close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Презентация

код для вставкиСкачать
Федеральное государственное бюджетное учреждение
"Медико-генетический научный центр"
Российской академии медицинских наук
Танас Александр Сергеевич
АНАЛИЗ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОГО
МЕТИЛИРОВАНИЯ ГЕНОМОВ
МЕТОДАМИ НЕПРЕДВЗЯТОГО СКРИНИНГА
03.02.07 «генетика»
03.01.09 «математическая биология, биоинформатика»
Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Научный руководитель
к.б.н. В.В. Стрельников
Скрининг – предвзятый
и непредвзятый
• Скрининг дифференциального метилирования ДНК –
систематическое выявление локусов генома, отличающихся
характером метилирования в различных типах клеток.
• Непредвзятый скрининг (hypothesis free) планируется в
отсутствие любых предварительных гипотез.
• Предвзятый скрининг (hypothesis driven) основывается на
предварительном теоретическом отборе спектра
анализируемых участков, после чего дифференциальный
характер их метилирования подтверждается либо
отвергается.
Основная гипотеза: дифференциальное метилирование
характерно для участков промоторных CpG-островков в
области +/-200 (до 500) п.н. от сайта инициации транскрипции.
2
Преимущества
непредвзятого скрининга
• расширяет фундаментальные
представления о характере и роли
метилирования различных структурнофункциональных элементов генома
в норме и при патологии
• способствует диверсификации основ
разработки эпигенетических
диагностических маркеров
3
Возможности применения
непредвзятого скрининга
Ограничены использованием клонирования и
секвенирования для геномного картирования
выявленных дифференциально метилированных
локусов.
секвенирование
генома человека
математическое
моделирование
альтернативный способ
картирования
4
Цель исследования
Разработать подходы к анализу
дифференциального метилирования
геномов методами непредвзятого скрининга.
5
Задачи исследования
1. Разработать современный алгоритм непредвзятого скрининга
дифференциального метилирования геномов.
2. Разработать способ определения геномной принадлежности
выявляемых дифференциально метилированных фрагментов ДНК,
исключающий необходимость их реамплификации, клонирования и
секвенирования.
3. Разработать алгоритм и компьютерную программу моделирования
результатов экспериментов с использованием баз данных
нуклеотидных последовательностей.
4. Охарактеризовать иерархию продуктов АИМС и описать
количественные и качественные параметры продуктов АИМС,
получаемых при различных экпериментальных условиях.
5. Провести сравнительный анализ геномов клеточных линий рака
молочной железы на основе разработанного алгоритма скрининга
дифференциального метилирования.
6
Обобщенная схема метода скрининга
дифференциального метилирования геномов
Формирование выборки участков генома
•ферментативный гидролиз
•аффинное обогащение
Сокращение выборки
Сравнение профилей
•редкощепящие рестриктазы
•удлинители универсальных
праймеров
•вычитательная гибридизация
•сравнение визуализированных
репрезентаций
Разделение элементов выборки
Картирование
•электрофорез
•разведение
•клонирование и секвенирование
•по положению на матрице
Метод непредвзятого скрининга
дифференциального метилирования геномов
7
Требования к оптимальному
методу скрининга
• непредвзятый характер скрининга
• возможность стандартизации
(моделирования)
• простота и экономичность метода
• высокая производительность
• быстрое и несложное картирование
АИМС
(амплификация интерметилированных сайтов)
8
SmaI
C C C GСGCGG G G
C
G G G C C C
C
C C C G G G
G G GGCGCG C C C
SmaI
XmaI
SmaI
XmaI
SmaI
C C C G G G
G G G C C C
XmaI
SmaI
SmaI
XmaI
C С
C C G G G
G G G C C C
9
Модификации этапов АИМС
Выбор рестриктаз по
результатам компьютерного
моделирования
Выбор удлинителей по
результатам компьютерного
моделирования
10000
gcg
8000
6000
Капиллярный электрофорез
флуоресцентно меченых
продуктов
4000
2000
0
80
130
180
230
6000
ccg
5000
Компьютерные инструменты
анализа и сравнения
электрофореграмм
4000
3000
Картирование на основе
шаблона выборки
2000
1000
0
80
130
180
230
10
AIMS in silico
11
Определение геномной
принадлежности
PHF-5’-CpG
Межгенный13q32.1-CpG
C2CD2-5’-CpG
12
Планирование сокращения выборки
Уменьшение количества продуктов АИМС
в 5 раз для С,G
в 3 раза для A,T
(Frigola et al., 2002)
13
Состав геномной выборки
CCG-АИМС
другие C,G богатые
участки: 5
CpG островки: 66
межгенные
3'-CpG-
промоторные НЕ
островки; 6
CpG-островки; 2
CpG-островки; 12
внутригенные
CpG-островки; 15
не CpG-островки; 3
5'-CpG
островки; 33
14
Анализ геномов клеточных линий РМЖ
15
Картирование выявленных дифференциально
метилированных локусов
ccg164 ccg165 ccg168 ccg176 ccg177.1 ccg177.2 ccg189
Acc16I
SbfI
EgeI
AvrII
Bso31I
GsaI
+
+
+
+
+
+
+
+
16
Карты метилирования
ccg177.2 межгенный CpG-островок 13q32.1
ZR-75-1
MCF7
17
Карты метилирования
ccg189 C2CD2 (1 экзон)
MCF7
18
Результаты валидации
ZR-75-1
HBL-100
HS 578 T
BT-474
MCF7
T-47D
карта
ccg164
PURB
+
-
ccg165
ATMIN
-
ccg168
ANK3
+
+
+
+
ccg176 ccg177.1 ccg177.2 ccg189
MAFK
C2CD2
АИМС
МСС
+
АИМС
+
МСС
АИМС
МСС
АИМС
МСС
+
+
+
АИМС
+
+
МСС
+
+
АИМС
МСС
+
+
19
Результаты валидации
HBL-100
ccg168 ANK3
T-47D
20
MS-SSCA ccg168 ANK3
1
2
3
4
5
6
7
21
Геномная локализация дифференциально
метилированных участков
Фрагмент
ccg189
ccg164
ccg165
ccg177.1
ccg168
ccg177.2
ccg176
Локализация
Ген
21q22.3
7p13
16q23.2
7p22.3
10q21.2
13q32.1
12q13.13
Нить
TSS*
CpG-островок
CG-кластер
межгенный межгенный
≈16кБ
≈40кБ
3’ ABCC4 SCN8A,
1 экзон 1 экзон 1 экзон - 1 интрон 1 интрон
ANKRD33
(5’UTR)
1 интрон
+
+
43
494
248
192
212
C2CD2
PURB
ATMIN
MAFK
ANK3
+
-
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
22
Выводы
1. Сочетание классического генноинженерного подхода (амплификации
интерметилированных сайтов – АИМС) и высокоразрешающего
способа разделения фрагментов нуклеиновых кислот - капиллярного
электрофореза с математическим моделированием экспериментов
позволило разработать современный алгоритм скрининга
дифференциального метилирования геномов.
2. Рестриктазное картирование, проводимое на основе предварительного
математического моделирования, исключает необходимость
реамплификации, клонирования и секвенирования индивидуальных
продуктов АИМС в процессе определения их геномной
принадлежности.
3. Разработанные алгоритм и компьютерная программа AIMS in silico
впервые обеспечили возможность моделирования результатов
экспериментов АИМС с использованием баз данных нуклеотидных
последовательностей генома человека.
23
Выводы
4. Проведенная характеристика иерархии продуктов АИМС и полученные
описания количественных и качественных параметров репрезентаций
АИМС для различных экспериментальных условий позволяют быстро и
эффективно осуществлять планирование экспериментов АИМС.
5. Анализ геномов клеточных линий рака молочной железы ZR-75-1,
HBL-100, HS 578 T, BT-474, MCF7 и T-47D выявил 6 дифференциально
метилированных геномных локусов, которые ранее не изучались с
точки зрения дифференциального метилирования. Среди них - участки
CpG-островков, расположенных в первых интронах генов ANK3 и
MAFK, в промоторной области гена C2CD2, в межгенных областях на
хромосомах 12q13.13 и 13q32.1, а также участок первого экзона гена
PURB, не являющийся CpG-островком. Выявление
дифференциального метилирования неканонической локализации
подтверждает непредвзятость разработанного алгоритма скрининга.
24
Спасибо за внимание
Метилирование неканонической локализации
Опухолеспецифическое
ген
локализация
материал
ассоциация
метод
PAX6
5 экзон
КРР, РМП
эктопическая
МЧФП
PDX1
3’ экзон
КРР
эктопическая
РОГС
OTX1
3’ экзон
эктопическая
РОГС
CDKN2A/p16
3’ экзон
РП
повышена
РОГС
CDKN2A/p16
2 экзон
РП
CDKN2A/p16
1 экзон
B-ОЛЛ, НМРЛ
RASSF1
1 экзон
РМЖ
BIN1
1 интрон
РМЖ, РПЖ
снижена
Тканеспецифическое
ген
локализация
функция
PTPRC
5 экзон
альтернативный сплайсинг
CUX1
3’ экзон
альтернативный сплайсинг
26
Сравнение результатов с БД
ccg164 ccg165 ccg168 ccg176 ccg177.1 ccg177.2 ccg189
PURB ATMIN
ANK3
MAFK
C2CD2
MCF7
+
+
+
н/д н/д 0% н/д 3% н/д н/д н/д 8%/12 4% 88% н/д н/д 16%
T-47D
+
+
+
н/д н/д 3% н/д 8% н/д н/д н/д 6% 7% 9%/11 н/д н/д 3%
АИМС
RRBS
АИМС
RRBS
27
Оценка точности программы
Модель:
• 30000 соматических мутаций
• 35000 п.н. в продуктах АИМС
• 1300 п.н в сайтах SmaI и удлинителя
• случайное равномерное распределение мутаций
• геном 3.3*109 п.н.
Ложноотрицательные:
• разрушение сайта SmaI + удлинитель (9 нукл.)
• создание сайта SmaI внутри продукта
1,5%
0,05%
Ложноположительные:
• создание сайта SmaI + удлинитель (9 нукл.)
из последовательностей, отличающихся на
1 нуклеотид на расстоянии не более 1000 п.н.
<10-3%
анализ образца без метилчувствительной рестрикции
28
0
ttt
ttg
tta
tgt
tgg
tgc
tga
tct
tcg
tcc
tat
tag
tac
gtt
gtg
gtc
gta
ggt
ggg
ggc
gga
gct
gcg
gcc
gca
gat
gag
gac
gaa
ctt
ctg
ctc
cta
cgt
cgg
cgc
cga
cct
ccg
ccc
cca
cat
cag
cac
caa
att
atg
atc
agt
agc
aga
act
acg
acc
aca
aat
aag
aac
aaa
Потенциал трехнуклеотидных
удлинителей
160
140
120
100
80
60
40
20
29
Порядок этапов
МЧ-РДА
Создание
репрезентации
Редукция
(естественная)
Сравнение:
вычитательная
гибридизация
Редукция:
редкощепящая
рестриктаза
Разделение:
электрофорез
Редукция:
(естественная)
Разделение:
разведение
Разделение:
разведение,
клониро-вание
Определение *
геномной
принадлежности:
секвенирование
Сравнение
Определение
геномной
принадлежности:
секвенирование
МЧ-РОГС
Создание
репрезентации
*
Methyl-Seq
Создание
репрезентации
Определение *
геномной
принадлежности
Сравнение
30
Карты метилирования
ccg168 ANK3 (1 интрон)
HBL-100
31
Скрининг дифференциального метилирования
32
Патентная активность
Медицинская ДНК-технология
Скрининг аномального метилирования ДНК на
основе метода амплификации
интерметилированных сайтов для диагностики
злокачественного опухолевого процесса
Компьютерная программа
50201050017 от 16.09.2010 AIMS in silico
Компьютерная программа
50201050040 от 13.10.2010 PeakPick
33
Калибровка электрофореграммы
по маркеру молекулярной массы
30000
25000
20000
15000
10000
5000
0
0
50
100
150
200
250
300
350
400
34
Анализ метилирования ДНК
из клеток линии Jurkat,
культивированных в присутствии 5-Aza-dc
35
Карта метилирования
CpG-островка BIN1
0,9 kb promoter
exon 1
intron 1
promoter CpG island
36
37
Универсальный праймер с
удлинителем
XmaI
5’-
C
C
C
G
G
G
3’-
G
G
G
C
C
C
адаптер
5’-
A
T
T
C
G
C
A
A
A
G
C
T
C
T
G
A
C
C
G
G
G
3’-
T
A
A
G
C
G
T
T
T
C
G
A
G
A
C
T
G
G
C
C
C
5’-
A
T
T
C
G
C
A
A
A
G
C
T
C
T
G
A
C
C
G
G
G
универсальный праймер
C
C
G
-3’
удлинитель
38
Состав геномных выборок АИМС
SmaI-GCG, SmaI-CCG
GCG
внутригенные
CpG-островки;
20
межгенные
CpG-островки;
9
не CpG
островки; 6
CCG
3'-CpGостровки; 0
промоторные
НЕ CpGостровки; 3
5'-CpG
островки; 27
межгенные
CpG-островки;
12
внутригенные
CpG-островки;
15
3'-CpGостровки; 6
не CpG
островки; 3
промоторные
НЕ CpGостровки; 2
5'-CpG
островки; 33
39
Неденатурирующий
капиллярный электрофорез
40
Анализ электрофореграмм
программой GeneMapper
41
Распределение сайтов узнавания
SmaI и HpaII в геноме человека
42
Документ
Категория
Презентации
Просмотров
3
Размер файла
6 618 Кб
Теги
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа