close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Заголовок слайда отсутствует

код для вставкиСкачать
7. ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ВАРИАБЕЛЬНОСТЬ
ДИКИХ И ВАКЦИННЫХ ШТАММОВ
ВИРУСА КОРИ
Высокая частота мутаций, типичная
для РНК-содержащих вирусов и
обусловленная главным образом
ошибками вирусспецифической
полимеразы и отсутствием
репарационных систем , ведет к
появлению популяционной структуры,
состоящей из большого числа
микровариантов.
Попытка определения спонтанной
частоты мутаций у вируса кори была
предпринята С. Шраг с сотр. (Schrag et
al., 1999). В задачу исследования входило
изучение частоты мутаций в Н-гене ,
влияющих на конформацию эпитопа ,
взаимодействующего с моноклональным
антителом Mab 80-III-B2. При этом был
использован флюктуационный тест,
разработанный Луриа и Дельбрюком
(Luria and Delbruck , 1943).
В течение последних десятилетий
накопились факты , свидетельствующие о
наличии вариабельности биологических
свойств среди диких и вакцинных штаммов
вируса кори. В частности, хотя вирус кори
рассматривается как относительно
стабильный в антигенном отношении вирус
(монотипический вирус), имеются
сообщения о наличии заметных антигенных
вариаций , определяемых с помощью
моноклональных антител
(Sheshberadaran and Norby, 1986; Tamin et al.,
1994..).
Были описаны варианты вируса кори ,
которые агглютинируют эритроциты
только в присутствии высоких концентраций
( 0,8 M) сульфата аммония. Некоторые коревые
изоляты неожиданно оказались такими
солезависимыми вариантами
(Gould et al.,1976; Shirodaria et al., 1976).
Молекулярный механизм этого феномена
остается неясным, однако результаты
исследований д-ра Фланагана и д-ра Римы
( Flanagan and Rima неопубликованные
данные) показывают, что у соле-зависимых
вариантов имеются в Н-белке аминокислотное
замещение F- L в позиции 117.
Особого внимания, заслуживает антигенная
вариабельность вируса кори. Чтобы
оценить потенциальные иммунологические
последствия наблюдаемых изменений
поверхностных гликопротеинов диких
штаммов вируса кори, циркулирующих в
настоящее время в природе, были детально
исследованы образцы сывороток от
вакцинированных лиц и коревых больных
(Tamin et al., 1994).
Попытки картировать эпитопы на
поверхности Н- белка с использованием
синтетических пептидов в большинстве
своем оказались безуспешными.
Только антисыворотка к пептидам ,
соответствующим последовательности
аминокислот 185- 195, которая
консервативна у всех диких штаммов,
исследованных до настоящего времени,
обнаруживала нейтрализующую активность.
Таким образом , роль антигенных изменений
Н-белка в эпидемиологии коревых инфекций
до сих пор остается неясной. Существующие в
настоящее время дикие штаммы вируса кори
хорошо нейтрализуются антителами,
индуцируемыми вакцинными штаммами, и эти
вакцинные штаммы весьма эффективны в
предотвращении заболеваний. Возможно, однако,
что антигенные изменения в Н – белке диких
штаммов вируса кори в комбинации с
убывающей иммуногенностью вакцинных
штаммов будут способствовать в будущем
распространению диких штаммов среди
высоковакцинированного населения.
Группа японских исследователей сообщила о
получении мелкобляшечного варианта вируса
кори со сниженной вирулентностью для
новорожденных мышей (Sakae et al.,1997).
Вариант был селекционирован в результате
пассирования штамма Edmonston в клеточной
линии NIH3T3 в течение 5 –ти месяцев. В
процессе пассирования данного варианта на
клетках NIH3T3 не отмечалось наличие
цитопатогенного эффекта, однако на клетках
Vero полученный вариант имел титр
около 2 х 100000 БОЕ/мл.
В последние годы генетическая изменчивость
диких штаммов вируса кори стала объектом
самого интенсивного изучения в связи с
обнаружением заметного генетического дрейфа
этих штаммов после широкого распространения
коревых вакцин.
Генетические изменения были обнаружены в
кодирующей части Н, F, N, P и М --генов .
Наибольшая степень вариабельности среди
диких штаммов вируса кори, как уже
указывалось, была найдена в СООН- концевом
участке N- белка протяженностью в 151
аминокислотный остаток. (Taylor et al.,1991; Rota et
al.,1994a ; Rota et al.,1994b).
Подъем заболеваемости корью в США
в 1988- 1991гг. во многом объясняют
изменениями в гене, кодирующем
гемагглютинин у диких штаммов вируса
кори, циркулирующих в это время в этой
стране ( Rota et al.,1992). Было
обнаружено, что Н- белок этих штаммов
отличался от Н- белка вакцинного штамма
Moraten в 19 позициях и включал еще
один дополнительный сайт
гликозилирования ( Rota et al.,1992).
Анализ нуклеотидных последовательностей,
кодирующих N- белок 15 диких штаммов
вируса кори, выделенных в период с 1954
по 1990 гг., и одного из вакцинных штаммов
показал, что N- гены отличались по 76
нуклеотидным позициям ( 4,75%) и 18
аминокислотным позициям (3,42%).
Нуклеотидные замены были распределены
по всей длине N- гена, однако в пределах
СООН-концевой части гена длиной 456
нуклеотидов последовательности этого гена
отличались в 38 позициях ( 8,3% ).
Интересно отметить, что дикие штаммы,
циркулирующие в этот период в США и
Канаде были более родственны диким
изолятам, выделенным в Великобритании
между 1983 и 1988 гг., чем штаммы BER83
и BOS83, которые были выделены в США
в 1983 г. Эти наблюдения позволяют
предположить, что штаммы BER83 и
BOS83 могут соответствовать тупиковой
исчезающей линии диких штаммов вируса
кори.
Еще одна заметная генетическая линия диких
штаммов вируса кори включала изоляты из двух
стран Западной Африки: Габона и Камеруна,
выделенные в 1983- 1984 гг. Дикие штаммы ,
выделенные в США в конце 50-х годов, дикие
штаммы Edmonston и PH26, штамм HAL,
выделенный в Финляндии, были
близкородственны вакцинному штамму Moraten
и образовывали еще одну генетическую линию (
Rota et al., 1994a). Часть этой группы в N- гене
имели различия только в 9 –ти нуклеотидных
позициях (0,6%) и в 3-x аминокислотных
позициях (0,6%).
Сравнительный анализ нуклеотидных
последовательностей М-гена небольшого числа
диких штаммов, циркулирующих с 1954 по
1991 г. показал, что М-ген несколько более был
консервативен на нуклеотидном уровне по
сравнению с N-геном. M- гены исследованных
штаммов отличались по 36 нуклеотидным
позициям ( 2,6 %) и по 8 аминокислотным
позициям ( 3,3%). Было обнаружено, что
аминокислотные изменения в М-белке
концентрируются на N- конце. Между 50-ым и
100-ым аминокислотными остатками
наблюдалось наибольшее количество замен.
Существование множественных генетических
линий диких штаммов витруса кори было
доказано после анализа N, P, и М- генов
диких штаммов, циркулирующих в разные
периоды времени ( Baczko et al.,1991; Baczko
et al., 1992; Taylor et al ., 1991; Rota et al.,
1994a). Полученные данные еще раз
подтверждают вывод , что до широкого
распространения коревых вакцин в 1960 г.
дикие штаммы вируса кори были генетически
гомогенны и могли существовать как
единственная генетическая линия.
Дальнейшие исследования в этом
направлении были предприняты группой Рима
с сотр. ( Rima et al .,1997). C этой целью был
предпринят детальный филогенетический
анализ Н-генов 75 диких и вакцинных
штаммов вируса кори . Анализ
последовательностей СООН –концевой части
N- гена 36 штаммов вируса кори показал
значительную дивергенцию этого участка как
на нуклеотидном ( 7,2%), так и на
аминокислотном уровне (10,6%) (Taylor et
al.,1991).
Согласно классификации Тейлора первая
генетическая линия ( группа А) содержала
все вакцинные штаммы, используемые в
настоящее время. Типичным представителем
этой группы является штамм Edmonston. Эта
группа содержит и ранние американские
изоляты, как, например, PH 26 , штамм Turku,
выделенный в Финляндии в 1962 г. Эта
группа кроме того включает в себя штаммы
Нalle, Mantooth и Horta-Barbosa,
изолированные от больных, страдающих
ПСПЭ.
Генетические линии могут состоять из
нескольких генотипов , отражающих местные
особенности той или иной генетической линии.
Данные, собранные в США между 1989 и 1999гг.
ясно показывают, что прекращение передачи
местного генотипа D3 было достигнуто в 1993 г.
Секвенирование генома местных штаммов
подтвердило, что вирусы кори , изолированные с
1993 г., были членами генотипов С2, D4, D5, D6
и были импортированы в США из других
регионов планеты. В 1993г. был отмечен
первый документированный занос в США
генотипа D4 из Индии.
Ген, кодирующий Н-белок у диких штаммов
вируса кори, как уже отмечалось, отличается
большим разнообразием. Поскольку
Н-белок является главным иммуногеном,
индуцирующим образование новых
нейтрализующих антител, его вариабельность
является результатом иммунологического
давления на этот белок. Группой Рима с сотр.
( Rima et al., 1997) был предпринят
филогенетичсский анализ Н-генов 75 диких
и вакцинных штаммов вируса кори
(32 опубликованных последовательности
и 43 новых последовательности).
Имеется весьма незначительная информация
относительно функций и генетической
вариабельности первичной структуры
межцистронной области генома вируса кори,
расположенной между кодирующими участками
М- и F- генов вируса кори. Эта область
включает 3-нетранслируемый локус М-гена (
429 н.), межгенный участок (3 н.) и 5нетранслируемый локус F- гена (573 н .).
Первичная структура 3- нетранслируемого
локуса М- F области генома вируса кори была
исследована Беллини с сотр.
( Bellini et al., 1986).
Также было показано, что нуклеотидная
последовательность 5- нетранслируемого
локуса F-гена содержит несколько
потенциальных инициирующих кодонов,
два из которых расположены в позициях
574 и 583. Продемонстрировано, что
трансляция F- белка обычно осуществляется
с AUG2- кодона в позиции 583. В отсутствие
некодирующего локуса трансляция
инициируется либо с AUG1 либо с AUG3 инициирующих кодонов (Cathomen et
al.,1995).
Детальный анализ вариабельности
некодирующей М-F области генома был
недавно проведен у штаммов вируса кори,
входящих в генетические линии A,B,D,H
(Markushin et al.,1997). Проведенный
анализ показал , что степень
вариабельности М-F области у диких
штаммов вируса кори , принадлежащих к
различным генетическим линиям, была
необычайно высокой .
Было обнаружено, что уровень генетической
вариабельности М-F области генома во всех без
исключения случаях отражал уровень
вариабельности других кодирующих и
некодирующих участков генома вируса кори .
Характер распределения нуклеотидных замещений в
нуклеотидной последовательности М-F области
генома при сравнении штаммов, относящихся к
различным генетическим линиям не позволяет
идентифицировать сколько-нибудь протяженные
консервативные участки в пределах данной области
генома, что свидетельствует в пользу того, что эта
область генома не имеет участков с уникальной
вторичной структурой, выполняющей регуляторные
функции.
Анализ нуклеотидных последовательностей
N-гена 38 изолятов, выделенных в Германии,
Чехии, Дании, Польше и России был
предпринят сотрудниками Института Р. Коха
в Берлине (Santibanez et al., 1999). Был
проведен анализ СООН-концевой части гена,
включающей 285 нуклеотидов. Было
обнаружено, что в Германии в период между
1993 и 1996 гг. циркулировало два генотипа
С2 и D6, входивших, соответственно в
генетические линии С и D. Изоляты
генотипа С2 были родственны штаммам,
выделяемым в Германии до 1993г.
Анализ нуклеотидных
последовательностей СООН- концевой
части N-гена диких штаммов,
циркулирующих в европейской части
России в 2000-м году, показал, что все
они относятся к генотипу D4
( генетическая линия D)
(Markushin et al ., manuscript in
preparation).
Интересно отметить, что штамм Nepal,
относящийся к генотипу D4, был выделен в
1997 г. на юге Непала. Как известно, Н-ген
вируса кори содержит 5 потенциальных мест
гликозилирования с N-связями. Они
локализуются в аминокислотных остатках 168,
187, 200, 215, 238. Дополнительное место
гликозилирования было обнаружено в позиции
416 Н-белка. Штамм Nepal имел в Н- белке
мутации в позициях 169 ( S-A) и 211 ( G-S)
при сравнении со штаммом Edmonston (
Lingyun and Yipeng., 1998).
Интересные данные были получены в
отношении генетической вариабельности диких
штаммов вируса кори , циркулирующих в 19921995гг. в Великобритании (Jin et al., 1997).
При изучении 50 изолятов, выделенных в
этой стране, было обнаружено 3 отдельных
генотипа, которые были близкородственны
генотипам , описанным прежде в США и
континентальной Европе . Как оказалось,
генотип 1 соответствовал генотипам D1 и D3
генетической линии D, генотип 2-генотипу С2
генетической линии С, и генотип 3- генотипу
D2 генетической линии D.
Секвенирование части Н-гена 18 диких
коревых штаммов, изолированных в Гамбии
в период 1994- 1995гг. показало высокую
степень гомологии ( > 98,5%). Эти
последовательности образовывали кластер,
характерный только для данного
географического района. Общей чертой этих
изолятов было наличие трех характерных
мутаций в Н-гене в позиции 7963, 8649 и
8653, не наблюдаемых в Н-гене изолятов из
других географических районов (Outlaw et al.,
1997).
На основании филогенетического анализа
и анализа полиморфизма рестриктазных
фрагментов H и N- генов диких штаммов
вируса кори, циркулирующих в западной
части Японии , эти дикие штаммы были
распределены в два генотипа. Было
показано, что в течение 10 лет штаммы,
относящиеся к одному генотипу, полностью
заменили штаммы, относящиеся к
другому генотипу
( Katayama
et al., 1997).
В южной Африке эволюция вируса кори была
исследована в условиях
начальной стадии
противокоревой вакцинации (Kreis et al., 1997).
Были проанализированы последовательности
СООН- концевой части N- гена 20 изолятов,
часть из которых была выделена в 1988- 1989гг.,
а другая часть- в 1994-1995гг. Было обнаружено,
что по крайней мере существует несколько
различных генетических групп диких коревых
штаммов , из которых одна циркулирует с 1986г.
Генотип , включающий основную массу
изученных штаммов, выделенных в более
позднее время, характеризовался тремя
специфическими мутациями в N-гене.
В отдельных регионах Европы в настоящее
время продолжаются отдельные коревые
вспышки благодаря недостаточной
вакцинации. В Люксембурге в 1996г.
была отмечена коревая вспышка с охватом
110 человек и сообщения о заболеваниях
корью в этой стране продолжались до
1997г. Молекулярно-генетический анализ
показал , что все изоляты относятся к
генотипам С2 и D6. Дивергенция в данном
конкретном случае достигала 0,2%.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Молекулярно- генетические
исследования вируса кори, проведенные
в последнее время, позволили
значительно продвинуть вперед наше
понимание структуры генома этого
вируса, особенностей отдельных стадий
его внутриклеточного цикла репродукции
и его природной изменчивости.
Вместе с тем некоторые вопросы
молекулярной генетики вируса кори
продолжают оставаться малоизученными.
В частности продолжают оставаться
непонятными функция и роль
некодирующей М-F области генома
этого вируса.
Остаются невыявленными “истинные ”
клеточные рецепторы в человеческом
организме, которые взаимодействуют с
вирусом в процессе обычной коревой
инфекции.
Документ
Категория
Презентации
Просмотров
5
Размер файла
319 Кб
Теги
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа