C1
Лишь 1 клон мышей, 3В9, был сильно положительным. Все вторичные клоны, являющиеся производными 3В9
были положительными.
Пример 2. Анализы ELISA и константы аффинности
A. ELISA
Скрининговый анализ, осуществляемый в соответствии с описанным ниже, предназначался для измерения аффинности на нативный человеческий IL4. В эксперименте 1 активированные альдегидом пластины с
96 лунками покрывали IL4 в количестве 1 мкг/мл, 100 мкл/лунку в 0,1 M боратном буфере, рН 8,5 и инкубировали в течение ночи при комнатной температуре. К пластине ковалентно присоединяли hIL4. Раствор
IL4 удаляли и неспецифически связанные (NSВ) сайты блокировали 1 % бычьим сывороточным альбумином
(BSA) в ТВS буффере (50 мМ Трис, 150 мМ NaCl, 1 мМ MgCl2, 0,02 % NaN3, рН 7,4) в течение 60 минут при
37 °С. После этой и каждой из последующих стадий пластину промывали 4 раза промывным буфером (10
мМ Трис, 150 мМ NaCl, 0,05 % Твин 20, 0,02 % NaN3, рН 7,4). После этого добавляли 50 мкл гибридомной
среды (очищенный 3В9 или Fab фрагменты) и 50 мкл аналитического буфера (0,5 % бычьего гаммаглобулина в ТВS буффере) и пластины инкубировали в течение 60 минут при 37 °С. 100 мкл биотинилированного анти-мышиного антитела добавляли в каждую лунку в среде аналитического буффера и проводили
инкубацию, как описано выше. 100 мкл стрептавидина, конъюгированного со щелочной фосфатазой добавляли в лунку и проводили инкубацию (30 минут при 37 °С). Добавляли 100 мкл/лунку PNP и проводили инкубацию в течение 30 минут при 37 °С. Показания снимали по оптической плотности при длине волны 405 нм.
В эксперименте 2 покрытые стрептавидином пластины (100 мкл/лунку, 1 мкг/мл в фосфатном буферном
растворе (PBS)) инкубировали в течение ночи при 4 °С и анализировали, как описано ниже. Стрептавидиновый раствор удаляли, NSВ сайты блокировали 1 % BSA в TBS буффере (60 минут при 37 °С). После этой
стадии и каждой из последующих стадий пластины четыре раза промывали промывным буфером 50 мкл
биотинилированного IL4 добавляли совместно с 50 мкл аналитического буфера и систему инкубировали в
течение 30 минут при 37 °С. После этого добавляли 50 мкл очищенного 3В9 IgG или Fab фрагмент (или гибридомную среду) плюс 50 мкл аналитического буфера и проводили инкубацию в течение 60 минут при
37 °С. Добавляли 100 мкл антимышиного IgG-щелочно-фосфатазного конъюгата и проводили инкубацию в
течение 60 минут при 37 °С. Добавляли 100 мкл PNP субстрата и проводили инкубацию в течение 30 минут
при 37 °С. Отсчет показаний проводили, как описано выше.
В. Расчет 3В9 аффинности к IL4.
Используя результаты описанных выше экспериментов и суммируя их, как описано ниже, рассчитывали
Kd для 3В9 в соответствии с методом Beaty с сотр., J. Immunol Methods, 100:173-179 (1987):
1
K aff =
,
2(2 Ab x − [Ab]
Аbх = концентрация связанного Аb при 150 нг/мл биотинилированного h IL4,
Ab = концентрация связанного Ab при 300 нг/мл биотинилированного h IL4.
Константы диссоциации рассчитывали из следующего соотношения:
1
Kd =
.
K aff
Эксперимент 1: анализ ELISA на пластине с 96 лунками, покрытой стрептавидином (100 нг/лунку).
Kd = 2,2×10-10 M (3В9 Fab).
Эксперимент 2: анализ ELISA на пластине с 96 лунками, покрытой стрептавидином (100 нг/лунку).
Kd = 1,4×10-10 M (3В9 IgG).
С. Специфичность.
МАb 3В9 распознает человеческий IL4, но не распознает бычий или мышиный IL4. Один из путей определения такого явления состоит в следующем. Анализ ELISA может быть осуществлен с использованием
пластины с 96 лунками, покрытой анти-мышиным IgG и затем заблокированной бычьим сывороточным альбумином, на которой 50 мкл 3В9 (100 нг/мл), 25 мкл не-человеческого IL4 и 25 мкл биотин-IL4 инкубировали в течение 60 минут при 37 °С, после чего проводили промывку стрептавидином, конъюгированным с щелочной фосфатазой и РNР.
Аналогичным образом было установлено, что MAb 6A1 не распознает бычий или мышиный IL4.
Пример 3. Гуманизированное антитело
Одно гуманизированное антитело конструировали таким образом, чтобы оно содержало мышиные CDR
внутри каркаса человеческого антитела. Такую гуманизированную версию IL4 специфичного мышиного антитела 3В9 готовили путем осуществления следующих манипуляций.
А. кДНК клонирование.
Клоны кДНК получали из мРНК 3В9 тяжелых и легких цепей, экстрагированной из 3В9 гибридомной
клеточной линии (пример 1), с использованием набора Воеhringer Mannheim, Праймеры, специфичные как
на мышиный шарнирный участок, так и на каппа-константную область использовали для синтеза первой нити.
[ ]
17
BY 4496 C1
Праймер каппа цепи представляет собой /SEQ 1Д 1:29/:
Праймер тяжелой гамма-цепи представляет собой /SEQ 1Д №: 30/:
Двух-нитевую кДНК клонировали непосредственно в плазмиде рGЕМ7f + /Pгоmega/, которыми затем
трансформировали Е.соli ДН5-а /Bethesda Research Labs/.
В. Секвенирование ДНК.
кДНК клонов восьми мышиных тяжелых и одной легкой цепи мышиных из Части А подвергали секвенированию. Результаты секвенирования вариабельных областей таких клонов показаны в SEQ 1Д №: 1, 2, 3 и 4.
Каждый клон содержал аминокислоты, известные как консервативные среди вариабельных районов мышиных тяжелых цепей или легких цепей, и мышиные сигнальные последовательности. Аминокислотные последовательности CDR перечислены ниже.
CDR области тяжелой цепи представляют собой SEQ 1Д №: 22, 24 и 26 (аминокислоты 50-56, 71-86 и
119-129 последовательности SEQ 1Д №: 4), см. фиг. 2. Такие последовательности закодированы последовательностями SEQ 1Д №: 21, SEQ 1Д №: 23 и SEQ 1Д №: 25 соответственно. CDR области легкой цепи представляют собой SEQ 1Д №: 16, 18 и 20 (аминокислоты 45-58, 74-80 и 113-121 последовательности SEQ 1Д
№: 2), см. фиг. 1. Такие последовательности закодированы последовательностями SEQ 1Д №: 15, 17 и 19,
соответственно.
С. Отбор человеческих каркасов.
После клонирования 3B9, аминокислотные последовательности вариабельной области (аминокислоты 21132 SEQ 1Д №: 2 и аминокислоты 20-140 SEQ 1Д №: 4) сравнивали с базой данных последовательностей
человеческого иммуноглобулина, с использованием баз данных KABAT и SWISS с целью идентификации
человеческого каркаса как для тяжелой, так и для легкой цепи, которые наиболее близко совместимы с мышиным источником по гомологии последовательности. Помимо этих исследований по гомологии последовательности, легкие и тяжелые цепи также оценивали относительно позиционной базы данных, разработанной
из структурных моделей Fab домена с целью определения потенциальных конфликтов, связанных с заменами аминокислот,' которые могут оказывать влияние на CDR представление. В настоящем случае структурными исследованиями не было обнаружено очевидных конфликтов; поэтому использовали ДНК кодирование, выведенное на основании исследований гомологии аминокислотной последовательности.
Использовали каркасные области тяжелой цепи антитела, полученного из человеческого миеломного иммуноглобулина (СОR) (EM. Press, NM. Hogg Biochem. J 117:641-660 (1970)). Такая последовательность оказалась примерно на 77 % гомологичной (69,4 % идентичность) 3В9 вариабельной области цепи на аминокислотном уровне.
Для подходящей вариабельной каркасной области легкой цепи использовали вариабельную каркасную
последовательность легкой цепи человеческого антитела, идентифицированную H G. Klobeck с сотр., Nucl.
Acid. Res. 13:6515-6529 (1985). Было установлено, что последовательность человеческого антитела примерно на 80,2 % гомологична (идентичность 72,0 %) мышиной вариабельной области легкой цепи на аминокислотном уровне.
Используя мышиные 3В9 CDR /SEQ 1Д №: 15-26/ и последовательность человеческого антитела, получали синтетическую тяжелую цепь и осуществляли PCR для амплификации ДНК. Такие последовательности
синтезировали с помощью следующих перекрывающихся олигонуклеотидов и амплифицировали с помощью
PCR. SEQ 1Д №: 31-37 предусматривает пять перекрывающихся олиго и 2 PCR праймера. Олиго 1 /SEQ 1Д
№: 31/, как установлено, содержит основания 5-121. Олиго 2 /SEQ 1Д №: 32/ содержит основания в диапазоне 122-241, а олиго 3 /SEQ 1Д №: 33/ содержит основания 242-361. Два нижних нитевых праймера SEQ 1Д
№: 34 и SEQ 1Д №: 35 содержат основания 134-110 и основания 134-110 и основания 253-230. Все ошибки в
картированной последовательности, которые были внесены PCR были исправлены. PCR осуществляли снова
с использованием в качестве 5' праймера нуклеотиды 1-25 SEQ 1Д №: 36, а в качестве 3' -праймера - нуклеотиды 361-341 последовательности SEQ 1Д №: 37.
Синтетический вариабельный участок легировали в экспрессирующий вектор рСD совместно с синтетической сигнальной последовательностью SEQ 1Д №: 5 и 6 из химерной конструкции тяжелой цепи совместно с IgG1 человеческой константной областью. Синтетическая VН и нуклеотидная и аминокислотная последовательности сигнальной последовательности представлены на рис. 4 /SEQ 1Д № №: 11 и 12/.
Аминокислотные последовательности CDR /SEQ 1Д №: 22, 24 и 26/ идентичны мышиным 3В9 ВДR. Однако
кодирующие последовательности для CDR /SEQ 1Д №: 54, 55 и 56/ отличаются от мышиных 3В9 кодирующих последовательностей /SEQ 1Д № №: 21, 23 и 25/. Полученный в результате вектор экспрессии, IL4hzhc
1-1-Pcd показан на рис. 9.
CDR генные области пресуществующего каркаса легкой цепи удаляли рестрикционным перевариванием
и заменяли на следующие синтетические IL4 CDR гены, которые получали синтетическим путем.
Для CDR 1:
18
BY 4496 C1
Синтетическая VL и нуклеотидная и аминокислотные последовательности сигнальной последовательности показаны на фиг. 5 /SEQ 1Д №: 13 и 14/. Аминокислотные последовательности двух первых СDR /SEQ
1Д №: 16 и 18/ идентичны соответствующим мышиным 3В9 CDR. Однако кодирующая последовательность
для первого CDR /SEQ 1Д №: 53/ отличается от мышиной 3В9 кодирующей последовательности /SEQ 1Д №:
15/. Кроме этого в последнем CDR были созданы две гуманизированные конструкции 3В9 аминокислотной
последовательности. Одна из них /SEQ 1Д №: 28/ отличается по сигнальной аминокислотной /SEQ 1Д №: 20/
от нативной мышиной 3В9 последовательности. SEQ 1Д №: 28 закодирована последовательностью SEQ 1Д
№: 27. Синтетические вариабельные легкие области легировали в вектор экспрессии совместно с сигнальной
последовательностью /SEQ 1Д № №: 7 и 8/. Один из полученных векторов экспрессии, IL4hzicl -O-Рсn показан на фиг. 10.
Такие синтетические вариабельные последовательности легкой и/или тяжелой цепи используются при
конструировании гуманизированного антитела.
Пример 4. Экспрессия гуманизированного MAb в клетках COS и CHO
р UC18 субклоны для VH получали таким образом, чтобы добавить сигнальную последовательность, первоначально полученную от человеческого антитела SEQ 1Д №: 5. Для VL получали субклоны р UC18 с целью добавления сигнальной последовательности SEQ 1Д №: 7.
Гуманизированная тяжелая цепь, являющаяся производным IgG1 изотипа, проявляет 89:3 % гомологию
(идентичность 84,3 %), на аминокислотном уровне, к мышиной тяжелой цепи от 3В9. Синтетическая VH
обеспечена аминокислотами 20-141 последовательности SEQ 1Д № №: 11 и 12. Гуманизированная легкая
цепь, человеческая каппа-цепь, демонстрирует 92,0 % гомологию (идентичность 86,6 %) с 3В9 на аминокислотном уровне. Синтетическая VL /аминокислоты 21-131 последовательности SEQ 1Д № №: 13 и 14/, содержащая 3В9 CDR была сконструирована и синтезирована в соответствии с описанным для синтетических тяжелых цепей.
Фрагменты ДНК, соответствующие сигналы которых связаны с вариабельными участками как гуманизированной тяжелой, так и легкой цепи вставляли р UC19 - основанные экспрессирующие плазмиды клеток
19
BY 4496 C1
млекопитающих, содержащие СМУ промоторы и константные области человеческой тяжелой или легкой
цепи химеры, полученной в примере 5, используя для этого традиционные методы /Maniatis, цитированная
выше/ с получением плазмид IL4hzhcl - IPcd (тяжелая цепь) /фиг. 9/ и IL4hzlcl - oPcn) (легкая цепь) /фиг. 10/.
Плазмиды HZHC и HZLC котрансфицировали в клетки COS и супернатанты анализировали методом ELISA
на присутствие гуманизированного антитела через 3 и 5 дней. Другое гуманизированное антитело конструировали с использованием IgG4 изотипа.
В представленном примере описывается получение инженерного антитела. Другие методики могут использоваться для создания других инженерных антител с использованием других анти-IL4 антител (например, 6A1 - пример 7), полученных традиционными методами.
Пример 5. Конструирование химерного антитела
А. Химерную тяжелую цепь конструировали путем выделения мышиного вариабельного участка тяжелой
цепи из оригинального мышиного МАb 3В9 в виде EcoR1 – BstE11 рестрикционного фрагмента. Конструировали и синтезировали небольшой олигомер ДНК для соединения мышиного вариабельного участка с человеческой IgG1 константной областью (BstE11 – Apa1):
Два таких фрагмента легировали в плазмиду рСD (см. рис. 7) (расщепленную с ЕсоR1 и Apa1), которая
уже кодирует человеческий IgG1 константный участок. Такой клон не экспрессировался, поэтому 5' UTP дикого типа и сигнальную последовательность делетировали и заменяли на SEQ 1Д №: 5 и 6.
Поскольку традиционный рестрикционный эндонуклеазный сайт не доступен на 3' окончании сигнальной
последовательности, вводили Bst E11 сайт (т.е. молчащая мутация) с помощью PCR. Использовали следующие PCR праймеры:
Затем из такой плазмиды выделяли Bst E11-Pst1 рестрикционный фрагмент. Затем конструировали и синтезировали новую сигнальную последовательность и 5'UTP, содержащие ЕсоR1 и Bst E11 концы.
Химерную легкую цепь конструировали с применением техники PCR к исходной мышиной 3В9 легкой
цепи, которую клонировали в pGEM72f ( + ) /Progema/. Используемые праймеры представляли собой выпускаемые промышленностью р UC18 универсальный обратный праймер на 5' конце (ЕсоR1) и 3' праймер, вводящий сайт Narl:
используемый для слияния мышиного вариабельного участка с человеческим константным участком. Затем такую вариабельную область легировали в экспрессионный вектор pCDN (ЕсоR1 Narl) (рис. 8), который
уже содержал человеческую каппа-область.
Через 3 и 5 дней собирали супернатанты и проводили аналин методом ELISA, описанным ниже: пластины ELISA покрывали 0,1 мкг козьего антитела, специфичного на Fc область человеческих антител. Супернатанты среды добавляли в течение часа. Добавляли пероксидазу хрена, конъюгированную с козьим антителом, специфичным на полное человеческое IgG антитело. После этого в течение часа добавляли ABTS
пероксидазный субстрат (Киркегаард и Перри Лабораторис Инк., Гайтерсбург, МД). Детектировали экспрессию химерного антитела. Во втором анализе ELISA COS клеточные супернанты, содержащие химерное антитело, специфически связывались с рекомбинантным человеческим IL4 протеином. Этот результат подтверждает тот факт, что гены кодирующие антитело специфичное на IL4 подвергались клонированию.
В. Гуманизированная тяжелая цепь может быть также получена из такой химерной тяжелой цепи. Гуманизированную тяжелую цепь конструировали вставкой мышиных CDR в человеческий каркас. Использовали
тот же человеческий каркас, что описан выше, наиболее гомологичная протеиновая последовательность в
Швейцарской базе данных протеинов на мышиную 3В9 VН (аминокислоты 20-140 последовательности SEQ
1Д №: 4). Такую гуманизированную последовательность тяжелой цепи (ЕсоR1 Apal) получали синтетическим путем и осуществляли PCR с целью амплификации ДНК, в соответствии с описанным выше. Синтетическую вариабельную область легировали в экспрессирующий вектор pCD (ЕсоR1 Apal) совместно с синте20
BY 4496 C1
тической сигнальной последовательностью SEQ 1Д №: 5 и 6 из химерной конструкции тяжелой цепи и IqG1
человеческого константного участка.
Аналогичным образом гуманизированная легкая цепь может быть получена из химерной легкой цепи, в
соответствии с описанным выше для тяжелой цепи. Этот ген (ЕсоRV Nаrl) получали также синтетическим
путем. Гуманизированный VL легировали в экспрессирующий вектор рСN, переваренный в присутствии
ЕсоR1 Narl, совместно с сигнальной последовательностью (ЕсоR1 ЕсоRV). Вектор экспрессии содержал человеческую каппа константную область.
Пример 6. Очистка и термодинамика гуманизированного МАb
Очистка CHO экспрессированного химерного и гуманизированного 3В9 может достигаться традиционными методами белковой А (или G) аффинной хроматографии с последующим применением ионообменной
хроматографии и гель-фильтрации. Аналогичные методы с успехом использовались для очистки до чистоты
>95 % других MAb (например, респираторного синцитиального вируса и малярийных циркумспорозоитных
антигенов).
Аффинность и подробная термодинамика IL4 связывания с гуманизированным MAb 3В9 и мышиным
3В9 (пример 1) определяли методом микрокалориметрического титрования. В этом методе измеряются реакции связывания по их внутренним теплотам реакции (см., например, Wiseman с сотр., Anal. Biochem.
179:131-137 (1989). Аффинность обоих МАb оказалась настолько прочной, что не было возможности провести измерения при окружающей температуре. Тогда был применен термодинамический подход: I) аффинность измеряли при 60 °С, когда она достаточно слаба и поддается прямому измерению; и II) снимали температурную зависимость энтальпии связывания при 30-60 °С. Совместно полученные результаты позволили
рассчитать аффинность в широком температурном интервале с использованием уравнения ГиббсаГельмгольца.
Результаты термодинамики IL4 связывания для гуманизированного и мышиного 3В9 антител представлены в таблице 1. На основании различий в свободной энергии, энтальпии, энтропии и теплоемкости двух
таких МАb можно сделать вывод о неразличимости их термодинамического поведения.
Таблица 1
Термодинамика связывания IL4 с гуманизированным 3В9 и мышиным 3В9
при рН 7,4, 150 мМ NaCl, 25 °С
МАb
Kd, пикомоль
∆ H, ккал/моль
IL4
∆ G, ккал/моль
IL4
-T∆S, ккал/моль
IL4
∆C, кал/моль
114 °K
Гуманизиро11
-13,6±0,6
-21,8±2
8,2±2,1
-580±160
ванное 3В9
мышиное 3В9
19
-13,3±0,6
-20,5±1
7,2±1,2
-660±200
IL4 аффинности гуманизированного 3В9 и мышиного 3В9 измеряли повторением операций 4 и 2 раза соответственно.
Пример 7. Получение характеристики крысиного МАb
МАb 6A1, выбранное для высоко-аффинного связывания, получали от иммунизированной крысы с использованием протокола иммунизации, описанного для мышей в примере 1. 6A1 выбирали из гибридом
(конкретно, гибридома 3426А11С1В9), полученных от крыс, иммунизированных человеческим IL4.
Kd для 6A1 рассчитывали в соответствии с описанным Beaty с сотр. J. Immunol. Methods 100:173-179
(1987) и полученное значение было равно 2×10-10 M.
Гибридома 3426А11С1В9 депонирована 6 октября 1993 г. в Европейской коллекции культур клеток животных (ECACC), Лаборатория здравоохранения сервисного центра по прикладной микробиологии и исследованиям, Портон Даун, Салисбури, Вильтшайр, SP4 01G, Великобритания, под каталожным номером
93100620 и акцептирована как патентный депонент в соответствии с Будапештским договором 1977 г., регулирующим депонирование микроорганизмов в целях патентования.
Пример 8. Биологическая активность MAbs: 3В9 (гуманизированного) 3В9 (мышиного) и 6A1.
Следующие ниже анализы проводили с использованием описанных ниже методик.
А. Связывание с гликозилированным rh IL4.
Указанные выше антитела индуцировали к не-гликозилированному рекомбинантному человеческому IL4
(rh IL4), которое продуцировали в E.coli. Поскольку нативный человеческий IL4 является гликозилированным, важно подтвердить связыванием с материалом, секретированным клеточной линией млекопитающих.
3В9 в одинаковой степени хорошо присоединяется как к гликозилированному, так и к негликозилированному человеческому рекомбинантному IL4 и поэтому направлен к эпитопу, который может
быть замаскирован на природном человеческом IL4.
В. Ингибирование IL4 связывания с рецептором.
Способность 3В9 ингибировать связывание IL4 с его рецептором изучалась с использованием 125I – rh IL4
связывания с клеточной линией гибона, MLA /ATCC Т1В201/, которая несет примерно 6000 рецепторов в
расчете на клетку. MLA клетки инкубировали с 125I-IL4 в течение 30 минут при 37 °С. Поглощение радиоак21
BY 4496 C1
тивности определяли в гамма-счетчике после отделения клеточно-связанного 125I-IL4 центрифугированием
через масляный градиент. He-специфическое связывание определяли инкубацией в присутствии 100кратного молярного избытка немеченного IL4 /Park с сотр., J. Exp. Med. 166:476-488 (1987)/. Значение IC50
для немеченного IL4 в таком анализе составило 22 пМ при количестве добавленного IL4 83 пМ. Для интактного мышиного (IqG) 3В9 значение IC50 составило 63 пМ и 93 пМ для Fab фрагмента. При другой концентрации IL4 (218 пМ) полученное в анализе количество для мышиного (IgG) 3В9 составило 109 пМ.
С. Ингибирование пролиферации лимфоцитов.
С использованием метода, описанного Spits с сотр., J. Immunol. 139:1142-1147 (1987), человеческие периферические лимфоциты крови инкубировали в течение трех дней в присутствии фитогемаглютинина, Тклеточного митогена, с целью активации IL4 рецептора. Полученные в результате бластоидные клетки затем
стимулировали в течение трех дней с помощью IL4. Пролиферацию измеряли внедрением 3H тимидина.
Пролиферацию В-клеток измеряли методом анализа согласно Callard с сотр., Лимфокинез и интерфероны.
Практический подход, гл. 19, стр. 345, при следующих модификациях. Очищенные В-клетки человеческих
миндалин стимулировали в течение 3 дней с помощью IL4 и иммобилизованного анти-IgM. Пролиферацию
измеряли внедрением 3H тимидина.
Мышиный 3В9 ингибировал внедрение 3Н-тимидина в человеческие перефирические Т-лимфоциты крови, стимулированные 133 пМ IL4, и в В-лимфоциты человеческих миндалин, стимулированные 167 пМ IL4.
IL2 - стимулированные Т-лимфоциты не подвергались воздействию. Значение IC50 для ингибирования пролиферации T-клеток составило 30 пM, а для пролиферации В-клеток – 103 пМ. Соответствующие значения
для Fab фрагмента мышиного 3В9 составили 108 и 393 пМ.
Д. Ингибирование СD23 индукции.
СD23 представляет собой низко-аффинный рецептор IgE (FcER11) и индуцируется на мембране Влимфоцитов низкими концентрациями IL4, что является необходимой предпосылкой для IgE продуцирования. Очищенные В-клетки человеческих миндалин стимулировали в течение 2 дней с помощью IL4. Процентное количество клеток, экспрессирующих CD23 рецептор, определяли методом проточной цитометрии
/Defrance с сотр., J. Exp. Med. 165:1459-1467 (1987)/. Мышиный 3В9 ингибировал СD23 экспрессию на Влимфоцитах человеческих миндалин, стимулированных 8,3 пМ IL4 при значении IС50 136 пМ.
E. Ингибирование IgE секреции.
В отличие от других анализов, в которых IL4 добавляли при EC50 концентрациях /Pere с сотр., Proc. Natl.
Acad. Sci. 85:6880-6884 (1988), IgE секрецию исследовали в присутствии концентраций IL4, обеспечивающих
максимальную секрецию с тем, чтобы уменьшить вариабельность, присущую такой системе. Пролиферацию Тклеток измеряли следующим образом. Человеческие лимфоциты периферической крови инкубировали с IL4 в
течение 10-18, предпочтительно 12 дней. Концентрацию IgE в супернатанте культуры определяли методом
ELISA.
IgE секреция ингибировалась мышиным 3В9 и Fab фрагментом 3В9 в присутствии 1,7 нМ IL4, давая значение IС50 1,9 и 5,0 нМ, соответственно. Эксперимент повторяли с использованием более низкой концентрации IL4, 667 пМ, что понижало значение IС50 до 0,65 нМ в случае мышиного 3В9. В изученных концентрационных пределах молярное соотношение антитела (IgC) к IL4 оставалось неизменным (1:1).
F. Резюме и интерпретация данных.
Молярные соотношения IL4 к различным МАb, требуемые для 50 % ингибирования функции в биоанализах представлены в таблице 2.
Таблица 2
Сравнительная активность МАb 389, 6A1 и гуманизированного 3В9
/IgG1 и IgG4 варианты/ в IL4 - зависимых биоанализах
IС50 /пМ/ /интервал/
Анализ
Мышиное 3В9
Мышиное 3В9 (Fab) Крысиное 6A1
Гуманизированное 3В9
IgG1
IgG4*
RBA
63/17-109/2
93
50000
Т-клетка
30/10-40/4
108
87
44/30-56/3
40
В-клетка
103/79-120/3
393
187
47/10-80/3
79
индукция
136/53-272/4
216
80
333
СD23
синтез
658/370-1070/6
1170
623/412-833/2
54/35-83/3
406
IgE
= число независимых опытов.
*IgG1 и IgG4 варианты испытывали в различное время.
Во всех анализах, за исключением IgE секреции, IL4 добавляли с примерно ЕД50 концентрацией. Молярные соотношения между антителом и IL4, требуемые для 50 % ингибирования, близки для гуманизированно22
BY 4496 C1
го 3В9, мышиного 3В9 и 6A1 в двух анализах по пролиферации лимфоцитов, но выше для гуманизированного 3В9 в СD23 индукционном анализе. Последний анализ является особенно чувствительным, требующим
очень низких (5 %) степеней занятости рецептора (Кruze с сотр., EMBO J, 12:5121, 1993) и, как видно из результатов, полученных при использовании мышиного 3В9, и в связи с этим подвержен аналитическим вариациям.
Сравнение активностей крысиного 6A1 и мышиного 3В9 демонстрирует аналогичную картину функциональных эффектов, а также неожиданную неспособность 6Al полностью ингибировать связывание радиоиодированного IL4 с его рецептором. Предполагается, что радиоиодированный IL4, используемый в рецепторно-связующем анализе, иодирован по доступному тирозину, остатку 124. При сравнении способности 6A1
ингибировать СD23 экспрессию, индуцированную немеченным или иодированным IL4, было обнаружено,
что ингибирование менее эффективно в случае иодированного лиганда. Эти результаты показывают, что 6A1
связывается с IL4 в области тирозина 124, но без специфичности к этому остатку.
Таким образом, полученные данные показывают, что 6A1 представляет собой нейтрализующее антитело
высокой аффинности, способное связываться с совершенно другим участком IL4, чем 3В9.
Пример 9. Фармакокинетика
Фармакокинетические свойства гуманизированного 3В9 изучали на самцах крыс разновидности Sprague
Dqwley. Гуманизированное 3В9 применяли на четырех животных в виде iv шаровидной массы с дозировкой
1 мг/кг, причем отбор образцов крови продолжали в течение 5 недель после применения. Концентрацию гуманизированного 3В9 в плазме определяли с использованием IL4/анти-человеческой IgG сэндвичевой
ЕLISА, предназначенного подтвердить не только наличие циркулирующего человеческого IgG, но также его
способность связываться с рекомбинантным человеческим IL4.
Полученные результаты суммированы в таблице 3.
Таблица 3
Фармакокинетика гуманизированного 3В9 на самцах крыс Sprague - Dawley
(доза: 1 мг/кг в пилюле)
CIp (мл /ч. /кг)
Крыса 1
0,442
Крыса 2
0,655
Крыса 3
0,555
Крыса 4
0,447
Среднее значение
0,525
Среднеквадратичное отклонение
0,101
Принято следующее сокращение фармакокинетического параметра: CIp, кажущееся очищение плазмы.
Полученные данные показывают, что вариабельность между животными относительно мала и исчезновение гуманизированного 3В9 из плазмы, по-видимому, является двухфазным. Кажущееся очищение плазмы было низким (0,5 мл/час/кг). Период полураспада составлял 11 дней. Таким образом, фармакокинетические характеристики гуманизированного 3В9, являющегося производным CHO клеток, согласуется с другими
гуманизированными моноклональными антителами у крыс. Длительный период циркуляционного полувыведения гуманизированного 3В9 у крыс также позволяет предположить, что при применении на людях гуманазированное 3В9, по-видимому, будет эффективным в течение длительного периода времени.
Многочисленные модификации и вариации настоящего изобретения охватываются приведенным выше
описанием и они должны быть очевидны для специалистов в данной области. Так например, человеческие
каркасные области или их модификации, отличные от приведенных выше примеров антител, могут использоваться для конструирования гуманизированных антител. Такие модификации и изменения композиций и
способов настоящего изобретения охватываются сферой прилагаемой формулы изобретения.
23
BY 4496 C1
СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
24
BY 4496 C1
25
BY 4496 C1
26
BY 4496 C1
27
BY 4496 C1
28
BY 4496 C1
29
BY 4496 C1
30
BY 4496 C1
31
BY 4496 C1
32
BY 4496 C1
33
BY 4496 C1
34
BY 4496 C1
35
BY 4496 C1
36
BY 4496 C1
37
BY 4496 C1
38
BY 4496 C1
39
BY 4496 C1
40
BY 4496 C1
41
BY 4496 C1
42
BY 4496 C1
43
BY 4496 C1
44
BY 4496 C1
45
BY 4496 C1
46
BY 4496 C1
47
BY 4496 C1
48
BY 4496 C1
49
BY 4496 C1
50
BY 4496 C1
51
BY 4496 C1
52
BY 4496 C1
53
BY 4496 C1
54
BY 4496 C1
55
BY 4496 C1
56
BY 4496 C1
57
BY 4496 C1
58
BY 4496 C1
Фиг. 1
59
BY 4496 C1
Фиг. 2
60
BY 4496 C1
Фиг. 3
61
BY 4496 C1
Фиг. 4
62
BY 4496 C1
Фиг. 5
63
BY 4496 C1
Фиг. 6А
Фиг. 6В
Фиг. 7
Фиг. 8
64
BY 4496 C1
Фиг. 9
Национальный центр интеллектуальной собственности.
220072, г. Минск, проспект Ф. Скорины, 66.
65
Фиг. 10
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
0
Размер файла
994 Кб
Теги
4496, патент
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа