close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Патент BY 5591

код для вставкиСкачать
ОПИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ПАТЕНТУ
РЕСПУБЛИКА БЕЛАРУСЬ
7
(51) C 12P 21/08,
(12)
НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР
ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ
СОБСТВЕННОСТИ
(54)
BY (11) 5591
(13) C1
(19)
C 12N 15/16, 5/22,
A 61K 39/395,
C 07K 16/00
МОНОКЛОНАЛЬНОЕ АНТИТЕЛО, ОБЛАДАЮЩЕЕ СВОЙСТВОМ
ВЫЗЫВАТЬ АПОПТОЗ МИЕЛОИДНЫХ КЛЕТОК КОСТНОГО
МОЗГА, ЕГО F(ab)2 ФРАГМЕНТ И ГИБРИДОМА
(21) Номер заявки: 960567
(22) 1996.03.01
(86) PCT/JP94/01453, 1994.09.02
(31) 5/242110 (32) 1993.09.03 (33) JP
(46) 2003.12.30
(71) Заявитель: Чугай Сейяку Кабусики
Кайся (JP)
(72) Автор: ФУКУШИМА, Наоши (JP)
(73) Патентообладатель: Чугай Сейяку Кабусики Кайся (JP)
(57)
1. Моноклональное антитело, способное распознавать антиген, вызывающий апоптоз
миелоидных клеток костного мозга, получаемое с использованием стромальных клеток
селезенки животных, которым вводили рекомбинантный гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (rG-CSF), и обладающее свойством вызывать апоптоз миелоидных
клеток.
2. Моноклональное антитело по п. 1, отличающееся тем, что представляет собой IgG.
3. Моноклональное антитело по п. 1, отличающееся тем, что получено с использованием человеческих спленоцитов стромальных клеток в качестве антигена.
4. Моноклональное антитело по п. 1, отличающееся тем, что представляет собой
BMAP-1, продуцируемое гибридомой FERM BR-4382.
5. F(ab)2 фрагмент моноклонального антитела по п. 1, обладающий свойством вызывать апоптоз миелоидных клеток.
6. Гибридома FERM BR-4382, продуцирующая моноклональное антитело по п. 1.
BY 5591 C1
(56)
STEPHEN A. CANNISTRA et al. // J. Exp. Hematol. . - 1988. - № 16. - V. 10. - P. 865-870.
Фиг. 1
BY 5591 C1
Изобретение относится к новым моноклональным антителам, обладающим способностью вызывать апоптоз миелоидных клеток и которые могут в этой связи рассматриваться
как полезные лекарственные средства для применения в случае миелоцидного лейкоза, а
также к фрагментам таких антител, кроме того, изобретение относится к гибридоме, продуцирующей моноклональные антитела.
Поскольку моноклональные антитела по настоящему изобретению используются в качестве антител, специфически распознающих и идентифицирующих антигены, которые
вызывают апоптоз миелоидных клеток, сами обладают способностью вызывать апоптоз
миелоидных клеток, то на основе использования этих свойств они могут рассматриваться
как лекарственные средства, эффективные для применения в случае миелоцидного лейкоза.
Гранулоцитарные колониестимулирующие факторы, такие как, например, рекомбинантные гранулоцитарные колониестимулирующие факторы (rG-CSF), были известны
вначале как гуморальные факторы, стимулирующие дифференциацию и пролиферацию
гранулоцитарных клеток, при этом в экспериментах на мышах in vivo было показано, что
введение rG-CSF стимулирует гемопоэз в костном мозге и, кроме того, вызывает выраженный экстрамедуллярный гемопоэз, осуществляемый в селезенке при пролиферации
гемопоэтических стволовых клеток и всех клеток-предшественников, имеющихся в процессе кроветворения в селезенке. Считается при этом, что механизм гемопоэза в селезенке,
будучи экстрамедуллярным по своей природе, осуществляется благодаря модификациям в
микросреде в процессе кроветворения в селезенке, которые возникают в связи со стимулирующим действием rG-CSF, повышающим гемопоэтический потенциал.
В соответствии с этим авторы настоящего изобретения исследовали стромальные
клетки селезенки, в которые был введен rG-CSF, с целью определения уровня гемопоэтического потенциала в селезенке, далее установили гемопоэтическую клеточную линию
стромы (CF-1 клетки) из селезенки мышей, которым был введен rG-CSF, для исследования существования факта повышения гемопоэтического потенциала под действием стромальных клеток, содержащих введенный rG-CSF, и с применением гемопоэтических
стромальных клеток показали потенциальный эффект на гемопоэз и, наконец, определили
колониестимулирующую активность in vitro, a также способность поддерживать гемопоэтические стволовые клетки in vitro (Blood, 80, 1914, 1992).
Однако, хотя на основе ряда стромальных клеток селезенки удалось получить клеточные линии (CF-1 клетки) и определить их цитологические характеристики, до сих пор еще
не были получены специфические антитела, распознающие клеточную поверхность их
антигенов, как не известны до настоящего времени и характеристики таких антител.
В этой связи, на основе использования приведенной выше информации, касающейся
стромальных клеток селезенки, а также результатов проведенных исследований, авторы
настоящего изобретения провели исследование с целью получения специфических антител, способных распознавать стромальные клетки селезенки, и получения далее моноклональных антител с использованием стромальных клеточных линий селезенки в качестве
антигенов для иммунизации, в результате чего были получены новые, не известные ранее
моноклональные антитела.
В ходе изучения свойств полученных моноклональных антител авторы неожиданно
обнаружили, что упомянутые антитела обладают способностью вызывать апоптоз миелоидных клеток, и этот факт явился основой исследований, составивших предмет настоящего изобретения.
Задачей настоящего изобретения является создание новых моноклональных антител,
обладающих способностью вызывать апоптоз миелоидных клеток и в этой связи применимых для лечения миелоцидного лейкоза, кроме того, получение их фрагментов, а также
гибридомы, способной к продуцированию моноклонального антитела.
Моноклональное антитело по настоящему изобретению является полезным в качестве
антитела, распознающего антигены, вызывающие апоптоз [который называют также са2
BY 5591 C1
моразрушением клеток - явление, при котором ДНК ядерного хроматина расщепляется в
нуклеосоме (с образованием так называемой "лэддер-последовательности"), которое приводит к гибели клетки] миелоидных клеток, а также использования свойственной ему
функции идентификации таких антигенов или функции, определяемой их способностью
вызывать апоптоз миелоидных клеток. Между тем, миелоидные клетки включают клетки,
отличные от лимфоидных клеток, такие как нейтрофилы, мегакариоциты, миелобласты,
миелоциты, тучные клетки, макрофаги, моноциты и эритробласты, так что в контексте настоящего изобретения термин "миелоидные клетки" имеет приведенные выше значения.
До сих пор не были известны моноклональные антитела, обладающие способностью вызывать апоптоз миелоидных клеток, поэтому моноклональные антитела настоящего изобретения включают в себя все моноклональные антитела, способные вызывать апоптоз
миелоидных клеток.
В общих чертах моноклональные антитела по настоящему изобретению могут быть
получены с помощью указанного ниже способа.
А именно, моноклональное антитело по настоящему изобретению может быть получено, например, путем использования стромальных клеток селезенки, взятых от животных, с введенным в качестве антигена rG-CSF, иммунизации их, которую осуществляют
по традиционно принятой методике слияния иммунизированных клеток с помощью стандартной процедуры слияния и клонирования слитых клеток с использованием известного
метода клонирования.
В качестве предпочтительного способа получения моноклональных антител настоящего изобретения может быть приведен метод, включающий использование в качестве
антигена CF-1 клеток, представляющих собой стромальные клетки селезенки животного,
которому вводят rG-CSF, и которые выведены авторами настоящего изобретения в качестве культуральной клеточной линии (Blood, 80, 1914, 1992), слияние плазматических
клеток (иммуноцитов) из млекопитающего, иммунизированного антигеном, с миеломными клетками млекопитающего, в частности мыши, клонирование полученных слитых клеток (гибридом), селекцию клонов, продуцирующих антитело настоящего изобретения,
которое способно распознавать указанную клеточную линию среди других, и культивирование их с выходом целевого антитела. Однако этот метод приведен лишь в качестве одного из возможных примеров, так что в данном случае для получения, на основе того же
способа, что и в случае CF-1 клеток, антител, связывающихся с интересующими миелоидными клетками человека, в качестве антигенов могут использоваться не только вышеупомянутые CF-1 клетки, но также и клеточные линии, полученные способом, аналогичным
примененному в случае CF-1 клеток, из стромальных клеток селезенки человека.
В соответствии со способом получения таких моноклональных антител использование
тех или иных млекопитающих, которые могут быть иммунизированы вышеупомянутым
антигеном, особо не ограничено; однако предпочтительно проводить отбор, принимая во
внимание соответствие миеломных клеток для их использования в процедуре слияния
клеток, при этом по данному способу оказывается предпочтительно работать с мышами,
крысами и хомячками.
Иммунизацию осуществляют в соответствии с общепринятой методикой, например,
посредством введения с помощью инъекции стромальных клеток селезенки, таких как
вышеупомянутые CF-1 клетки, в брюшную полость млекопитающего. Более специфично
предпочтительно вводить их животному при разбавлении или суспендировании в соответствующем количестве фосфатно-буферного раствора (PBS) или изотонического раствора
хлорида натрия несколько раз в месяц. Предпочтительно использовать в качестве иммуноцитов клетки селезенки, отобранные по завершении последнего введения вышеупомянутых клеток.
В качестве второго компонента, необходимого для проведения слияния клеток, который представляет собой миеломные клетки, предпочтительно использование ряда извест3
BY 5591 C1
ных клеточных линий, которые включают РЗ (РЗХ63 Ад 8.653) (Y. Immunol., 123, 1548,
1978), P3-V1 (Current topics in Microbiology and Immunology, 81, 1-7, 1978), NS-1 (Eur. J.
Immunol., 6, 511-519, 1976), MPC-11 (Cell, 8, 405-415, 1976), Sp 2/G-Ag 14 (Nature, 276,
269-270, 1978), FO (J. Immunol, Meth., 35, 1-21, 1980), S 194 (J. Exp. Med., 148, 313-323,
1978) и R 210 (Nature, 277, 131-133, 1979).
Слияние клеток при использовании вышеупомянутого иммуноцита и миеломной
клетки может быть проведено в целом с помощью одного из традиционных способов, например, по методу Мильштейна и др. (Methods Enzymol., 73, 3-46, 1981).
Более специфично вышеупомянутое слияние клеток может быть проведено, например,
в простой питательной среде в присутствии вещества, ускоряющего слияние. В качестве
такого ускоряющего слияние клеток агента может использоваться полиэтиленгликоль
(PEG) и вирус Sendai (HVJ), а, кроме того, при необходимости усилить эффективность
слияния практикуется добавление адъювантов, таких как диметилсульфоксид.
Что касается коэффициентов отношения иммуноцитов и миеломных клеток, то предпочтительно использование первого из них в 1-10-кратном количестве относительно второго компонента смеси для слияния клеток. В качестве примеров среды, применимой для
проведения вышеупомянутой процедуры слияния, можно привести среду RPM1-1640 и
MGC среду (минимальную поддерживающую среду), которые хорошо подходят для осуществления пролиферации упомянутых миеломных клеток, а также ряд других сред, традиционно используемых для культивирования такого рода клеток, которые, кроме того,
могут содержать дополнительно сыворотку, в частности фетальную телячью сыворотку
(FBS).
Клеточное слияние проводят при смешивании описанных ранее количеств вышеупомянутых иммуноцитов и миеломных клеток в вышеупомянутой среде, при добавлении в
среду, обычно в концентрации 30-60 % (вес/объем), раствора PEG, предварительно нагретого до температуры около 37 °С, например такого PEG, который имеет средний молекулярный вес в диапазоне от 1000 до 6000, с последующим перемешиванием. Затем
последовательно, при повторении процедур добавления соответствующих сред друг за
другом, центрифугировании реакционной смеси и удалении супернатантов могут быть
получены целевые гибридомы.
Упомянутые гибридомы подвергают селекции при культивировании на обычной селективной среде, в частности на HAT среде (среде, содержащей гипоксантин, аминоптерин
и тимидин). Культуру выращивают на HAT среде в течение периода времени, достаточного для того, чтобы клетки, отличные от гибридом (неслитые клетки), погибли, обычно от
нескольких дней до нескольких недель. Затем с применением обычного метода ограниченных разведении проводят скрининг и клонирование гибридом.
Полученные гибридомы, способные к продуцированию моноклинальных антител по
настоящему изобретению, могут быть далее подвергнуты субкультивированию, после чего они могут храниться в жидком азоте в течение длительного времени.
Для получения моноклональных антител по настоящему изобретению от гибридом
может быть применен метод, включающий культивирование гибридом по обычной методике с получением их из супернатантов, или метод, включающий введение гибридомы с
целью ее пролиферации в организм подходящего млекопитающего с получением их из
асцита. Первый способ применяется для случаев получения антител высокой чистоты, тогда как второй - для целей массовой продукции антител.
Кроме того, антитела, получаемые при использовании вышеуказанных методов, могут
быть очищены до высокой степени чистоты с помощью традиционных способов очистки,
таких как высаливания, гель-фильтрация и аффинная хроматография.
Моноклональное антитело по настоящему изобретению может быть любым таким антителом, обладающим специфическим свойством, более подробно описанным далее в
примере, а именно свойством вызывать апоптоз миелоидных клеток, при этом все несу4
BY 5591 C1
щие такое свойство антитела включены в рамки настоящего изобретения, независимо от
вида антигенов; моноклональное антитело настоящего изобретения может быть применено на основе реализации этого его свойства в качестве лекарственного средства для лечения миелоцидного лейкоза.
Нет необходимости говорить о том, что создание на основе моноклональных антител
настоящего изобретения специфичной системы для идентификации и распознавания антигенов, вызывающих апоптоз миелоидных клеток, или для использования в качестве лекарственного средства при лечении миелоцидного лейкоза, на основе реализации специфического свойства антител, а также все виды модификации и применения такой системы
включены в рамки настоящего изобретения, в той мере, в какой все они применимы на
практике с использованием метода, очевидного для каждого специалиста, обладающего
средним уровнем знаний в данной области.
Ниже приведено детальное описание настоящего изобретения в соответствии с эталонным примером и примером, не ограничивающих объем изобретения, со ссылками на
фиг. 1-21.
На фиг. 1 приведены результаты иммунофлюоресцентного анализа (контроль в отсутствие антитела, CF-1 клетка).
На фиг. 2 приведены результаты исследования способности к связыванию GSPST-1
антитела с CF-1 клетками на основе иммунофлюоресцентного анализа.
На фиг. 3 приведены результаты исследования способности к связыванию ВМАР-1
антитела с CF-1 клетками на основе иммунофлюоресцентного анализа.
На фиг. 4 приведены результаты иммунофлюоресцентного анализа (контроль в отсутствие антитела, клетка костного мозга).
На фиг. 5 приведены результаты исследования способности к связыванию G-SPST-1
антитела с клетками костного мозга на основе иммунофлюоресцентного анализа.
На фиг. 6 приведены результаты исследования способности к связыванию ВМАР-1
антитела с клетками костного мозга на основе иммунофлюоресцентного анализа.
На фиг. 7 приведены результаты иммунофлюоресцентного анализа (контроль в отсутствие антитела, NFS-60).
На фиг. 8 приведены результаты исследования способности к связыванию GSPST-1
антитела с NFS-60 клетками на основе иммунофлюоресцентного анализа.
На фиг. 9 приведены результаты иммунофлюоресцентного анализа (контроль относительно IgG1, NFS-60).
На фиг. 10 приведены результаты исследования способности к связыванию ВМАР-1
антитела с NFS-60 клетками на основе иммунофлюоресцентного анализа.
На фиг. 11 проиллюстрирован метод количественного определения моноклонального
антитела (ВМАР-1), ингибирующего пролиферацию NFS-60 клеток.
На фиг. 12 проиллюстрирован метод количественного определения моноклонального
антитела (GS PST-1), ингибирующего трансплантацию костного мозга.
На фиг. 13 проиллюстрирован метод количественного определения моноклонального
антитела (ВМАР-1), ингибирующего трансплантацию костного мозга.
На фиг. 14 показаны [микрофотография (окраска гематоксилинэозином) образцов костного мозга (×400)] клетки костного мозга (2), погибшие на 6 день после введения моноклонального антитела ВМАР-1 по настоящему изобретению, и контроль (1) в отсутствие
антитела.
На фиг. 15 показано (фотография движения в электрофорезе) образование лэддерпоследовательности ДНК в клетках костного мозга, которое наблюдается в том случае,
когда вводят моноклональное антитело ВМАР-1 по настоящему изобретению.
На фиг. 16 проиллюстрирован количественный метод определения цитотоксичности с
использованием L 929 клеток и TNFα (фактора некроза опухолевых клеток альфа).
На фиг. 17 проиллюстрирован количественный метод определения цитотоксичности с
помощью моноклонального антитела (ВМАР-1).
5
BY 5591 C1
На фиг. 18 приведены результаты иммунофлюоресцентного анализа (контроль относительно IgG2a крысы, BWV1).
На фиг. 19 приведены результаты исследования способности к связыванию антитела к
мышиному главному комплексу чисто совместимости МНС класса 1 с BWV1 клетками на
основе иммунофлюоресцентного анализа.
На фиг. 20 приведены результаты иммунофлюоресцентного анализа (контроль относительно IgG1 крысы, BWV1).
На фиг. 21 приведены результаты исследования способности к связыванию ВМАР-1
антитела с BWV1 клетками на основе иммунофлюоресцентного анализа.
Приведенные на фиг. 15 обозначения означают:
а - ДНК из тимуса мыши, которой был введен ВМАР-1 (24 часа);
б - ДНК из костного мозга мыши, которой был введен ВМАР-1 (24 часа);
в - ДНК из костного мозга мыши, которой был введен ВМАР-1 (8 часов);
г - ДНК из костного мозга мыши, которой был введен ВМАР-1 (4 часа);
д - ДНК из костного мозга необработанной мыши (клетки костного мозга);
е - маркер молекулярной массы.
Эталонный пример
Создание линии стромальных клеток селезенки и ее характеристика
1) Создание линии стромальных клеток селезенки
Линию стромальных клеток селезенки создают на основе первичной культуры клеток
селезенки мыши C57BL/6y, которой вводили rG-CSF в количестве 100 мкг/кг в течение
5 дней.
Процедура заключалась в следующем: после завершения введения rG-CSF в асептических условиях из животного удаляют селезенку, культивируют ее в инкубаторе при
температуре 37 °С в условиях 5 % содержания СO2 в течение 6 недель в пластиковой колбе с площадью основания 25 см3 (Corning Co.), используя среду Dulbecco в модификации
Isocove (IMDM) (Boehringer-Mannheim Co.), в которую внесены инактивированная нагреванием 10 % фетальная телячья сыворотка (FBS) (Sanko Junyaku, Tokyo) 100 Ед/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина, при этом указанную среду заменяют свежей средой
культивирования два раза в неделю.
В конфлюентной культуре отбирают популяции слипшихся клеток (стромальных клеток) из колбы с применением PBS, не содержащего Са и Мg, в который внесены 0,95 %
трипсин и 0,02 % EDTA (Sigma Chemical Co.), и переносят в новые колбы. Такие действия
повторяют один или два раза в неделю. Сначала (первые десять раз) коэффициент расщепления клеток составляет от 1/4 до 1/8, впоследствии он снижается до величин в диапазоне от 1/16 до 1/32. Приблизительно после 10-го переноса стромальные клетки становятся
гомогенными и фибробластоидными.
К 20-му разу проведения вышеописанной процедуры стромальные клетки отбирают и
направляют на клеточное клонирование с использованием методики ограниченных разведении; клеточное клонирование повторяют дважды с установлением линии стромальных
клеток (клеточная линия CF-1).
Далее эти клетки поддерживают в колбе с площадью основания 25 см3 (Corning Co.) в
5 мл среды 1 MDM с добавлением 10 % инактивированной нагреванием FBS и проводят
субкультивирование каждые пять дней при коэффициенте расщепления 1/32. Линии стромальных клеток селезенки могут быть созданы не только на основе мыши, но и из других
животных; так, например, с использованием вышеописанного способа могут быть получены стромальные клеточные линии человека посредством трансформации клеток вектором аденовируса SV-40 (J. Cell Physiol., 148, 245, 1991).
2) Характеристика CF-1 клеток
CF-1 клетки, установленные описанным выше способом в виде клеточной линии, исследовали с применением стандартных цитохимических методов анализа на содержание
6
BY 5591 C1
щелочной фосфатазы, кислой фосфатазы, β-глюкуронидазы, α-нафтил-ацетат-эстеразы.
При изучении CF-1 клеток методами иммуноферментной гистохимии использовали следующие моноклональные и поликлональные антитела: macl (Sero Tec.), антиген, связанный с фактором VIII (Dacopatts), коллаген типа I, коллаген типа III и фибронектин
(Chemicon International Inc.). Фагоцитоз исследовали по поглощению латексных гранул
(размер частиц 1,09 мкм. Sigma), а способность CF-1 клеток превращаться в адипоциты
определяли при воздействии фосфата гидрокортизона (Sigma) в дозе 10-6 моль/л в течение
4 недель на конфлюентную культуру, находящуюся в колбе с площадью основания 25 см2.
В результате проведенных исследований было показано, что CF-1 клетки не содержат
щелочной фосфотазы, антигена, связанного с фактором VIII, mac 1, кроме того, при исследовании фагоцитоза были получены отрицательные результаты, тогда как положительные данные были показаны при тестировании их на наличие коллагена типа I,
коллагена типа III и фибронектина. CF-1 клетки не демонстрировали трансформации в
адипоциты в течение 4 недель в конфлюентной культуре при наличии гидрокортизона в
дозе 10 моль/л, хотя CF-1 клетки содержат, как было показано, следы липида. На основании этих результатов был сделан вывод о том, что CF-1 клетки не обладают свойствами
преадипоцитов, макрофагов и эндотелиальных клеток, и в этой связи их происхождение
из других клеток, а именно из стромальных клеток.
3) Поддержание гемопоэтических стволовых клеток клетками CF-1
Для того, чтобы определить, способны ли CF-1 клетки поддерживать рост гемопоэтических стволовых клеток, с помощью техники Till and McCulloch было проведено тестирование на образование колониеобразующей единицы клеток селезенки (КОЕ-С) - тест на
колониеобразующую способность селезеночных клеток. В ходе тестирования группу из 10
мышей облучали дозой в 900 cGy (MBK-1520R; Hitachi, Tokyo), после чего животным
инъецировали внутривенно моноядерные клетки костного мозга (ВМ клетки) (1,0·105/организм, 5,0·104/организм или 2,5·104/организм) и CF 1 клетки (1,0·105/организм), а на 12-й
день в селезенке подсчитывали количество образовавшихся колоний в виде КОЕ-С клонов
(селезеночные колонии).
Было показано, что при трансплантации в организм облученных мышей моноядерных
клеток костного мозга (ВМ клеток) и CF-1 клеток количество колоний каждой группы ВМ
клеток значительно возрастает (от 1,4 до 1,8 раз) в сравнении с мышами, которым не вводили CF-1 клетки, при этом происходит также снижение уровня смертности, поскольку на
12-й день после трансплантации коэффициент выживания мышей с трансплантированными ВМ клетками и CF-1 клетками был выше, чем в случае мышей, несущих в качестве
трансплантированных только ВМ клетки; эти результаты демонстрируют очевидную способность CF-1 клеток поддерживать рост гемопоэтических стволовых клеток.
Оптимальный способ осуществления изобретения
Ниже приводится подробное описание такого варианта настоящего изобретения.
Пример.
Получение моноклональных антител
1) Антигены и иммунизация
Иммунизацию проводят с применением в качестве антигенов CF-1 клеток, полученных по вышеприведенной стандартной процедуре. Клетки культивируют в инкубаторе
при температуре 37 °С и содержании 5 % СО2, в среде Dulbecco в модификации Isocove
(1MDM среде) (Boehringer-Mannheim Co.), содержащей 10 % фетальную телячью сыворотку (FBS; Sanko Junyaku).
Клетки обрабатывают 1 мМ EDTA/PBS и с помощью пипетки отбирают из культуральной колбы. Затем клетки суспендируют в 1 мМ EDTA/PBS до концентрации клеток
примерно 1·107 мл, после чего полученную суспензию вводят крысам линии Wistar
Imamich [возраст 7 недель, самки, из Animal Breeding Research Laboratory]. Один мл клеточной суспензии, содержащей около 1·107 клеток/мл, инъецируют в брюшную полость
7
BY 5591 C1
крысы в ходе первичной иммунизации, а через месяц вводят еще 1 мл клеточной суспензии, содержащей примерно 1·107 клеток/мл. Далее с интервалом в один месяц вводят еще
несколько раз 1 мл клеточной суспензии, содержащей приблизительно 1·107 клеток/мл, а
затем, после наблюдения реакции между антителом иммунизированной крысы и CF-1
клетками, вводят завершающую дозу иммунизации в 1 мл клеточной суспензии, содержащей около 1·108 клеток/мл. Спустя три дня после введения завершающей дозы, крыс
забивают и удаляют из них селезенки.
2) Слияние клеток
Селезенку после удаления из организма крысы измельчают, выделенные селезеночные
клетки центрифугируют, суспендируют в 1MDM среде (Boehringer-Mannheim Co.) и тщательно промывают. С другой стороны, клетки, полученные при культивировании миеломной клеточной линии мышей Sp2/0-AgI4 (Nature, 276, 269-270, 1978) и находящиеся в
среде 1MDM (Boehringer-Mannheim Со.) с добавлением 10 % фетальной телячьей сыворотки (FBS; Sanko Junyaku), также промывают в вышеприведенной 1MDM среде, после
чего из них отбирают 1·108 клеток, а из описанных ранее селезеночных клеток отбирают
соответственно 2·108 клеток и помещают обе аликвоты в центрифужную пробирку для
осуществления по традиционной методике процесса слияния клеток под влиянием полиэтиленгликоля 4000 (Nagarai Kadaku) (Clin. Exp. Immunol., 42, 458-462, 1980).
Далее полученные слитые клетки распределяют по 96-гнездному планшету в 1MDM
среде, содержащей 20 % FBS, и культивируют при температуре 37 °С и содержании 5 %
СО2. На следующий день их осторожно переносят на селективную HAT среду, продолжая
на ней культивирование.
С момента начала культивирования два раза в неделю заменяют супернатанты на свежую
HAT среду с целью продолжения роста культуры к поддержания пролиферации клеток.
После этого полученные после слияния гибридные клетки клонируют по традиционной
методике с использованием способа ограниченных разведении. А именно: в соответствии
с указанной традиционной методикой с применением способа ограниченных разведении
клонируются только те клоны, которые обладают выраженными способностями к связыванию, при этом отслеживают их связывающую способность с антигенами, которые соединяются с антителами, находящимися в супернатантах таких гибридных клеток.
3) Скрининг
Скрининг слитых клеток (гибридом) проводят на основе опосредованной флюоресценции антител с использованием проточной цитометрии.
Скрининг клонов, продуцирующих целевые антитела, осуществляют с помощью CF-1
клеток в качестве клеток-мишеней. При этом клетки, суспендированные в реакционном
буфере (PBS с добавлением 2 % ФТС и 0,02 % NaN3), центрифугируют, а осадок вновь
суспендируют в 100 мкл культурального супернатанта от выращивания гибридом (примерно 1·106 клеток/100 мкл) и проводят реакцию при температуре 4 °С в течение 1 часа.
После этого клетки промывают еще раз вышеописанным буфером, добавляют меченное
флуоресцином козлиное антитело к IgG крысы (FC) (Chemicon) и проводят инкубацию в
течение 1 часа. По окончании еще одной стадии промывания клетки анализируют методом проточной цитометрии (FACScan, Becton Dickinson).
4) Очистка антител
После скрининга по приведенному в 3) методу слитые клетки культивируют с использованием обычной методики, при этом образуемые антитела выделяют из супернатантов с
помощью традиционной процедуры и далее очищают.
В соответствии с этой процедурой гибридом с высокими титрами антител к антигенам
отбирают из ячеек, распределяют в культуре ткани на пластиковой чашке Петри (Corning
Co.), культивируют с целью пролиферации при температуре 37 °С и содержании 5 % СО2
и затем подвергают очистке по обычной методике для получения моноклональных антител GSPST-1 и ВМАР-1.
8
BY 5591 C1
Для выделения GSPST-1 полученные клетки инъецируют в брюшную полость лишенных волосяного покрова мышей (nude) BAI.B/ cAJc-nu [мыши самцы, 8-недельного возраста, Nippon Kurea]. Возникший асцит вскрывают через 10-14 дней, высаливают с
применением 33 % сульфата аммония и диализуют против PBS. Что касается ВМАР-1 антител проводят крупномасштабное культивирование в минимальной поддерживающей
среде (MEM), модифицированной по методу Iscove, содержащей 10 % FBS, после чего
супернатанты концентрируют, высаливают с применением 33 % сульфата аммония,
диализуют против PBS, снова очищают с применением набора колонок с протеином A
(Amersham) и диализуют против PBS. Далее, как было описано в примере, CF-1 клетки
используют в качестве антигенов для проведения иммунизации; однако возможно с применением того же способа получение моноклональных антител в случае использования
других стромальных клеток, обладающих способностью поддерживать рост гемопоэтических стволовых клеток, так что настоящее изобретение не ограничивается вышеприведенными антителами, но включает также все моноклональные антитела, имеющие такие
характеристики, а также все гибридомы, продуцирующие моноклональные антитела.
Гибридома, продуцирующая моноклональное антитело ВМАР-1 настоящего изобретения, представляет собой гибридную клетку, полученную путем слияния селезеночной
клетки из крысы Wistar Imamich и миеломной клетки из клеточной линии мышей Sp2/0Ag14, которая была депонирована 9 августа 1993 г. под названием ВМАР-1 (гибридома из
материала крысы и мыши) под депозитным номером FERM BP-4382 в Национальном Институте Биологических Наук и Технологии Исследования Человека Агентства Промышленной Науки и Технологии в Японии (адрес: 1-3, Хигаши 1-хом, Тсукуба-ши, Ибараки
305, Япония) [National Institute of Bioscience and Human Technology, Agence of Industrial
Science and Technolody in Japan (1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-Shi, Ibaraki 305, Japan)
международного депозитарного управления, действующего на основе Будапештского Договора по международной классификации депозитов микроорганизмов с целью их патентования.
5) Свойства антител
(i) Реакционная способность антител
(Реактивность относительно CF-1 клеток)
Результаты исследования с применением иммунофлюоресцентного анализа реакционной способности моноклональных антител GSPST-1 и ВМАР относительно CF-1 клеток
показаны на фиг. 1-3. Так, на фиг. 1 приведены данные по изучению контроля в отсутствие антитела, на фиг. 2 представлены результаты исследования способности GSPST-1 к
связыванию с CF-1 клетками, а на фиг. 3 - результаты анализа связывающей способности
ВМАР-1 также с CF-1 клетками. На этих фигурах вертикальные оси показывают относительное количество клеток, тогда как на горизонтальных осях приведены данные по интенсивности флюоресценции.
Как следует из фиг. 1-3, моноклональные антитела GSPST-1 и ВМАР-1 характеризуются способностью как к связыванию с CF-1 клетками, так и к распознаванию поверхностных антигенов CF-1 клеток.
(Реактивность относительных клеток костного мозга)
Далее, на фиг. 4-6 представлены результаты исследования с применением метода проточной цитометрии (FACScan, Becton Dickinson) реакционной способности GSPST-1 и
ВМАР-1 относительно клеток костного мозга. Так, на фиг. 4 приведены данные по изучению контроля в отсутствие антитела, на фиг. 5 представлены результаты исследования
способности GSPST-1 к связыванию с клетками костного мозга, а на фиг. 6 - результаты
анализа связывающей способности ВМАР-1 также с клетками костного мозга. На этих фигурах вертикальные оси показывают относительное количество клеток, тогда как на горизонтальных осях приведены данные по интенсивности флюоресценции.
9
BY 5591 C1
Как следует из фиг. 4-6, у GSPST-1 полностью отсутствует способность к связыванию
с клетками костного мозга, тогда как для ВМАР-1 характерна способность к связыванию
со всеми клетками костного мозга.
(Реакционная способность относительно клеток миелоцитарной лейкозной клеточной
линии (NFS-60))
Результаты исследования с применением метода проточной цитометрии (FACScan,
Becton Dickinson) реакционной способности GSPST-1 и ВМАР-1 относительно NFS-60
клеток (Proc. Natl. Acad. Sci, USA, 82, 6687-6691, 1985) представлены на фиг. 7-10. Так, на
фиг. 7 приведены данные по изучению контроля в отсутствие антитела, на фиг. 8 представлены результаты исследования способности GSPST-1 к связыванию с NFS-60 клетками, на фиг. 9 - результаты анализа контроля с использованием имеющегося на рынке IgG1
крысы (Zymed), тогда как на фиг. 10 показаны результаты изучения связывающей способности ВМАР-1 также с NFS-60 клетками. На этих фигурах вертикальные оси показывают
относительное количество клеток, тогда как на горизонтальных осях приведены данные
по интенсивности флюоресценции.
Как показано на фиг. 7-10, GSPST-1 не взаимодействует с NFS-60 клетками, тогда как
ВМАР-1 обладает способностью к связыванию с NFS-60 клетками.
(Тестирование способности ВМАР-1 ингибировать профилерацию NFS-60 клеток)
На фиг. 11 приведены результаты исследования действия ВМАР-1 на NFS-60 в присутствии 100 нг/мл G-CGT и 10-6 М циклогексимида в соответствии с МТТ тестом. С использованием 96-ячеечных микротитрационных плато к каждой ячейке, содержащей в 100
мкл 4103 NFS-60 клеток, добавляют по 10 мкл раствора ВМАР-1 в концентрациях 0, 10,
100 нг/мл, а также 1, 10, 100 мкг/мл и подсчитывают через два дня с применением МТТ
метода количество живых клеток.
Как показано на фиг. 11, происходит выраженное ингибирование профилерации NFS60 клеток под действием ВМАР-1.
(ii) Определение типа антител
Далее в результате типирования подкласса IgG полученных моноклональных антител
[с использованием набора (Mono Ab - ID - Sp, Zimed) и биотин-меченного мышиного антитела к IgG1 крысы (Zimed) ] было показано, что GSPST-1 представляет собой IgG2a, а
ВМАР-1 является IgG1.
(iii) Способность ингибировать трансплантацию костного мозга
С целью дальнейшего изучения антитела настоящего изобретения были использованы
в экспериментах по ингибированию трансплантации костного мозга. На фиг. 12 и 13 представлены полученные при этом результаты. Как следует из данных, приведенных на этих
фигурах, ВМАР-1 демонстрирует ингибирующий трансплантацию костного мозга эффект,
тогда как CSPST-1 такое действие не свойственно. Указанные результаты получены при
введении через хвостовые вены облученным летальной дозой радиации (900 cGy) мышам
C57BL/6J клеток костного мозга в количестве 1,0·105 в расчете на одно животное и моноклональных антител с последующим подсчетом числа клеточных колоний в селезенке.
Вариант "Не обработанные" на фиг. 13 относится к случаю, при котором клетки костного
мозга не вводятся в исследуемое животное.
Как показано на фиг. 13, в описываемом исследовании по ингибированию трансплантации костного мозга было подтверждено представление о том, что именно потому, что
ВМАР-1 может вступать во взаимодействие с клетками костного мозга, приводя в итоге к
апоптозу, моноклональное антитело полностью ингибирует трансплантацию костного
мозга в данном тесте. При этом, когда гибридому, продуцирующую ВМАР-1, вводят в
брюшную полость лишенной волосяного покрова (nude) мыши, она погибает в тот момент, когда содержимое асцита сосредоточивается в малом объеме. Кроме того, было показано, что все клетки костного мозга погибают при внутривенном введении ВМАР-1
нормальным мышам C57BL/6J в расчете 50 мкг на животное, при этом на фиг. 14 приве10
BY 5591 C1
дена микрофотография, демонстрирующая гибель клеток костного мозга на 6-й день после
внутривенного введения ВМАР-1. Как видно из данной фотографии, в этом случае погибают не только лимфоидные клетки, но также нейтрофилы, мегакариоциты, миелобласты,
миелоциты, тучные клетки, макрофаги, моноциты и эритробласты (так называемые миелоидные клетки). Кроме того, как следует из фиг. 15, при исследовании ДНК клеток костного мозга мыши, которой было введено ВМАР-1 антитело в расчете 30 мкг на животное,
был продемонстрирован факт очевидного образования лэддер-последовательности ДНК,
при этом было установлено, что указанная выше реакция ВМАР-1 с клетками костного
мозга имеет место благодаря апоптозу.
Участок Fc IgG антитела ВМАР-1 переварили пепсином (Sigma) и очистили с помощью GPC колонки в виде F(ab')2, после чего его ввели внутривенно мышам C57BL/6J в
расчете на одно животное в количестве 33,5 мкг (что соответствует 50 мкг на животное
IgG); в результате этого эксперимента было показано, что клетки костного мозга погибают в костном мозге. На основе вышеизложенных данных очевидно, что гибель клеток костного мозга под действием ВМАР-1 не связана ни с зависимой от антитела
цитотоксичностью, ни с комплемент-зависимой клеточной цитотоксичностью.
В качестве антигена, вызывающего апоптоз, описан белковый Fas антиген клеточной
поверхности; при этом экспрессия соответствующих Fas антигену мРНК была обнаружена
в тимусе, сердце, печени, легких и яичнике, тогда как в костном мозге был продемонстрирован лишь невысокий уровень мРНК (J. Immunol., 148, 1274-1279, 1992), и в этой связи
очевидно, что антигены, распознаваемые ВМАР-1, отличны от обычного известного Fas
антигена.
Кроме того, с целью выяснения, не представляет ли антиген, распознаваемый ВМАР-1,
TNF рецептор (TNF - фактор некроза опухолевых клеток), исследовали функционирование ВМАР-1 с использованием L-929 клеток, реагирующих с TNF, которые вызывают гибель
клеток. Конечная концентрация мышиного TNFα (Genzym) составляла в эксперименте 0,
1, 10, 100 пг/мл, а также 1, 10, 100 нг/мл и 1 мкг/мл, тогда как концентрация ВМАР-1 равнялась 0, 10, 100 пг/мл, 1, 10, 100 нг/мл, а также 1, 10 мкг/мл, а количество живых L-929
клеток измеряли по методу МТТ на второй день после добавления TNFα и ВМАР-1. Результаты эксперимента, как следует из данных фиг. 16 и 17, показывают, что тогда как под
действием TNFα происходит выраженное снижение количества L-929 клеток, ВМАР-1 такого эффекта на L-929 клетки не демонстрирует. Эти результаты наглядно показывают,
что антиген, распознаваемый ВМАР-1, не является TNFα рецептором.
Результаты исследования с применением проточной цитометрии (FACScan, Becton
Dickinson) с целью выяснения, не представляют ли антигены, распознаваемые ВМАР-1,
антигены класса 1 главной системы тканевой совместимости (МНС), представлены на
фиг. 18-21.
Так, на фиг. 18 показаны результаты анализа контроля с использованием IgG1 крысы
(Zimed), на фиг. 19 - результаты анализа способности антитела к главной системе тканевой совместимости, класса (крысиный IqG2a, BMA) связываться с BWV1 клетками (мышиная лимфома, полученная на основе BW 5147 клеток), на фиг. 20 приведены данные
анализа контроля с использованием IgG1 крысы (Zimed), а на фиг. 21 приведены результаты исследования связывающих способностей ВМАР-1 в отношении BWV1 клеток. На
данных фигурах вертикальные оси показывают относительное количество клеток, тогда
как на горизонтальных осях приведены данные по интенсивности флюоресценции. Как
следует из приведенных результатов, ВМАР-1 не распознает BWV1 клетки, тогда как антитело из класса 1 главной системы тканевой совместимости (МНС) реагирует с BWV1
клетками.
Как уже было упомянуто выше, экспериментально был подтвержден тот факт, что
ВМАР-1 обладает способностью вызывать апоптоз миелоидных клеток; в соответствии с
тем, что, как известно авторам настоящего изобретения, до настоящего времени отсутст11
BY 5591 C1
вовала какая-либо информация о моноклональных антителах, способных вызывать апоптоз миелоидных клеток, моноклональные антитела настоящего изобретения, обладающие
такой функцией, представляют собой новые антитела, открытые настоящими авторами.
При этом, поскольку моноклональные антитела настоящего изобретения, представленные
ВМАР-1, могут приводить, на основе способности этого моноклонального антитела вызывать апоптоз клеток костного мозга, к гибели рассматриваемых миелоцидных лейкозных
клеток, экспрессирующих высокий уровень антигенов, упомянутые моноклональные антитела пригодны для использования в качестве лекарственного средства для лечения миелоцидного лейкоза.
Моноклональные антитела настоящего изобретения были подробно описаны выше, в
разделе Примера; при этом, несмотря на то, что моноклональные антитела, обладающие в
соответствии с настоящим изобретением способностью вызывать апоптоз миелоидных
клеток, могут быть проиллюстрированы указанными выше примерами, настоящее изобретение ими не ограничено и включает все полученные таким же способом моноклональные
антитела, обладающие теми же характеристиками и функциями, вне зависимости от вида
антигенов.
Поскольку моноклональные антитела по настоящему изобретению могут быть использованы в качестве антител, распознающих и идентифицирующих антигены, вызывающие
апоптоз миелоидных клеток, а, кроме того, обладающих способностью непосредственно
вызывать апоптоз миелоидных клеток, они могут на основе этого свойства найти применение в медицине в качестве лекарственного препарата для лечения миелоцидного лейкоза.
Фиг. 2
Фиг. 3
Фиг. 5
Фиг. 6
Фиг. 8
Фиг. 9
12
Фиг. 4
Фиг. 7
Фиг. 10
BY 5591 C1
Фиг. 11
Фиг. 12
Фиг. 13
(1)
(2)
Фиг. 14
Фиг. 15
13
BY 5591 C1
Фиг. 16
Фиг. 17
Фиг. 18
Фиг. 19
Фиг. 20
Национальный центр интеллектуальной собственности.
220034, г. Минск, ул. Козлова, 20.
Фиг. 21
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
0
Размер файла
461 Кб
Теги
5591, патент
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа