close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Патент BY 10604

код для вставкиСкачать
ОПИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ПАТЕНТУ
РЕСПУБЛИКА БЕЛАРУСЬ
(46) 2008.06.30
(12)
(51) МПК (2006)
НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР
ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ
СОБСТВЕННОСТИ
(54)
G 01N 33/00
СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИГЕМОЛИТИЧЕСКОЙ
АКТИВНОСТИ ХИМИЧЕСКОГО СОЕДИНЕНИЯ
(21) Номер заявки: a 20041173
(22) 2004.12.14
(43) 2006.06.30
(71) Заявитель: Государственное научное учреждение "Институт биоорганической химии Национальной
академии наук Беларуси" (BY)
(72) Авторы: Литвинко Наталья Михайловна; Кучуро Светлана Викторовна; Рахуба Галина Николаевна;
Рубинов Дмитрий Брониславович;
Желдакова Татьяна Анатольевна
(BY)
BY 10604 C1 2008.06.30
BY (11) 10604
(13) C1
(19)
(73) Патентообладатель: Государственное
научное учреждение "Институт биоорганической химии Национальной академии наук Беларуси" (BY)
(56) Литвинко Н.М. и др. V съезд гематологов и трансфузиологов Республики
Беларусь. Актуальные проблемы гематологии и трансфузиологии: Сб. научн.
тр. к 70-летию НИИ гематологии и переливания крови. Т. 2. - Мн.: НПООО
"Стринко", 2003. - С. 119-121.
BY 5752 C1, 2003.
(57)
Способ определения антигемолитической активности химического соединения, включающий преинкубацию смеси исследуемого соединения с фосфолипазой А2 яда змеи перед ее инкубацией с эритроцитосодержащим агарозным гелем и последующее
определение антигемолитической активности химического соединения по отношению
площади зоны гемолиза эритроцитов в агарозном геле в присутствии и в отсутствие исследуемого соединения, отличающийся тем, что преинкубацию исследуемого соединения с фосфолипазой А2 проводят в течение 0,5-5,0 ч, а инкубацию с эритроцитосодержащим агарозным гелем проводят при температуре не выше 37 °С.
Изобретение относится к фармацевтической промышленности и медицине и может
быть использовано в качестве контрольного теста при анализе на применение химических
соединений в качестве лекарственных средств антигемолитического и антипаралитического профиля действия, в том числе в качестве противоядия.
Воздействие ядов змей на организм млекопитающих связано с функционированием
фосфолипазы А2 (КФ 3.1.1.4 ФЛА2) - важнейшего фермента липидного обмена в организме, катализирующего гидролиз сложноэфирной связи во втором положении 1,2-диацилsn-3-фосфоглицеридов [1]. В частности, гемолитическое и нервно-паралитическое действие яда змей обусловлено активностью низкомолекулярной формы ФЛА2 [2].
Действие многих лекарственных средств прямо или опосредованно связано с ингибированием активности фосфолипазы А2. В частности, ницерголин, циннаризин, алигерон,
пирацетам, которые используются в химиотерапии гипоксии, ингибируют фосфолипазу
А2 in vitro. Местные анестетики хлорпромазин, лидокаин, тетракаин и др., а также антиаритмическое средство амиодарон являются сильными ингибиторами фосфолипазы А2 яда
BY 10604 C1 2008.06.30
С. atrox. [3]. Следовательно, биохимическая реакция гидролиза фосфолипидов эритроцитарных мембран, катализируемая ФЛА2, может служить чувствительным тестом для
скрининга веществ с потенциальной антигемолитической и антипаралитической активностью.
Методы определения активности ФЛА2 трудоемки, требуют затраты больших количеств фермента, реактивов и времени, что создает определенные трудности при выявлении ингибиторной активности исследуемых эффекторов [4]. Для успешного изучения
ингибирования фосфолипазной реакции, в том числе и для выявления среди физиологически активных соединений лекарственных средств антигемолитического и антипаралитического профиля действия, необходимы предварительные экспрессные тесты на
потенциальные ингибиторные свойства изучаемых соединений.
Наиболее близким к заявляемому является способ проведения гемолиза в агарозе с
использованием гемолитической сыворотки и суспензии эритроцитов барана [5] (прототип). Однако данный способ используется только в иммунологических целях для полуколичественной оценки общей активности комплемента в гемолитической сыворотке крови.
Задачей настоящего изобретения является разработка способа определения эффекторной активности любого ряда химических соединений, который может быть использован в
качестве контрольного теста при определении сферы применения биологически активных
соединений в качестве антигемолитических агентов.
Поставленная задача решается заявляемым способом определения антигемолитической активности химических соединений путем установления ингибиторных свойств физиологически активных соединений по отношению к ферментативному гидролизу
фосфолипидов эритроцитов с помощью выявления изменения гемолитической активности
ФЛА2.
В соответствии с изобретением описывается способ определения антигемолитической
активности химического соединения, включающий преинкубацию смеси исследуемого
соединения с фосфолипазой А2 яда змеи перед ее инкубацией с эритроцитосодержащим
агарозным гелем и последующее определение антигемолитической активности химического соединения по отношению площади зоны гемолиза эритроцитов в агарозном геле в
присутствии и в отсутствие исследуемого соединения, отличающийся тем, что преинкубацию исследуемого соединения с фосфолипазой А2 проводят в течение 0,5-5,0 ч, а инкубацию с эритроцитосодержащим агарозным гелем проводят при температуре не выше 37 °С.
Вычисляют площади гемолизных зон в присутствии исследуемого соединения (Gs) и
без него (Gs0) и рассчитывают степень ингибирующего гемолиз действия по формуле:
Gs
× 100 %.
Gs 0
Вследствие липолитического действия фосфолипазы А2 на мутную эмульсию эритроцитов (субстрат), включенных в агарозный гель, вокруг лунки, содержащей фермент, образуется за счет выхода гемоглобина из форменных элементов крови ярко-красная зона
просветления площадью Gs0 = πR02 - πr2, где R0 - радиус зоны просветления, а r - радиус
лунки. Поскольку имеется однозначная прямо пропорциональная зависимость между
диаметром зоны просветления в субстратосодержащей агарозе и концентрацией фосфолипазы А2 [6], уменьшение площади зоны просветления должно указывать на уменьшение
содержания свободного фермента, и если присутствие дополнительных веществ в лунке
вызывает образование зоны просветления меньшей площади (Gs = πR2 - πr2, где r - радиус
лунки, a Gs и R - площадь и радиус зоны просветления в присутствии ингибитора, причем
Gs < Gs0), то можно говорить об ингибирующем действии на фосфолипазу А2 этих веществ. Тогда относительное уменьшение площади зоны просветления Gs/Gs0 = (R2 - r2) / (R02 – r2) может служить мерой остаточной гемолитической активности фермента в
присутствии ингибитора.
2
BY 10604 C1 2008.06.30
Способ обнаруживает ряд преимуществ: отличается хорошей воспроизводимостью
(точность воспроизведения колеблется от 1,2 до 3 %), малым расходом фермента и других
компонентов системы, позволяет одновременно проводить испытания нескольких десятков веществ (одна чашка Петри диаметром 88 мм позволяет произвести одновременно
скрининг 8-10 веществ). Для поставленных целей особенно важно, что при проведении
фосфолипазной реакции данным методом изменение концентрации субстрата не влияет на
его состояние (организацию) в геле. В эритроцито-водных системах организация субстрата меняется с изменением его концентрации, а следовательно, по ходу реакции, что негативно сказывается на процессе гидролиза и создает определенные сложности при
интерпретации результатов. Пластины с гемолитическими зонами можно сохранять при
4 °С в течение 3-4 дней без ущерба для качества анализа.
Для лучшего понимания сущности заявляемого изобретения приводятся примеры конкретного выполнения, не ограничивающие объема изобретения.
Пример.
Для определения эффекторных свойств физиологически активных соединений, в частности производных β-трикетонов тиофенового ряда, по отношению к гемолитической активности фосфолипазы А2 используют диффузию фермента в агарозном геле, содержащем
эритроциты крови человека в качестве субстрата. Мерой ингибирования служит относительное уменьшение площади зоны просветления (Gs/Gs0), образующейся вследствие липолитического действия фермента на эмульсию эритроцитов, включенных в агарозный
гель, которое рассчитывают по формуле:
Gs/Gs0 = (R2 - r2) / (R02 – r2),
где R, R0 - радиусы зон просветления в присутствии потенциального ингибитора и без него, r - радиус лунки.
Интактные эритроциты получают из цельной крови человека. Кровь с физиологическим раствором в соотношении (1 : 4) центрифугировали 15 мин при 2500 об/мин. Сливают надосадочную жидкость, а осадок эритроцитов отмывают физиологическим раствором
и снова центрифугировали 15 мин при 2500 об/мин. Отмывание эритроцитов проводят 3
раза.
Для приготовления геля используют 0,05М веронал-ацетатный буфер pH 7,5, содержащий 0,8 % агарозы и 1,6 мМ СаСl2, который прогревают на кипящей водяной бане в течение 25 мин, затем охлаждают до 50 °С и смешивают с подогретым до 48 °С 0,05 М
веронал-ацетатным буфером pH 7,5, содержащим 27 % эритроцитов. Полученную смесь
заливают в нагретые до 48°-50 °С чашки Петри. Высота слоя геля в чашках Петри составляет 1 мм. После охлаждения в геле проделывают штампом отверстия диаметром 4 мм и
объемом 12,5 мкл для внесения фермента. В одной чашке Петри диаметром 88 мм можно
было сделать одновременно 8-10 отверстий.
Водный раствор ФЛА2 (10 мкг на пробу) преинкубируют 2 ч при комнатной температуре с раствором β-трикетонов тиофенового ряда в диметилсульфоксиде (5 мкг на пробу).
12 мкл полученного раствора вносили в вырезанную в геле лунку. Чашки инкубируют
18 ч при 4 °С, а затем в течение 5 ч при 37 °С, затем замеряют площади зоны лизиса через
2 и 5 ч.
Измерение диаметра зоны лизиса производили с помощью измерительной лупы с ценой деления 0,1 мм.
На фигуре и в таблице представлены результаты первичного скрининга некоторых
β-трикетонов тиофенового ряда:
2 ч - Gs0 = 248,98 ± 5,51 мм2, Gs (TK-11) = 229,53 ± 8,23 мм2, Gs (TK-12) = 233,17 ±
± 8,73 мм2, Gs (ТК-13) = 195,58 ± 7,35 мм2;
5 ч - Gs0 = 332,24 ± 12,37 мм2, Gs (ТК-11) = 333,76 ± 9,33 мм2, Gs (TK-12) = 346,78 ±
± 12,3 мм2 Gs, (ТК-13) = 291,15 ± 7,1 мм2.
3
BY 10604 C1 2008.06.30
Площадь зоны просветления агарозного геля с эритроцитами под воздействием
ФЛА2 (с эффектом и без) через 2 и 5 ч инкубации чашек Петри при 37 °С
Относительное изменение площади зоны просветления при диффузии ФЛА2,
после ее преинкубации с β-трикетонами тиофенового ряда, в гель,
содержащий эритроциты
Шифр
соедиСтруктурная формула
Название
Gs/Gs0, %
нения
O
O
ТК-11
5-[(Е)-2-фурилметилиден]-3- 92 ± 1,5
[(Е)-3-(2-фурил)-2пропеноил]-2,4-(3H)S
тиофендион
O
O
O
ТК-12
O
O
CH3
O
S
CH3
O
O
CH3
O
O
CH3
4
5-(3,4-диметоксибензил)-3- 93 ± 1,6
[3,4диметоксифенилпропаноил]2,4-(3H,5H)-тиофендион
BY 10604 C1 2008.06.30
Продолжение таблицы
Шифр
соединения
ТК-13
Структурная формула
O
NH
Название
COOH
CL
S
Gs/Gs0, %
5-{[1-(5-бензил-2,478 ± 1,3
диоксотетрагидро-3тиофенил)-3-(3-хлорофенил)
пропил] амино}гексановая
кислота
O
Степень воздействия испытанных соединений на гемолитическую активность ФЛА2
зависела от их химической структуры. Преинкубация ФЛА2 с хлорсодержащим производным (ТК-13), обладающим подобно природным простагландинам карбоксильной группой
в боковой цепи, приводила к ингибированию ФЛА2 на 22 %, что, возможно, обусловлено
наличием сильно электроотрицательного (ЭО) заместителя. Данное предположение подтверждается сравнением полученных данных со структурой и функцией 3,5дизамещенных производных тиотетроновой кислоты - 5-бензил-3-[(3′-фенил)пропаноил](3Н,5Н)-тетрагидротиофен-2,4-дион (№ 1), 5-(3'хлорфенил-метилиден)-3-(3'-хлорциннамоил)-(3Н,5Н)-тетрагидротиофен-2,4-дион (№ 2), 5-(4′бромфенилметилиден)-3-(4'-бромциннамоил)-(3Н,5Н)-тетрагидротиофен-2,4-дион (№ 3).
Источники информации:
1. Брокерхоф X., Дженсен Р. Липолитические ферменты. - М.: Мир, 1978. - С. 356.
2. Литвинко Н.М. Активность фосфолипаз А2 и С при биохимическом моделировании. Мн., 2002.
3. Литвинко Н.М., Кисель М.А. Эндогенные фосфолипазы А2. Структура и функция. Мн.: Наука и техника, 1991. - 270 с.
4. Vaskovsky V.E., Kostetsky E.V., Vasendin L.M. // Chromatogr. - 1975. - V. 114. - № 1. P. 129-141.
5. Иммунологические методы / Под ред. Фримеля. - М., 1987. - 472 с. (прототип).
6. Патент РБ 5752, МПК G 01N 33/15, C 12 Q 1/34, 2003.
Национальный центр интеллектуальной собственности.
220034, г. Минск, ул. Козлова, 20.
5
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
0
Размер файла
965 Кб
Теги
патент, 10604
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа