close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Съхранение, поддържане и работа със стандартни щамове

код для вставкиСкачать
Съхранение, поддържане и
работа със стандартни щамове
микроорганизми
Д-р Живка Иванова
Микробиолог - КК
Изпитвани щамове
Фармакопея на САЩ
Escherichia coli
Salmonella
Pseudomonas
aeruginosa
Staphylococcus
aureus
Европейска фармакопея
Хармонизирани методи
Enterobacteriaceae
Escherichia coli
Salmonella
Pseudomonas
aeruginosa
Staphylococcus
aureus
Clostridia
Толерантни на
жлъчка Gr(-) бактерии
Escherichia coli
Salmonella
Pseudomonas
aeruginosa
Staphylococcus
aureus
Clostridia
Candida albicans
Escherichia coli
Gr(-), аспорогенна, къси
пръчици с КС
Факултативен анаероб
Мезофил, 20-50°С
Подтиска се от пеницилин G
Сапрофитен начин на живот участва при разлагането на
гниещи растителни и
животински остатъци, нормална
микрофлора на червата
Гастроентерити, колити
Ентеротоксин
Salmonella
Gr(-), неспорообразуваща,
къси и тънки пръчки
Факултативен анаероб
Чувствителна на
хлорамфеникол, ампицилин
Оцелява в почва, води –
добитък, птици, мишки
Гастроентерит, паратиф,
коремен тиф, салмонелоза –
диария, треска, коремни
болки
Pseudomonas aeruginosa
Gr(-), пръчки, по 1-2 до къси
верижки
Аероб
Син пигмент - пиоцианин
Почва, вода, отпадъчни води,
въздух
Патоген за човека – хемолиза на
кръвта, в гнойни рани (зелено
гноясване), кожни и белодробни
инфекции
Некротичен токсин, екзотоксин А
Staphylococcus aureus
Gr(+), коки, с КС
Факултативен анаероб
Чувствителен на цефалоспорин С
Изолира се от носа и кожата на
човека (20% носители)
Гноясване, похабяване на
хранителни продукти
Засяга кожа, меки тъкани, кости,
стави, инфекции в раните
Кожни инфекции (пъпки, циреи),
абцеси, пневмония, менингит,
остеомиелит, ендокардит, синдром
на токсичния шок
α-токсин
Clostridium
Gr(+), спорообразуващи - спората се
разполага централно на клетката
(closter- вретено), пръчковидни
Анаероби
Масленожълти и жълтобели колонии
върху твърди среди
Б - образуват Н2S, В – ацетон, фиксират
N2, ферментация на целулоза
Почва, вода, храносмилателен канал на
преживни животни, образуват токсични
вещества в консервите при лоша
стерилизация (<100-130°С)
Отравяне – ботулизъм, газова гангрена,
тетанус
Невротоксини, протеинази, α-токсин
Candida albicans
Аспорогенни дрожди
При обикновени условия е
нормален обитател на човешкото
тяло (чревна флора) (носители
80%), но при отслабване на ИС
става опасен
Кандиоза – увеличаване на бр.
(HIV-позитивни, химиотерапия,
трансплантации)
Кандиоза – след антибиотици
Патоген по кожата и слизестите
обвивки (уста, гениталии), системни
микози
Референтен щам
Микроорганизми, получени от официалната колекция за MO
АТСС – American Type Culture Collection
NCIMB – National Collection of Industrial and Marine Bacteria Ltd
CIP
– Collection de Bacteries de l’Institut Pasteur
NCPF – National Collection of Pathogenic Fungi
Staphylococcus aureus ATCC 6538
Bacillus subtilis ATCC 6633
Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027
Clostridium sporogenes ATCC 19404
Candida albicans ATCC 16404
Salmonella ATCC
Escherichia coli ATCC
Приложение на културите от
микроорганизми в практиката
Тест на продукти
+ или – контроли
Индикаторни организми
Идентификационни стандарти
Видове култури от МО
Референтна култура – комплект идентични култури, получени в
лабораторията от еднократно препосяване от референтния щам
Първоначална култура – система, съгласно която последователни
партиди от продукт произлизат от една и съща партида култура от
оригиналната епруветка за дадено ниво на пасажиране. Течна –
при -70ºС, изсушена - tºС, при която щамът запазва стабилност
Първична култура – култура от МО, получена от една епруветка с
една операция
Работна култура – култура от МО, която произлиза от
първоначалната култура и е предназначена за използване в
производството; разпределят се в съдове и се съхраняват
Методи за съхранение на МО в
колекции
2 групи
Хипобиотични – понижаване до минимум на
жизнената активност на клетките, като се
съхраняват под минерални масла, във вода и
водни р-ри, инактивирани в сухо състояние и др.
Анабиотични – МО са в състояние на анабиоза
чрез:
- замръзяване и съхранение при ниска t°С
- замръзяване и изсушаване (лиофилизация)
Подготовка и работа с култури МО
Използват се стандартни бактериални суспензии от тестови
щамове/ референтни щамове/референтни култури. Те трябва да
идват от надежден източник – ATCC, CIP, NCIMB, NCPF. От тях се
получават субкултури.
Като един пасаж се определя преносът на МО от жизнеспособна
култура върху прясна среда и растежа на тези МО. Всяка форма
на субкултура се приема за пренос/пасаж.
Броят на пасажите трябва да бъде възможно най-малък, за да се
намали възможността от вариации във фенотипа, генетични
промени и контаминация
Използваните техники за поддържане на инокулума са такива, че
жизнеспособните МО използвани за инокулум да не са
препосявани повече от 5 пасажа от оригиналната култура за
дадения щам.
Подготовка и работа с култури МО
Лиофилизираната ампула
се изважда от
транспортната опаковка и
се обтрива със 70 % етанол
или с дезинфектант
Ампулата се поставя в
стерилна кърпа (марля),
така че да се покрие ¾ от
страната на острия и край
Подготовка и работа с култури МО
Върху ампулата се прави срез с пила за стъкло.
Ампулата се счупва с метален предмет през
марлята в областта на върха и.
Отстраняват се счупените стъкла и отвора на
ампулата се запушва със стерилна памучна
запушалка.
В ампулата се поставя рехидратираща среда –
дестилирана вода, стерилна пептонна вода или
течна хранителна среда препоръчана за щама
Подготовка и работа с култури МО
Суспензията се прехвърля в нова стерилна епруветка и се
оставя за 30 мин при стайна t°C
Хомогенизираната суспензия се прехвърля в стерилна
епруветка с течна среда – обикновен бульон
Суспензията се хомогенизира като се разбърква
интензивно
Културата се поставя в термостат при условия и период,
препоръчани за развитието на щама
Всички отпадъци от работата по отварянето на ампулата
се обеззаразяват чрез автоклавиране при >1,5 атм (127°С)
за 45-60 мин.
Подготовка и работа с култури МО
Така получената първоначална (жива) култура е І пасаж
Препосява се на Nutrien agar на петри, чрез истощаващ разсед за
проверка чистотата на културата – ІІ пасаж. След ІІ пасаж щамът се
съхранява посят на бод в полусолиден агар под течен парафин при
2-8°С за 6 месеца.
В случай че културата е чиста от единична колония се взима с йозе
посевен материал и се препосява на полегат агар (Nutrie agar).
Термостатира се и се съхранява поне 1 седмица на хладилни
условия.
След изтичане на времето за термостатиране в епруветката с
полегат агар се поставя пептонна вода. Суспендира се и се
прехвърля в нова стерилна епруветка – ІІІ пасаж (working stock)
От ІІІ пасаж чрез трансфер се стига до ІV и чрез последваща
препосявка до V пасаж.
Подготовка и работа с култури МО
Съхранение
Температурата на съхранение на културата може
да повлияе нейната жизнеспособност и растеж
CCLS (Clinical and Laboratory Standards Institute)
препоръчва:
Работни култури – от -50 °С до -70°С – за 1 г
Работни култури - под -70°С – за неограничено
време
Полегат агар 2-8°С – 1 до 2 седмици
Съхранение
АТСС (American Type Culture Collection)
препоръчва:
Замръзени култури – фризер -80°С –
дълготрайно съхранение
Замръзени култури – на -20°С – краткотрайно
съхранение (по-малко от 1 месец)
Лиофилизирани култури – от 2°С до 8°С
Полегат агар - от 2°С до 8°С - до 1 седмица
любопитно
На южния полюс на дъното на 30-метров кладенец
американецът Майер открива струпване на
микроби. Леденият слой бил на около 3 000 г.
когато поставили тези МО в термостат с
хранителна среда те оживели.
През 1911 г микробиолози откриват жизнеспособни
бактерии в труп на мамут намерен в Сибир.
Учените са пресметнали, че тези бактерии са се
запазили в трупа на гиганта хилядолетия като им е
помогнал вечния мраз.
Литература
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
С. Влахов, А. Иванов – Обща микробиология
Pharmaceutical Microbiology Forum Newsletter – vol.12(3)
US Pharmacopeia. Antimicrobial Effectiveness Testing. In: US
Pharmacopeia 26th rev. Rockville, MD: US Pharmacopeia; 2003,
2nd supplement (51)
US Pharmacopeia. Microbiological Good Laboratory Practices,
(1117). Pharmacopeial Forum 29(3): Pharmacopeial Reviews,
2003
NCCLS. Performance standards for antimicrobial disk susceptibility
tests. 8th ed. Wayne, PA: NCCLS; M2-A8, 2003
NCCLS. Reference method for broth dilution antifungal
susceptibility tasting of yeasts; approved standard. Wayne, PA:
NCCLS; M27-A, 1997
ATTC. Reference Strains: How many passages are too many?
Technical Bulletin №6
T. Uzunova-Doneva, T. Donev – Anabiosis and conservation of
microorganisms, Journal of Culture Collections, vol.4, 2004-2005,
pp.17-28
Микроорганизмите ви благодарят
за вниманието
Документ
Категория
Презентации по географии
Просмотров
53
Размер файла
8 110 Кб
Теги
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа