close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

ЗАНЯТИЕ 3 Структура бактериальной клетки. сложные методы окраски

код для вставкиСкачать
Занятие № 3
Тема: « Морфология и систематика микроорганизмов».
Структура бактериальной клетки. Сложные методы окраски.
Цель занятия: Изучить структуру микробной клетки. Освоить: метод
окраски бактерий по Граму, выявление зерен волютина по Нейссеру, окраску
капсул у бактерий по Бурри-Гинсу, окраску спор по Пешкову.
Материалы и оборудование: Микроскоп, предметные стекла, бактериологическая петля, дистиллированная вода, растворы красок, этиловый спирт 96%,
пробирки с микробными культурами, иммерсионное масло, фильтровальная
бумага.
Контрольные вопроссы:
1. Строение микробной клетки.
2. Клеточная стенка Гр (+) и Гр (-) бактерий. Механизм и теория окраски
по Граму.
3. Структура цитоплазмы, включений. Природа гранул волютина и методы
окраски.
4. Клеточная стенка, капсула бактерий. Значение, методы выявления.
5. Споры и спорообразование у бактерий. Принцип окраски спор у
бактерий.
6. Строение жгутика, пили. Типы движения микробов.
ИНФОРМАЦИОННЫЙ МАТЕРИАЛ
I.Состав и функции структур бактериальной клетки
Сложные методы окраски используют для выявления различных
компонентов бактериальных клеток и для дифференциации бактерий в
зависимости от химического состава и ультраструктуры. Для сложных методов
окрашивания, в отличии от простых, используется не менее двух различных
красителей, один из которых является основным а другой дополнительным.
В бактериальной клетке имеются облигатные органоиды, к которым
относят клеточную стенку, цитоплазматическую мембрану, цитоплазму,
нуклеоид, рибосомы, мезосомы и факультативные органоиды: капсула,
жгутики, фимбрии, пили, споры, плазмиды, включения.
Нуклеоид бактерий представлен двунитчатой ДНК, замкнутой в кольцо, и
расположен в центре клетки. Основными отличительными чертами ядерной
субстанции бактерий от эукариотических клеток являются: 1) отсутствие
ядерной оболочки, 2) отсутствие ядрышка, 3) отсутствие гистонов.
Для
обнаружения бактериального ядра необходимо применение электронной
микроскопии или применение окраски по способу Фельгена или по
Романовскому-Гимза.
Кроме нуклеоида, в цитоплазме бактериальной клетки могут находиться в
сотни раз более короткие нити ДНК – так называемые внехромосомные
факторы наследственности, получившие название плазмид. Как выяснено,
плазмиды не обязательно имеются у бактерий, но они придают организму
1
дополнительные, полезные для него свойства, в частности связанные с
размножением,
устойчивостью
к
лекарственным
препаратам,
болезнетворностью и др.
Рибосомы — органоиды, осуществляющие биосинтез белка. Состоят из
белка и РНК. Рибосомы бактерий состоят из двух субъединиц и имеют
коэффициент седиментации 70S.
Коэффициент седиментации (sedimentation coefficient ) - показатель
скорости осаждения микрочастиц при центрифугировании и измеряется в
единицах S (по имени Т.Сведберга, сконструировавшего в 1923 первую
центрифугу): 1S=1·10-13 сек.
Клеточная стенка. Клеточная стенка — оболочка клетки, расположенная
снаружи от цитоплазматической мембраны и выполняющая структурные,
защитные и транспортные функции. Обнаруживается у большинства бактерий,
архей, грибов и растений. Животные и многие простейшие не имеют клеточной
стенки.
Клеточная стенка обязательна для всех прокариот, за исключением
микоплазм и L-форм бактерий (бактерии, полностью или частично лишенные
клеточной стенки, поэтому имеют своеобразную морфологию в виде крупных и
мелких сферических клеток
Клеточные стенки бактерий состоят из пептидогликана (муреина) и
бывают двух типов: грамположительного и грамотрицательного. Клеточная
стенка грамположительного типа состоит исключительно из толстого слоя
пептидогликана, плотно прилегающего к клеточной мембране и пронизанного
тейхоевыми и липотейхоевыми кислотами.
При грамотрицательном типе слой пептидогликана существенно тоньше,
между ним и плазматической мембраной находится периплазматическое
пространство, а снаружи клетка окружена ещё одной мембраной,
представленной т. н. липополисахаридом и являющаяся пирогенным
эндотоксином грамотрицательных бактерий.
Структура и химический состав клеточной стенки различны у грам+ и
грам- бактерий.
Различия в строении клеточной стенки Грам+ и Грам- микроорганизмов
представлены в таблице 3.1
Таблица 3.1
Различия в строении клеточной стенки Грам+ и Грам- бактерий.
Признаки
Грам+
Грам−
Толщина клеточной
стенки (нм)
10-25
9-10
Структура клеточной
стенки
однородная
неоднородная
2
Компоненты клеточной
стенки:пептидогликан
95% многослойный
5-10% однослойный
тейхоевые кислоты
+
−
белки
небольшое количество
много
липиды
2,5%
25%
липополисахариды
−
много
рибонуклеат магния
+
−
Клеточные стенки грибов состоят из хитина и глюканов. Большинство
водорослей имеют клеточную стенку из целлюлозы и различных
гликопротеинов. Диатомовые водоросли синтезируют свою клеточную
стенку из кремнезёма. Включения дополнительных полисахаридов имеют
большое таксономическое значение.
Цитоплазматическая мебрана и ее производные. Цитоплазматическая
мембрана (плазмолемма) — полупроницаемая липопротеидная структура
бактериальных клеток, отделяющая цитоплазму от клеточной стенки. Она
является обязательным полифункциональным компонентом клетки и
составляет 8—15 % ее сухой массы. Разрушение цитоплазматической
мембраны
приводит
к
гибели
бактериальной
клетки.
Цитоплазматическая мембрана состоит обычно из двойного слоя липидов,
каждая из поверхностей которого покрыта мономолекулярным слоем белка.
Цитоплазматическая мембрана играет роль осмотического барьера. Она
обладает избирательной проницаемостью, и благодаря этому регулирует водносолевой обмен клетки, транспорт питательных веществ в клетку и выведение
наружу продуктов обмена. В этих процессах участвуют ферменты пермеазы.
Кроме того, здесь имеются ферменты, осуществляющие биологическое
окисление.
Мезосомы. Цитоплазматическая мембрана путем инвагинации внутрь
клетки образует мембранные структуры - мезосомы. Мезосомы, как и
цитоплазматическая мембрана, являются центрами дыхательной активности
бактерий, поэтому их иногда называют аналогами митохондрий. Они
увеличивают рабочую поверхность мембран.
Геном клетки (ДНК) связан с мезосомой, и отсюда начинается процесс
репликации ДНК при делении клетки. Мезосомы принимают участие в
процессе спорообразования, в синтезе некоторых веществ.
Существуют различные виды мезосом: трубчатые – Тубулы, в виде
пузырьков – Везикулы, пластинчатые – Тилакоиды. Мезосомы, несущие
пигменты у фотоавтотрофов – Хроматофоры.
Цитоплазма – коллоидная система, состоящая из воды (70-80%),
протеинов, жиров, углеводов, минеральных веществ, содержит органеллы
3
(нуклеоид, рибосомы, мезосомы) и включения (гранулы, содержащие крахмал,
гликоген, серу, волютин и т.д.).
Включения. В циотоплазме некоторых бактерий имеются запасы
питательных веществ в виде включений, которые можно обнаружить при
помощи различных методов окрашивания. Например, в цитоплазме у С.
diphtheriae присутствуют зерна волютина, они являются включениями
фосфатов. Для выявления зерен волютина применяют окраску по методу
Нейссера.
Жгутики имеются у подвижных бактерий. Они состоят из белка
флагеллина. Оределение подвижности бактерий имеет диагностическое
значение. По числу жгутиков и их расположению бактерии делятся на
монотрихи, имеющие один жгутик, лофотрихи с пучком жгутиков на одном
конце клетки, амфитрихи имеют жгутики на обоих концах, и перитрихи, у
которых жгутики расположены вокруг тела. (Рис. 3.1).
Рис. 3.1. Расположение жгутиков у микроорганизмов.
Жгутики можно обнаружить при электронной микроскопии после
обработки тяжелыми металлами или в световом микроскопе после окраски по
методу Леффлера, серебрения по Морозову.
Фимбрии и пили представляют собой нитевидные образования,
расположенные на поверхности бактериальной клетки, состоящие из белка
пилина.
Пили 1-го порядка (фимбрии, ворсинки, реснички) покрывают поверхность
бактериальной клетки в количестве от нескольких сотен до нескольких тысяч.
Существует несколько разновидностей фимбрий, которые отличаются друг от
друга по выполняемым функциям: адгезия, питание, водно-солевой обмен.
Пили 2-го порядка (коньюгативные, половые, секспили) возникают на
поверхности бактерий (1-4 на клетку) в процессе конъюгации и выполняют
функцию органелл, через которые происходит передача генетического
материала (ДНК) от мужских клеток-доноров к реципиенту (имеются только у
бактерий-доноров).
4
Таблица 3.2.
Состав и функции поверхностных структур бактериальной клетки
Структура
Клеточная стенка
Гр(+)
бактерий
однослойная
Клеточная стенка
Гр(-) бактерий
многослойная
Капсулы
Функции
Механическая защита,
жесткость формы,
проницаемость
Механическая защита,
жесткость формы,
проницаемость
Защитная- от
фагоцитоза,
во внешней среде -от
высыхания
Химический состав
Пептидогликан (40-90%)
Тейховые кислоты,
белки
Пептидогликан 5-10 %
липополисахары,
белки
Полисахариды, полипептиды,
мукополисахариды
Полисахариды,
белки,
липиды
Цитоплазматическа
я
мембрана +
мезосомы
Проницаемость,
биосинтез,
перенос электронов,
прикрепление и
разделение
ДНК
Жгутики
Секс-пили
Движение
Конъюгационный
канал
Белки (пилиныны)
Пили общего
Адгезия
Пилин
Белок (флагеллин)
назначения
ІІ. Механизм и теория окраски по Граму
В 1885 г. датский врач Христан Грам предложил метод окраски бактерий,
при котором одни бактерии окрашивались в фиолетовый цвет (их назвали
грамположительными); другие – в красный (грамотрицательные). Сам автор не
смог объяснить механизм такого окрашивания. Позже было установлено, что
характер окраски бактерий зависит от особенностей строения клеточной
стенки.
Сущность метода окраски по Граму связана с тем, что у грамположительных микроорганизмов генцианвиолет в присутствии йода образует в
протоплазме комплекс йодпарарозамин, который не растворяется в спирте и
ацетоне благодаря наличию магниевой соли. Такие бактерии окрашиваются в
сине-фиолетовый цвет. Клетки грамотрицательных видов этим свойством не
5
обладают, и спирт обесцвечивает их, а при последующем докрашивании
фуксином они приобретают розовый или красный цвет.
III. Зерна волютина
Волютин - один из типов включений, резерв фосфата и источник
потенциальной клеточной энергии. Непостоянно присутствует у Azotobacter,
Spirillum volutans, Bac.subtilis в клетках дрожжей и некоторых патогенных
бактерий – возбудителей сибирской язвы и дифтерии. Метахроматическим
свойством обязан наличию полифосфата. Недостаток любого из питательных
веществ приводит к образованию волютина. Недостаток сульфата сказывается
особенно эффективно, вызывая быстрое накопление полифосфата. Когда
клетки, создавая запас полифосфата, снова снабжаются сульфатом, полифосфат
исчезает и включается в нуклеиновые кислоты.
Образование полифосфата происходит путем последовательного присоединения остатков фосфата к пирофосфату при участии АТФ:
При окрашивании зерна запасных питательных веществ адсорбируют иные
красители, нежели протоплазма, и поэтому окрашиваются в другие цвета.
IV.Капсулы бактерий
Клетки многих микроорганизмов в процессе роста их на средах, богатых
углеводами, могут быть окружены рыхлым слизистым слоем - капсулой,
состоящей из полисахаридов, полипептидов, мукополисахаридов и т.д. Капсулу
образуют возбудители сибирской язвы, диплококковой септицемии (рис. 3.2) и
др.
Капсулы несут защитную функцию от фагоцитоза и антител, а во внешней
среде – от высыхания.
Анатомически различают: а) микрокапсулу толщиной менее 0,2 мкм - не
выявляется с помощью оптического микроскопа, различается химическими и
серологическими способами; в) макрокапсулу > 0,2 мкм - цитологически
хорошо видна в световой микроскоп.
Капсула служит защитным покровом клетки и участвует в водном обмене,
предохраняя клетку от высыхания, но она не является обязательной структурой
бактериальной клетки: потеря ее не приводит к гибели бактерии.
Капсула — полифункциональный органоид, выполняющий важную
биологическую роль. Она является местом локализации капсульных антигенов,
определяющих вирулентность, антигенную специфичность и иммуногенность
бактерий. Утрата капсулы у патогенных бактерий резко снижает их
вирулентность, например у бескапсульных штаммов бациллы антракса
(сибиреязвенный вакцинный штамм СТИ-1). Капсулы обеспечивают
выживание бактерий, защищая их от механических повреждений, заражения
фагами, токсических веществ, а у патогенных форм — от действия защитных
сил макроорганизма: инкапсулированные клетки плохо фагоцитируются. У
некоторых видов бактерий, в том числе и патогенных, способствует
прикреплению клеток к субстрату.
6
Вещества капсулы слабо фиксируют краситель, который легко отмывается. Выявить капсулы можно с помощью метода “негативного контрастирования” с использованием жидкой туши.
Для окрашивания капсул применяют специальные методы —
Романовского — Гимзы, Гинса — Бурри, Ольта, Михина и др.
Метод Михина
1. Фиксированный мазок-отпечаток, приготовленный из патматериала,
окрашивают метиленовой синью при подогревании до 7 мин.
2. Промывают водой.
Микрокартина: капсула – бледно-розовая, бактерии – синие.
Рис. 3.2. Капсула у бактерий: а – бацилла сибирской язвы; б – диплококк/
Метод Олъта
1. Фиксированный мазок-отпечаток, приготовленный из патматериала,
окрашивают 2%-ным раствором сафранина при легком подогревании 5-7 мин.
2. Слегка промывают водой.
Микрокартина: капсула – желтая, бактерии – красные.
Микрокартину зарисовать.
Метод Романовского-Гимзе
1. Фиксированный мазок-отпечаток помещают мазком вниз в чашку
Петри, на дне которой устанавливают подставки (спички). Под препарат
наливают краску Гимзе. Краску предварительно разводят дистиллированной
водой 1:10.
2. Окрашивают разведенной краской Гимзе 50-60 мин.
3. Промывают водой.
Микрокартина: капсула – бледно-розовая, бактерии – синие.
Обнаружение капсул у микробов является видовым признаком.
V. Споры бактерий
Образование спор у бактерий рассматривается как один из этапов в
жизненном цикле клетки, связанный с переживанием неблагоприятных условий
среды (Вас. аnthracis, С. tetani). Спорообразование способствует сохранению
7
вида и не является способом размножения. К спорообразованию способны
только бациллярные формы. В период образования спор в бактериальной
клетке наблюдается высокий уровень обменных процессов, появляется
дипиколиновая кислота, которая в соединении с солями кальция придает споре
высокую термостойкость. Зрелая спора представлена цитоплазмой с тяжами
ядерного вещества. Цитоплазма покрыта цитоплазматической мембраной и
многослойной оболочкой: внутренней -интиной, средней -кортексом, и
наружной -экзиной. Некоторые виды бактерий на поверхности имеют
экзоспориум.
У клостридий спора превышает диаметр клетки, у бацилл – нет. Форма
спор может быть овальной или округлой.
Споры химически инертны, поэтому окрашиваются с трудом. Методы
окраски спор основаны на применении протрав - обычно слабых кислот,
разрыхляющих оболочки споры, и дальнейшей окраске мазка сильным
красителем при нагревании. Окрасившийся протопласт споры обладает
высокой кислотоустойчивостью по сравнению с протопластом вегетативной
клетки. Он не обесцвечивается при дифференциации мазка в кислоте и
сохраняет воспринятую им окраску. Вегетативные клетки бактерий полностью
отмываются в кислоте и на препарате имеют цвет дополнительного красителя.
Для выявления спор чаще всего используют окраску по методу Пешкова,
Ожешки.
Ход работы:
I. Приготовить препарат из зубного налета и окрасить по Граму.
 На фиксированный мазок положить бумажку Синева, смоченную
дистиллированной водой или на препарат положить полоску фильтровальной
бумаги и обильно пропитать её 1%-ным раствором генцианвиолета. Выдержать
2 минуты.
 Бумажку снять и, не промывая препарат от краски, на мазок добавить 3-4
капли раствора Люголя на 1-2 минуты;
 После этого раствор Люголя слить ( наклоняют препарат) и на мазок
налить 96о- ный этиловый спиртй на 10-20 секунд (или йодированный спирт на
30 секунд).;
 Затем препарат тщательно промыть водой и на мазок налить раствор
фуксина Пфейфера на 2 минуты;
 Краску смыть водой и препарат высушить фильтровальной бумагой.
Микроскопическая картина:
грамположительные бактерии – фиолетовые
грамотрицательные бактерии –розовые
II. Приготовить препарат из культуры (пробирка № 1) и окрасить по
Нейссеру.
 Приготовить тонкий мазок клеток, высушить его на воздухе и
зафиксировать в пламени спиртовки;
8
 На фиксированный мазок налить уксуснокислый метиленовый синий и
окрасить клетки в течение 1 минуты;
 Краситель слить, препарат промыть водой, добавить раствор Люголя на
20-30 секунд и окрасить хризоидином 10-15 минут;
 После промыть водой, высушить и микроскопировать с иммерсионной
системой. При этом клетки окрашиваются в желтый цвет, а зерна волютина – в
сине-черный.
 Промикроскопировать и зарисовать.
 Приготовить препарат из культуры азотобактера (пробирка № 2).
 На конец предметного стекла бактериологической петлей нанести каплю
черной туши, внести в нее клетки азотобактера, хорошо перемешать и ребром
покровного стекла сделать мазок;
 Препарат высушить на воздухе и зафиксировать на 5-10 минут смесью
Никифирова или на 3 минуты 96%-ным спиртом;
 Далее мазок окрасить карболовым фуксином Циля, разбавленным водой в
соотношении 1:3. Время окрашивания - 2-3 минуты;
 Препарат промыть водой, высушить на воздухе и микроскопировать с
иммерсионной системой. На темно-сером фоне препарата контрастно
выделяются розово-малиновые клетки бактерий, окруженные бесцветными
капсулами.
 Промикроскопировать и зарисовать.
II. Приготовить препарат из культуры "СТИ" (пробирка № 3), окрасить по
Пешкову.
 На обезжиренное предметное стекло бактериологической петлей внести
культуру "СТИ" ;
 Приготовить мазок, высушить его на воздухе, зафиксировать в пламени
спиртовки и залить раствором метиленового синего по Леффлеру;
 Краситель довести до кипения, держа предметное стекло над пламенем
спиртовки. Продолжительность окраски с момента закипания‒ 10-20 секунд;
 Затем предметное стекло охладить, препарат тщательно промыть водой,
после чего клетки в течение 30 секунд докрасить 0.5%-ным водным раствором
нейтрального красного;
 Краситель слить, препарат промыть водой и просмотреть с иммерсионной системой. При правильном окрашивании клетки имеют красный, а споры
- синий цвет.
 Промикроскопировать и зарисовать, отметив наличие спор.
Тесты для проверки знаний:
I. Установить соответствие структуры клеточной стенки:
1.Гр (+) а) содержит тейхоевые кислоты;
2.Гр (-) б) есть наружная мембрана;
в) пептидогликана 5-10 %;
г) содержит ЛПС;
9
д) пептидогликан многослойный.
Ответ: 1. а, д
2. б, в, г
2. Определить правильную последовательность окраски зерен волютина по
Нейссеру: 1) раствор Люголя; 2) промыть водой; 3) уксуснокислая синька; 4)
хризоидин.
Ответ: 3, 1, 2, 4, 2
Ключевые слова: клеточная стенка, пептидогликан, тейхоевые кислоты,
капсула, споры, жгутики, пили, включения, волютин, мезосомы.
10
Автор
ДонАгрА-З
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
15
Размер файла
852 Кб
Теги
структура, метод, сложные, бактериальной, окраски, занятие, клетка
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа