close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Pseudomonas

код для вставкиСкачать
МАКАРЕНКО АЛЕКСАНДР АЛЕКСАНДРОВИЧ
БИОСЕНСОРЫ ДЛЯ ДЕТЕКЦИИ
СУЛЬФОАРОМАТИЧЕСКИХ И ФЕНОЛЬНЫХ
СОЕДИНЕНИЙ НА ОСНОВЕ БАКТЕРИЙ РОДОВ
COMAMONAS И PSEUDOMONAS - ДЕСТРУКТОРОВ пТОЛУОЛСУЛЬФОНАТА И ФЕНОЛА
03.00.23 - биотехнология
Лаборатория биосенсоров ИБФМ РАН
им. Г.К.Скрябина
Научный руководитель
д.х.н. Решетилов А.Н.
1
Окружающая среда и проблемы мониторинга ее объектов
Микробные биосенсоры
Практическое
применение
Толуолсульфонат
Изучение параметров
биодеградации
Фенол
Микроорганизмыдеструкторы
2
Цель работы
Создание биосенсоров электрохимического типа для детекции сульфоароматических и фенольных соединений
на основе бактерий родов Comamonas
и Pseudomonas, являющихся деструкторами п-толуолсульфоната и фенола,
соответственно.
3
Задачи:
1. На основании имеющихся литературных данных произвести
выбор штаммов, обладающих характеристиками, требуемыми для
формирования биорецепторного элемента сенсоров для детекции
п-толуолсульфоната и фенола и определить вид преобразования
сигнала.
2.
Оценить
характеристики
процесса
деградации
птолуолсульфоната свободными и иммобилизованными клетками
Comamonas testosteroni BS1310 (pBS1010) в периодических и
непрерывных условиях. Разработать лабораторные макеты
биосенсоров на основе бактерий Comamonas testosteroni BS1310
(pBS1010) и бактерий рода Pseudomonas с использованием
амперометрической детекции (кислородного электрода типа
Кларка). Оценить возможность использования колоночного и
мембранного сенсоров.
3. Выполнить сравнительную оценку характеристик биосенсоров
для
детекции
п-толуолсульфоната
на
основе
плазмидсодержащего и бесплазмидного штаммов C. testosteroni
BS1310 (pBS1010) и для детекции фенола на основе
плазмидсодержащего и бесплазмидного штаммов Pseudomonas.
4. Используя активный ил водоочистных сооружений в качестве
биологического материала в реакторе с непрерывной подачей
субстрата, оценить параметры процесса промышленных стоков
от фенола. На основании полученных данных представить
предложения по оптимизации процесса очистки сточных вод
нефтеперерабатывающего производства.
Окружающая среда и проблемы мониторинга ее объектов
Микробные биосенсоры
Практическое
применение
Толуолсульфонат
Изучение параметров
биодеградации
Фенол
Микроорганизмыдеструкторы
5
Биодеградация ТС свободными и иммобилизованными
клетками C.testosteroni BS1310 (pBS1010) в периодических условиях
Схема деградации ТС по мета-пути (Балашов, 1997)
Ê î í ö å í òð à ö è ÿ ÒÑ, ì Ì
OH
OH
1 .2 5
NADH
CH3
SO3Na
O2
CH3
CH3
OH
SO32-
COO
H
1 .0 0
O
O2
2H2O
0 .7 5
HCOO-
0 .5 0
O
O
HO
OH
CH3
O
CH3 CH3
0 .2 5
CO
OH
0 .0 0
0
2
4
6
8
10
12
Âð å ì ÿ, ÷à ñ
È ì ì î á è ë è çî â à í í û å
Ñâ î á î ä í û å
Активность иммобилизованных клеток ниже на 25% по сравнению со
свободными. Стехиометрическое соотношение ТС и кислорода 1:2
14
Ñòåï åí ü ð àçë î æ åí è ÿ ÒÑ, %
40
11,7
10,0
30
8,3
20
6,7
5,0
10
Ñòåï åí ü ðàçë î æ åí è ÿ ÒÑ
3,3
Ï ðî è çâ î ä è òåë üí î ñòü ï ðî ö åññà
0
1,7
10
20
30
40
50
Ñê î ðî ñòü ï ðî òî ê à, ÷ -1
60
70
Ï ð î ä ó ê òè â í î ñòü, í ì î ë ü ì è í -1 ì ã -1 ê ë åòî ê
Деградация ТС в непрерывных условиях клетками C.testosteroni
Исследован
процесс
деградации
п-толуолсульфоната
свободными
и
иммобилизованными клетками Comamonas testosteroni BS1310 в периодических и
непрерывных условиях. Потребление кислорода при разрушении птолуолсульфоната происходит в стехиометрическом соотношении 2:1 (кислород:
п-толуолсульфонат) свободными и иммобилизованными клетками.
Окружающая среда и проблемы мониторинга ее объектов
Микробные биосенсоры
Практическое
применение
Толуолсульфонат
Изучение параметров
биодеградации
Фенол
Микроорганизмыдеструкторы
8
Калибровка сенсора для ТС на основе
штамма C. testosteroni
0,5
0 ,0 3 5
0 ,0 3 0
Î òâ åò ñåí ñî ðà, í À /ñ
Î òâ åò ñåí ñî ð à, í À /ñ
0 ,0 4 0
0 ,0 2 5
0 ,0 2 0
0 ,0 1 5
0 ,0 1 0
Ó ð î â åí ü ø ó ì à
Ê àë è á ð î â î ÷í àÿ ê ð è â àÿ
0 ,0 0 5
0 ,0 0 0
Ê àë è á ð î â î ÷í àÿ ê ð è â àÿ
Ó ð î â åí ü ø ó ì à
0,4
0,3
0,2
0,1
0,0
0
5
10
15
20
25
30
1
Ê î í ö åí òð àö è ÿ ÒÑ, ì ê Ì
10
100
1000
10000
Ê î í ö åí òðàö è ÿ ÒÑ, ì ê Ì
9
Зависимость ответов моделей сенсоров на основе
плазмидного и бесплазмидного вариантов штамма C.
testosteroni от концентрации клеток в биорецепторном
элементе
0,10
p B S 1 0 1 0 (T S 2 5 ì Ì )
Ýë è ì è í àí ò (ýòàí î ë 1 0 ì Ì )
Ñè ãí àë ñåí ñî ðà, í À /ñ
0,08
0,06
0,04
0,02
0,00
0
30
60
90
120
Ê î í ö åí òð àö è ÿ ê ë åòî ê , ì ã/ì ë
150
10
Субстратная специфичность сенсоров на основе
плазмидного и бесплазмидного вариантов штамма
C. testosteroni BS1310
0.18
Ответ, нА/с
0.16
C. testosteroni BS1320
0.14
C. testosteroni BS1310 (pBS1010)
0.12
0.1
0.08
0.06
0.04
0.02
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
Субстрат, 10 мМ
1 – толуолсульфонат
2 – фенол
3 – салицилат
4 – бензоат
5 – бензолсульфонат
6 – сульфобензоат
7– катехол
8 – алкилбензолсульфонат
9 – арабиноза
10 – арабит
11 – глицерин
12 – этанол
13 – глюкоза
14 – ксилоза
15 - ксилит
16 - метанол
17 - сорбит
18 - цитрат
19 - ацетат
20 - сорбоза
21 - ДДС-Na
На основе штамма C. testosteroni BS1310
(pBS1010)
создан
сенсор,
позволяющий
производить экспресс-анализ п-толуолсульфоната.
Нижний предел детекции составлял 5 мкМ,
верхний – 1 мМ. Чувствительность сенсора по
отношению к тололсульфонату составляла 0.17
нА/с.
Селективность
в
отношении
птолуолсульфоната сенсора, основанного на
плазмидсодержащих бактериях, в 11 раз
превышает селективность сенсора на основе
бесплазмидного штамма.
Окружающая среда и проблемы мониторинга ее объектов
Микробные биосенсоры
Практическое
применение
Толуолсульфонат
Изучение параметров
биодеградации
Фенол
Микроорганизмыдеструкторы
13
Субстратная специфичность фенолутилизирующих штаммов
74-1
74-3
89-1
81-1
50-III
мВ/см
0.018
0.016
32-1
0.014
45-1
0.012
A-13
0.01
394(p20)
0.008
0.006
0.004
0.002
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22
10 мМ
Штамм 32-I наиболее селективен
по отношению к фенолу и имеет
1-фенол, 2-этанол, 3-глицерин, 4-сорбит, 5- наибольшую амплитуду сигнала
сорбоза, 6-ксилоза, 7-бутанол, 8-изопропанол, 9- на введение этого вещества
глюкоза, 10-катехол, 11-нафталин, 12-арабит, 13ксилит, 14-метанол, 15-пропанол, 16-изобутанол,
17-ацетат,
18-п-толуолсульфонат,
19бензолсульфонат,
20-арсенит,
21динитроортокрезол, 22-гранозан.
Наличие
плазмиды
у
штамма 32-I определили в
Лаборатории
био-логии
плазмид ИБФМ РАН
Субстратная специфичность сенсоров на основе плазмидного и
бесплазмидного вариантов штамма 32-I
0.18
0.16
Элиминант
Плазмидный вариант
Ответ, нА/с
0.14
0.12
0.1
0.08
0.06
0.04
0.02
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
Субстрат, 10 мМ
Субстраты вводились в концентрации 10 мМ. Обозначение субстратов: фенол –1,
катехол – 2, салицилат – 3, гентизат – 4, бензоат – 5, ДНФ – 6, ДНОК – 7 ,глюкоза
– 8, сорбоза – 9, ксилоза -10, галактоза – 11, манноза – 12, изопропанол – 13,
этанол – 14, бутанол – 15, метанол – 16.
Калибровка сенсора на основе штамма 32-I по фенолу
Ñè ãí àë ñåí ñî ðà, í À /ñ
0,24
Угнетающее/ингибирующее
влияние субстрата
0,20
0,16
0,12
0,08
0,04
0,00
0,01
Рабочий диапазон
сенсора
0,1
1
10
Ê î í ö åí òðàö è ÿ ñóá ñòðàòà, ì Ì
Произведен скрининг свойств
28 бактериальных штаммов
рода Pseudomonas, полученных
из образцов почв, загрязненных
нефтепродуктами.
100
Штамм 32-I характеризовал-ся
наибольшей скоростью роста
на феноле и был использован
как основа биосенсора для
детекции фенола.
Нижний предел детекции фенола в
модельных условиях составлял 5 мкМ,
верхний
300
мкМ.
Выполнено
сравнительное исследование субстрат-ной
специфичности биосенсоров на основе
плазмидсодержащего
и
бесплазмидного
штаммов 32-I. Селективность в отношении
фенола
сенсора,
основанного
на
плазмидсодержащих бактериях, в 17 раз
превышает селективность сенсора на основе
бесплазмидного штамма.
Окружающая среда и проблемы мониторинга ее объектов
Микробные биосенсоры
Практическое
применение
Толуолсульфонат
Изучение параметров
биодеградации
Фенол
Микроорганизмыдеструкторы
18
Ñí è æ åí è å ê î í ö åí òðàö è è ô åí î ë à, %
Деградация фенола иммобилизованным активным илом в реакторе
колоночного типа
30
25
20
2
15
10
1
5
0
ê î í òðî ë ü
h = 30 m m h = 60 m m h = 90 m m
Âû ñî òà ê î ë î í ê è , ì ì
Кривая 1 – деградация на колонке без аэрации. Наблюдается лимит
по кислороду.
Кривая 2 – деградация на колонке с аэрацией, пропорциональная
зависимость степени деградации от высоты колонки.
Выводы
1. Создана модель микробного биосенсора, обладающего
высокой чувствительностью и селективностью в
отношении сульфоароматических соединений. В основе
биорецептора использован штамм C. testosteroni BS1310
(pBS1010)
несущий
плазмиду
биодеградации
сульфоароматических соединений pBS1010. Показано,
что биосенсор мембранного типа позволяет0 производить
экспресс-анализ п-толуолсульфоната в модельных средах
в диапазоне детекции 5 – 1000 мкМ. Чувствительность
сенсора по отношению к толуолсульфонату составляет
0.17 нА/с при концентрации 1 мМ. Использование
плазмидсодержащих бактерий в сенсоре позволяет в 11
раз
повысить
селективность
в
отношении
птолуолсульфоната по сравнению с сенсором на основе
бесплазмидного штамма.
2. Для упрощенной модели дифференциальной
детекции произведена оценка возможной ошибки
измерения
целевых
соединений
толуолсульфоната
и
фенола
на
фоне
исследованных мешающих примесей. Нашли, что
погрешность детекции составила бы 24% при
определении
п-толуолсульфоната, 11% при
определении
общего
содержания
сульфоароматических
соединений,
35% при
определении фенола и 12% при определении
общего содержания ароматических соединений в
случае равной концентрации как мешающих, так и
целевых соединений. При анализе реальных
сточных вод, содержащих преимущественно
целевые
соединения,
погрешность
должна
существенно снизиться.
3. Впервые экспериментально показали, что
окисление
п-толуолсульфоната
бактериальными
клетками
Comamonas
testosteroni BS1310 как в свободном, так и в
иммобилизованном состоянии происходит в
стехиометрическом
соотношении
2:1
(кислород: п-толуолсульфонат). Полученные
данные составили основу для выбора типа
биорецептора – мембранного или колоночного
- при создании биосенсора для детекции
данного соединения.
4. Бактериальный штамм, принадлежащий к
роду Pseudomonas (рабочая маркировка "32I"), использовали как основу биосенсора для
детекции фенола. Измерение концентрации
фенола было возможно в диапазоне 5 - 300
мкМ. Нашли, что в отношении фенола
селективность
сенсора,
основанного
на
плазмидсодержащих бактериях, в 17 раз
превышает селективность сенсора на основе
бесплазмидного штамма. Изучили параметры
биосенсора и их зависимость от внешних
условий.
5. На основании выполненных тестов с
активным
илом,
имитирующим
функционирование биологического материала в
составе биосенсора, представили рекомендации
по
оптимизации
работы
водоочистных
сооружений
нефтеперерабатывающего производства, заключающиеся в проведении контроля степени
оксигенации стоков. Полученные данные
позволили на практике на 17% увеличить
степень очистки стоков, содержащих фенол
(оценка по индексу ХПК).
24
Документ
Категория
Презентации
Просмотров
7
Размер файла
1 301 Кб
Теги
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа