close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

GFP Green fluorescent Protein

код для вставкиСкачать
GFP
Green fluorescent Protein
История
Структура и свойства
Применение
Получение рекомбинантного GFP
Сергей Крат, МБФ
История
Выделен вместе с другим светящимся
белком экворином из медузы Aequorea
victoria Осаму Симомурой (Jap) 1960
История
• Дуглас Прэшер секвенировал и клонировал
ген белка (1992)
• Мартин Чалфи экспрессировал
последовательность в Escherichia
coli и Caenorhabditis elegans (Science, 1994)
• Исследования Фредерика Тцуи (конформация)
• Нобелевская премия по химии «за открытие и
разработку зеленого флуоресцентного белка
GFP» (Осаму Симомура, Мартин Чалфи, Роджер
Тсьен, 2008)
GFP
GFP
Флуорофор = Ser65+Tyr66+Gly67
Свойства GFP
•
•
•
•
•
•
238 ако;
26,9 кДа;
Пик фл-ии на 498 нм
emission/excitation 395/509
ИЭТ [4,6–5,4]
гидрофобный
Применение GFP
• Маркер в клеточной и молекулярной биологии
Green fluorescent protein (GFP) as a vital marker for pathogenic
development of the dermatophyte Trichophyton mentagrophytes
Gil Kaufman, Benjamin A. Horwitz, Ruthi Hadar, others
• Исследования в области вирусологии
An improved respiratory syncytial virus neutralization assay based on
the detection of green fluorescent protein expression and automated
plaque counting.
van Remmerden Y, Xu F, van Eldik M, others
Применение GFP
• Исследования в области генной терапии
Green fluorescent protein (GFP) fusion constructs in gene
therapy research.
Wahlfors J, Loimas S, Pasanen T, Hakkarainen T.
• Иммуногистохимия
Детекция экспрессии
маркеров (оценка
способности
дифференцироваться у
трансплантированных
клеток в спинном мозге
крысы)
Использование GFP как метки в
молекулярной биологии
FACS
Проточная цитометрия
•
•
•
•
Иммунология
Онкология
Цитология
Гематология
Получение рекомбинантного GFP
Задачи
1. Провести трансформацию E.Coli с pQE30GFP
2. Выделить плазмиду pQE30GFP
3. Экспрессировать GFP в E.coli
4. Выделить и очистить рекомбинантный GFP
5. Идентифицировать GFP методом иммуноблоттинга
(Western-blotting)
6. Отработать методику определения концентрации GFP с
использованием флуориметра VersaFluor (Bio-Rad)
Провести трансформацию E.Coli
Подобрать методику трансформации e.coli,
например:
Кальциевая трансформация, электропорация
методика Т.Маниатис, Э.Фрич, Дж. Сэмбрук
«Методы генетической.
Молекулярное клонирование.»
(стр.240, гл.8)
Выделить и очистить
экспрессированный GFP
На данном этапе работы необходимо разрушить
клетки и разделить растворимые элементы, от
нерастворимых.
Далее необходимо из полученного образца
выделить GFP.
Можно использовать классические методы
биохимии (сорбция, молек.сито, ИЭО и пр) в
сочетании с более современными методами.
Выделить рекомбинантный белок можно с помощью
метода металл-аффинной хроматографии (IMAC)
Руководство к практикуму по генной инженерии Евроген
Документ
Категория
Презентации по химии
Просмотров
9
Размер файла
2 664 Кб
Теги
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа