close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Индуцированный мутагенез (количественные аспекты)

код для вставкиСкачать
Индуцированный мутагенез
(количественные аспекты)
А.В. Рубанович
Учреждение Российской академии наук
Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН
rubanovich@vigg.ru
История
XIX век – Август Вейсман:
безуспешные попытки изменить наследственность
используя температуру, влажность и механические
воздействия.
1925 – Г. А. Надсон (и его сотрудник Г. С. Филиппов) Ленинградский Институт рентгенологии и радиологии:
после
воздействия- рентгеновых
лучей вырастали
Расстрелян
1939
колонии дрожжей, отличавшиеся величиной, формой и
окраской.
1927 - Герман Джозеф Меллер - V Международный
генетический конгресс в Берлине: первые удачные
Нобелевская
премия - 1946
опыты по искусственному
вызыванию рецессивных
мутаций с помощью рентгеновых лучей у дрозофилы.
1927 - Л. Стадлер: искусственные мутации у ячменя и
кукурузы после воздействия рентгеновых лучей.
Биологическое действии радиации осознали
значительно раньше!
1901 - Первый описанный случай радиационного
ожога кожи
1906 - Первый летальный исход (США)
1911 - Первый описанный случай радиационноиндуцированной лейкемии
1946 – Первое описание «клинического синдрома
обусловленного атомной бомбардировкой»
1936 - Обелиск в Гамбурге: имена 115 исследователей,
погибших в результате действия радиации
Радиобиологический парадокс:
ничтожная энергия вызывает драматический
биологический эффект!
Полулетальная доза для человека = 4 Гр = 270 Дж = 67 кал
По энергетическим затратам:
1 чайная ложка
горячего кофе
гибель в 50% случаев
=
2 секунды на пляже
=
1920 - Фридрих Дессауер – «теория точечной теплоты»:
радиация отдает энергию порциями, вызывая нагревание отдельных
точек до очень высокой температуры. Далее локальное свертывание
белков, что к ведет биологическому поражению.
Теория мишеней и принцип попадания (1946-1947)
Карл Циммером (Гемания)
Николай Владимирович Тимофеев-Ресовский (Россия)
Дуглас Ли (Великобритания)
Откуда взялись эти положения?
В основном из характера дозовых зависимостей…
Ионизирующие излучения переносят энергию в дискретном виде
Акты взаимодействия (попадания) не зависят друг от друга и
подчиняются пуассоновскому распределению
Исследуемый эффект наступает, если число попаданий в некоторую
чувствительную область (мишень), равно определенному числу раз
Зависимость «доза-эффект» в радиобиологии
Токсические воздействия:
Радиация:
Выживаемость, %
Выживаемость, %
100
100
50
50
Экспонента порога нет!
Доза облучения
Время воздействия,
концентрация
Порог
Плотности распределений
Частота, %
100
S(D)=e-D
Частота, %
100 распределения дозы
Кривая выживания – это функция
(времени воздействия), вызывающей гибель
50
50
Среднее
время
гибели
Время
гибели
Средняя
убивающая
доза
Доза,
вызывающая
гибель
Забудем на время о дозах – будем говорить о
распределениях продолжительности жизни
Человек
Некоторые насекомые
Выживаемость, %
Выживаемость, %
100
100
50
50
75
Возраст
4000
Возраст
Вероятность умереть в следующем
Вероятность умереть в следующем
году увеличивается с возрастом
году не зависит от возраста
Распределение продолжительности
жизни
для бессмертных! Единственная
причина смерти – попадание под
колеса автомобиля.
Экспоненциальная продолжительность
жизни Средняя продолжительность
это распределение «без
о прошлом»
жизнипамяти
4000 лет
Вернемся к зависимостям «доза-эффект»
Не только дозовые зависимости!
Многое проясняет физика
Экспоненциальная зависимость:
взаимодействия
излучений
вероятность наступления
эффекта при
следующей
порции облучения не
с веществом
зависит от предыдущей дозы
Выживаемость, %
100
50
Доза облучения
Положения теории попаданий в мишени
Ионизирующие излучения переносят энергию в дискретном виде
Акты взаимодействия (попадания) не зависят друг от друга и
подчиняются пуассоновскому распределению
Исследуемый эффект наступает, если число попаданий в некоторую
чувствительную область (мишень), равно определенному числу раз
Виды ионизирующих излучений
т.е. способных производить ионизации атомов (выбивать электроны с орбит )
-частиы
Ядро атома
X-лучи
(рентгеновское
излучение)
- -частицы
Рентгеновское излучение
не связано с радиоактивностью
-лучи
Вильгельм Конрад Рентген
и рука его жены (1895)
Природа ионизирующих излучений
Эрнест Резерфорд (1899)
Pb
-частицы:
е-
-
+
-лучи:
-частицы:
-
Фотон
+
+
4Не
2
Число нейтронов
Источник – радиоактиный изотоп, у
Источник
– радиоактиный изотоп, у
Излучение,
которого
ядра
атомов
нестабильны
за Защита
Масса
Заряд
тип радиации
которого
ядра атомов
нестабильны
за
счет избытка
счет
избытка
нейтронов
(или
Ядрадефицита)
гелия
4 нейтронов
+2
Бумага, одежда
n
Электрон
ЭМ-волны
Частица
1/1836
0
1
Пластик, стекло
Свинец, бетон
Вода, парафин
-1
0
0
УФ
X-лучи -лучи
Частота, Гц
Длина
волны, м
Число протонов
Ионизирующая способность
Ионизации и линейная передача энергии (ЛПЭ)
Ионизирующее
излучение
-
Ионизированный атом
-
-
-
-
ЛПЭ = потери энергии ионизирующей частицы
на единицу пути в веществе (E/s)
Высокая ЛПЭ > 20 кэв/мкм
(- частицы, протоны, нейтроны)
Низкая ЛПЭ < 7 кэв/мкм
(-лучи, X-лучи, -частицы)
Прохождение излучений через вещество
Источники опасны
только при
поступлении в
организм
Бумага
-частицы
-частицы
-лучи
Пробег в ткани
0.1 – 3 мкм
Бетон
Единицы измерения доз
Относительная биологическая
ОБЭ
Поглощенная доза – энергия,
выделенная
в 1 кг(ОБЭ)
вещества:
эффективность
излучения
Рентген, грей, бэр, рад, зиверт, рем…?
4 (Гр) =1 Дж/1 кг
1 Грей
3
Экспозиционная доза – мера
ионизации
(только для - и X-лучей) 2
- p+ заряд (одного знака), образующийся
в 1 см3 воздуха
1
0.1
1
10
100
1000
-1 ткани
1 РентгенЛПЭ,
(Р) =кэвмкм
0,0088
Гр
Эффективная или эквивалентная доза – доза с учетом ОБЭ и
радиочувствительности пораженного органа
1 зиверт (Зв) = 100 бэр
Единицы измерения радоактивности
Только
для личного
Дозиметры
меряют
не дозу, апользования!
мощность дозы, т.е.
Cкорость
(Бк)времени
=бэр
1 распад/сек
1 Грраспада
= 100атамов:
рад
1100
Р 100
1 Зв
поглощенную
дозу
вбеккерль
единицу
(Гр/c)
1 Кюри (Кю) = 3,71010 Бк
Положения теории попаданий в мишени
Ионизирующие излучения переносят энергию в дискретном виде
Акты взаимодействия (попадания) не зависят друг от друга и
подчиняются пуассоновскому распределению
Исследуемый эффект наступает, если число попаданий в некоторую
чувствительную область (мишень), равно определенному числу раз
Что является «мишенью»?
Идентификация мишени: ядро, хромосомы, ДНК
Микропучки -частиц с пробегом 40 мкм (210Ро):
избирательное облучение ядра
Микроразрезы: перенос необлученного ядра в облученную цитоплазму
Ядро в 100 раз более чувствительно, чем цитоплазма
Уридин (РНК, цитоплазма) и тимин (ДНК, ядро), помеченные тритием 3Н
(-излучатель, пробег 1-2 мкм)
Сенсибилизация клеток 5-бромдезоксиуридином
(BUdR подобен, но не идентичен тимину)
Радиочувствительность содержание ДНК в клетках:
растения, насекомые, амфибии (объем интерфазных хромосом)
Облучение хромосом в 200-300 эффективней, чем облучение цитоплазмы
Свободный радикал OH
электрическиПрямое
нейтрален, и
нонепрямое
имеет
неспаренный электрон на внешней орбите радиации
высокая реакционная способность
(время
-10
жизни 10 с)
2 мкм
действие
Непрямое действие - радиолиз воды и
возникновение свободных радикалов при
прохождении излучения через цитоплазму:
- наиболее активен радикал OH
(75% повреждений ДНК)
- преобладает при низких ЛПЭ (- и X-лучи)
В любом случае речь идет
о попадании в ДНК-мишень
Прямое действие - непосредственная ионизация
атомов ДНК
- преобладает при высоких ЛПЭ (-частицы, нейтроны)
Действие ионизирующих излучений
На клетку:
«Интерфазная гибель» - мгновенное прекращение метаболизма и
разрушение клетки: большие дозы (> 20 Гр)
«Репродуктивная гибель» - потеря способности к неограниченному
делению: низкие дозы (< 10 Гр):
На хромосомы:
Однонитевые разрывы ДНК (низкое ЛПЭ)
Двунитевые разрывы ДНК (высокое ЛПЭ)
Повреждение оснований (особенно пиримидиновых).
Дальнейшие события:
Репарация
Хромосомные аберрации, мутации генов в половых и
соматических клетках (рак)
«редкихПуассона
событий»:
Попадания в мишени: Распределение
распределение
- число рыбок, пойманных за «время» D
- число изюминок в кексе «объема» D
- число голосов за Жириновского в
- среднее
попаданий при дозе D
квартале
с Dчисло
жителями
объем мишени
Вероятность отсутствия поражений,
т.е. выживаемость при «одноударном»
механизме гибели
…………
Модель гибели «одна одноударная мишень»
Выживаемость, %
100
S(D)=e-D
50
Доза облучения
По оси ординат масштаб:
Удобен «полулогарифмический»
ln S(D)=-D
Выживаемость, %
D37
1
0.37
0.1
Первые правильные оценки
размера генов в хромосомах.
Задолго до «двойной спирали»!
Доза облучения
-
0.01
доза, вызывающая
63% гибели:
1-2 Гр для клеток млекопитающих
500 Гр - вирусы
Модель гибели «несколько одноударных мишеней»
Пусть для инактивации клетки
небходимо попадание в m
мишеней, например при m=2 :
Жива
Жива
Погибла
S(D)=1 – (1-e-D)m
Вероятность попасть в одну
мишень (хотя бы раз!)
Оценка «числа мишеней»!
m
Выживаемость, %
«Плечо»
1
Доза облучения
0.1
0.01
Численные оценки радиочувствительности
Выживаемость, %
D50 - в токсикологии
100
D37 - в радиобиологии
50
37
_
D - в теории вероятностей
_
D50 D37
D = Площадь под кривой
выживания в линейном масштабе
D
Выживаемость, %
Выживаемость, %
100
100
50
50
_
D
D
D
_
D - средняя доза,
вызывающая
гибель
=
Процедура нахождения площади более устойчива к разбросу точек,
по сравнению с алгоритмами вычисления D50 или D37
Одноударные и многоударные эффекты
…………
и т.д. – распределение Пуассона
Одноударный
эффект
Двухударный
эффект
Эффект (мутации, аберрации)
2 удара
1 удар
Доза облучения
Радиационно-специфические аберрации хромосом
Центрические кольца + фрагменты
(2 разрыва в одной хромосоме)
Дицентрики + фрагменты
(2 разрыва в разных хромосомах)
Одноударные и многоударные эффекты
2 разрыва
за 2 удара
D2
1.5
n
X
Частота
дицентриков
Число дицентриков
на клетку
При увеличении
ЛПЭ кривая
становится
одноударной
1.6
1.2
0.8
0.4
0
0
2
4
Доза, Гр
6
2 разрыва
за 1 удар
D
Выход
дицентриков
D+ D2
Доза, Гр
5
Биодозиметрия
Обнаружение хромосомных аберраций в лимфоцитах крови
– доказательство недавнего облучения организма
Возможны более точные оценки индивидуальной дозы по данным,
полученным при облучении лимфоцитов in vitro
Калибровочная регрессия зависимости частоты дицентриков и центрических
колец на дозу -облучения (облучение лимфоцитов in vitro)
y = 0,001 + 0,015 D + 0,063 D2
Частота дицентриков и
цетрических колец на клетку
0,7
Частота
аберраций у
пациента
0,6
Минимальная доза, которую можно выявить
при анализе лимфоцитов составляет 0.1 – 0.2 Гр
0,5
0,4
0,3
0,2
Доза, полученная
пациентом
0,1
0
0
В.А. Шевченко, 2002
0,5
1
1,5
Доза, Гр
2
2,5
3
Репарация
Повреждения ДНК
Частота на Гр
Доля летальных
Изменение оснований
500/Гр
0.01
Однонитевые разрывыАцентрические
1000/Грфрагменты
0.01
исключенные из
Сшивки ДНК-белок хромосом150/Гр
ядер в момент
Двунитевые разрывы клеточных
50/Гр
деления клеток
?
0.95
Частота микроядер/100 клеток
Влияние мощности дозы на частоту микроядер
5
de Toledo et al. 2006
4
3
2
При уменьшении
мощности дозы
1
0
Контроль
10 cГр
(острое)
10 cГр/2 ч
10 cГр/24 ч
10 cГр /48 ч
Репарация – зависимость выживаемости от
мощности дозы
Репарации обнаруживается по изменению наклона кривых «доза-эффект»:
при изменении мощности дозы
при фракционированном облучении
1
10-1
X-лучи: 0,01
Гр/мин
10-2
При увеличении-3
мощности дозы и 10
ЛПЭ
излучения
X-лучи:
1 Гр/мин
10-4
0
2
Нейтроны:
1 Гр/мин
4
6
8
Доза,
Гр
Нейтроны:
0.01 Гр/мин
10
Репарация – зависимость выхода дицентриков от
мощности дозы
Частота дицентриков на клетку
Нейтроны, энергия
0.714.7 Мэв
При увеличении
мощности
2.0 дозы и ЛПЭ
излучения
X-лучи:
1Гр/мин
X-лучи:
0,003 Гр/мин
1.5
1.0
Принцип «беспороговости» и «кумулятивности»
мутационного процесса
0.5
D.C. Lloyd (1981)
0
1
2
3
4
5
Доза, Гр
Выход Х-сцепленных рецессивных леталей у
дрозофилы не зависит от мощности дозы в
диапазоне 0.03 - 100 Гр/час
Проект «MegaMouse» супругов
L. B. Russell & W. L. Russell (1955-1965)
7 морфологических мутаций
7 миллионов мышей!
Индукция морфологических мутаций в потомстве облученных родителей
Пять главных выводов
Выход различных мутаций на 1 Гр различается в 30 раз.
1 Гр
Эффект мощности дозы существенен. Хроническое облучение вызывает
меньше мутаций, чем острое (в отличии от Drosophila)
The frequency
of radiation-induced
mutations is not,
Самцы
более радиочувствительны,
чем самки.
as the classical view holds, independent of dose rate.
Генетические
эффекты
уменьшаются,
W. L. Russell,
L. B.существенно
Russell. Science,
19, 1958
если увеличивается время между облучением и спариванием.
Удваивающая доза для частоты мутаций равна 1 Gy.
Всем спасибо, и еще раз напомню:
Биологические эффекты ионизирующих излучений в основном связаны с
воздействием на ядерное ДНК
Экспоненциальная зависимость выживаемости от дозы означает гибель от
случайных и независимых актов поражения
Квадратичная зависимость от дозы указывает на двухударный механизм
формирования эффекта
Зависимость кривой «доза-эффект» от мощности дозы указывает на
присутствие репарации
Для млекопитающих доза, удваивающая частоту мутаций в потомстве 1 Гр
1 Гр 100 рентген, хотя это разные вещи
Копию презентации можно скачать на сайте ИОГен: www.vigg.ru
Документ
Категория
Презентации
Просмотров
56
Размер файла
5 608 Кб
Теги
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа