close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Слайд 1 - Добро пожаловать на

код для вставкиСкачать
Набор реагентов для исследования
биоценоза урогенитального тракта у
женщин методом ПЦР в режиме
реального времени Фемофлор.
ЗАО «НПФ ДНК-Технология»
2009 г.
Введение
До недавнего времени существовали значительные ограничения в изучении
микробиологических сообществ. Главные из них:
недостаточная дискриминация микроорганизмов по морфологическим
признакам;
cложности в культивировании большинства микроорганизмов.
Внедрение молекулярно-биологических методов позволило открыть большое
число новых микроорганизмов, расширить, упорядочить, а в некоторых случаях
пересмотреть знания о таксономии.
По современным оценкам более 90% микроорганизмов окружающей среды
ранее не могли быть культивированы и идентифицированы. В случае биоценоза
кишечника эта цифра составляет более 60%.
Вагинальный биоценоз представляет собой сложную сбалансированную
систему. Учитывая его влияние на протекание и исход беременности и на
инфицированность верхнего урогенитального тракта, изучение вагинального
биоценоза, его состава и принципы регуляции и восстановления в норме и при
патологиях представляет собой крайне важную задачу.
2
ПЦР - это ДНК-Технология
22 сентября 2014 г.
Вагинальная экосистема (биоценоз)
У здоровых женщин вагинальная экосистема хорошо сбалансирована и
стабильна. В 1 мл вагинальной жидкости в среднем содержится
около 109 бактерий (CFU - колоний образующих единиц).
В норме основным компонентом вагинального биоценоза
являются
лактобактерии. Они участвуют в метаболизме гликогена, который эксклюзивно
вырабатывается клетками вагинального эпителия, превращая его в молочную
кислоту и приводя к закислению – в норме pH 3,8 – 4,5.
Кислый pH в сочетании с выработкой бактериоцина (bacteriocin) и перекиси
водорода создает защиту, препятствующую колонизации урогенитального
тракта женщин другими микроорганизмами.
Кроме лактобактерий в норме могут присутствовать другие микроорганизмы,
например Staphylococci, group B Streptococci, Corynebacterium, Prevotella,
Peptostreptococcus, Gardnerella, Enteric bacteria и другие, причём похоже, что
существуют их устойчивые сочетания. В норме количество этих
микроорганизмов составляет около 104 -107 CFU/ml.
3
ПЦР - это ДНК-Технология
22 сентября 2014 г.
Нарушения вагинального биоценоза
Нарушения вагинального биоценоза связаны с вагинитами и
вагинозами.
Устойчивость биоценоза к воздействиям обусловлены:
4
генетическими факторами связанными с
функционированием иммунной системы, прежде всего
врожденного иммунитета;
составом биоценоза (вагинальной микрофлоры);
внешние факторы (LifeStyle)
ПЦР - это ДНК-Технология
22 сентября 2014 г.
Баквагиноз причина
Причина возникновения не ясна. Считается, что из-за снижения
количества лактобактерий, но почему оно снижается?
При снижении количества лактобактерий возникает «замкнутый круг»:
Снижение кол-ва лактобактерий
Уменьшение продукции H2O2
Рост ассоциированных с
баквагинозом бактерий
5
ПЦР - это ДНК-Технология
Повышение pH
22 сентября 2014 г.
Баквагиноз лечение
До 80-х преобладало мнение, что баквагиноз не болезнь, а
«неприятность» и в большинстве случаев специфическое лечение не
назначалось.
С 80-х из-за различных осложнений «на всякий случай» стали лечить
антибиотиками против анаэробов – metranidazole и clinamycine
(рекомендованы Центром Контроля Болезней, CDC).
Стандартное лечение метранидазолом и клинамицином в течение
недели помогает в 80-90% случаев.
Однако, в течение трех месяцев в 15-30% случаев рецидивирует, так
называемый рецидивирующий баквагиноз.
Проблема не в том, как убрать «плохие» бактерии, а в том
как восстановить нормальный биоценоз.
6
ПЦР - это ДНК-Технология
22 сентября 2014 г.
Как задача постановки диагноза
врачом решается сейчас
Врач
Осмотр
Жалобы
Микроскопия неокрашенного мазка
Лаборатория
Посев на флору
Микроскопия окрашенных мазков
ПЦР
7
По Граму
Метиленовым синим
Качественная оценка условных патогенов
ПЦР - это ДНК-Технология
22 сентября 2014 г.
Баквагиноз диагностика (1)
На сегодняшний день в мире наибольшее распространение при диагностике
баквагиноза получили критерии Амсела (Amsel criteria). Они включают четыре
диагностических теста, которые могут быть выполнены в кабинете лечащего врача
и лаборатории даже в присутствие пациента:
патологический характер вагинальных выделений;
рН вагинального отделяемого более 4,5;
положительный аминный тест (появление "рыбного" запаха
смешивании выделений с определенным химическим веществом);
выявление так называемых "ключевых" клеток при микроскопическом
исследовании влажных неокрашенных препаратов вагинального
отделяемого.
при
Для постановки диагноза достаточно 3 положительных признаков из 4.
8
ПЦР - это ДНК-Технология
22 сентября 2014 г.
Баквагиноз диагностика (2)
На
втором
месте
по
распространенности находятся
микроскопические методы с
оценкой в баллах (напр.,
«Nugent scoring», «Hay/Ison
scoring», «Schmidt scoring»).
9
Баллы
Число
лактобактерий
в поле
Число «малых»
бактерий в
поле
0
> 30
0
В качестве примера, слева
приведена система Шмидта
(Schmidt scoring).
1
16-30
1-5
2
6-15
6-15
Баллы суммируются
по двум колонкам;
3
1-5
16-30
7-8 - баквагиноз
4
0
>30
ПЦР - это ДНК-Технология
22 сентября 2014 г.
Сравнение мазок-посев
(по данным собственных
исследований)
Данные лабораторных исследований
10
% случаев
Микроскопия окрашенного мазка, не
выявившая клеток микроорганизмов
7,5
Микробиологические исследования с полным
отсутствием роста микроорганизмов
14
Дискордантные результаты между
микроскопическим и микробиологическим
исследованием по наличию микроорганизмов
разных групп (морфотипов)
29
ПЦР - это ДНК-Технология
22 сентября 2014 г.
Недостатки существующего
подхода
Посев на флору
Длительные сроки культивирования, повышенные требования к
транспортировке и хранению материала
Не все типы микроорганизмов растут равномерно – в процессе роста
теряется соотношение между ними
Ограниченный спектр выявляемых микроорганизмов
Отсутствие возможности культивирования большинства анаэробов
Повышенные требования к лаборатории
Микроскопия мазка
Субъективность оценки (изменчивость микроорганизмов, необходимость
диагностировать много морфотипов)
Не все микроорганизмы видны в световой микроскоп
Как следствие - ограниченный спектр выявляемых микроорганизмов
Невозможность сопоставить результаты
Приблизительная количественная оценка
ПЦР качественными методами
Не дает представления о соотношении микроорганизмов между собой
Ограниченный спектр выявляемых микроорганизмов
Нет количественной оценки
11
ПЦР - это ДНК-Технология
22 сентября 2014 г.
Чего мы хотим ?
Диагностика баквагиноза
или
оценка биоценоза?
Диагностика баквагиноза – «кто победил, хорошие или плохие?».
Ответ типа «Да/Нет» - есть БВ или нет.
Оценка биоценоза – количественная характеристика состава
«хороших» и «плохих», оценка их «сил», устойчивости биоценоза.
12
ПЦР - это ДНК-Технология
22 сентября 2014 г.
Относительный количественный анализ:
Анализ условно патогенной флоры
Анализ 20-ти образцов, взятых с потока в лаборатории, с
выявленной ДНК Gardnerella vaginalis
Lg N
9
8
7
16 2
+5 +
4
3
2
1
0
1
Lg( N gard / N lacto )
3
13
Количественный анализ ДНК G.Vaginalis
.
здоровые
женщины
Качественный ПЦР анализ
3
4
5
6
7
8
9
10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
с выраженным
вагинитом
+ + + + + + + + + + + + + + + + + +
диагноз
неустановлен
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
Отношение кол-ва G.vaginalis к Lactobacillus sp.
18
19
20
.
2
1
0
-1
-2
-3
-4
ПЦР - это ДНК-Технология
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
22 сентября 2014 г.
Анализ условно-патогенных
микроорганизмов
Врачу необходима информация о состоянии биоценоза в целом:
14
Информация о соотношении общей обсемененности
урогенитального тракта, лактобактерий и различных групп
микроорганизмов является ключевой при оценке состояния
биоценоза и, как следствие, состояния пациентки
Важна количественная оценка групп микроорганизмов, что
позволит оценивать динамические изменения состояния
биоценоза
ПЦР - это ДНК-Технология
22 сентября 2014 г.
Подход к разработке
диагностической системы
По литературным данным
более 100 различных
видов микроорганизмов
могут входить в состав
биоценоза
урогенитального тракта у
женщин. Эти
микроорганизмы можно
сгруппировать по признаку
генетического родства.
Для выявления этих групп
и были разработаны
реагенты.
15
ПЦР - это ДНК-Технология
22 сентября 2014 г.
Что такое Фемофлор?
Высококлассный метод для исследования урогенитального тракта у
женщин, позволяющий анализировать состояние биоценоза в
целом, оценивать соотношение микроорганизмов между собой.
Многофакторный (23 группы микроорганизмов, общая
бактериальная масса, контроль взятия материала. Итого: 25
показателей)
Уникальный по составу выявляемых микроорганизмов
Количественный
Точный
16
Высокая аналитическая чувствительность
Высокая аналитическая специфичность
Наглядный (ПО + выдача результатов)
Быстрый и несложный в использовании (стандартные
методики выделения ДНК и ПЦР амплификации)
Наличие готовых файлов с программами для ДТ-96 –
исключение ошибок и потери времени при
программировании амплификатора
ПЦР - это ДНК-Технология
22 сентября 2014 г.
Состав комплектов реагентов
Комплект реагентов позволяет количественно выявлять следующие
группы показателей:
17
Общую бактериальную массу
Лактобактерии
Аэробные микроорганизмы (факультативные анаэробы)
Анаэробные микроорганизмы
Микоплазмы
Грибы
Контроль взятия материала
Контроль прохождения реакции
ПЦР - это ДНК-Технология
22 сентября 2014 г.
Состав комплектов реагентов
Группа
Выявляемые показатели
Фемофлор
4
Фемофлор
8
Фемофлор 16
1
Общая бактериальная масса
●
●
●
2
Lactobacillus spp. / ВК
●
●
●
3
Сем. Enterobacteriaceae
●
●
4
Streptococcus spp.
●
●
5
Staphylococcus spp.
6
Gardnerella vaginalis/Prevotella bivia/
Porphyromonas spp.
7
Eubacterium spp.
8
Sneathia spp./Leptotrihia spp./Fusobacterium spp.
●
9
Megasphaera spp./Veilonella spp./Dialister spp.
●
10
Lachnobacterium spp./Clostridium spp.
●
11
Mobiluncus spp./Corynebacterium spp.
●
Анаэробные
микроорганизмы
12
Peptostreptococcus spp.
●
13
Atopobium vaginae
●
Группа
Микоплазм
14
Mycoplasma (hominis +genitalium )
15
Ureaplasma (urealyticum + parvum)
Грибы
16
Candida spp./контроль взятия материала
Диагностика
нормоценоза
Аэробные
микроорганизмы
18
ПЦР - это ДНК-Технология
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
22 сентября 2014 г.
Как это соотносится с уже
имеющимися исследованиями (1)
Исследование
баквагиноза - критерий
Нагента (Nugent
scoring). Микроскопия
окрашенного мазка.
Оценка состояния идет
по сумме балов.
0-3 нормальная
вагинальная
флора
4-6
промежуточное
состояние
7-10 баквагиноз
19
ПЦР - это ДНК-Технология
Баллы
Лактобактерии в
поле зрения
Гарднерелла
и бактероиды
Палочк
овая
флора
0
30<
0
0
1
5-30
<1
1-4
2
1-4
1-4
4<
3
<1
5-30
4
0
30<
Доля лактобактерий для нормофлоры >56%
Для баквагиноза доля лактобактерий меньше 11%
22 сентября 2014 г.
Как это соотносится с уже
имеющимися исследованиями (2)
В качестве примера,
слева
приведена
система
Шмидта
(Schmidt
scoring).
Микроскопия
окрашенного мазка.
Баллы
суммируются по
двум колонкам;
7-8 - баквагиноз
Баллы
Число
лактобактерий
в поле зрения
Число «малых»
бактерий в поле
зрения
0
> 30
0
1
16-30
1-5
2
6-15
6-15
3
1-5
16-30
4
0
>30
Баквагиноз диагностируется при доле
лактобактерий меньше 14%
20
ПЦР - это ДНК-Технология
22 сентября 2014 г.
Назначение комплектов
реагентов (1)
Фемофлор 16
21
Расширенная этиологическая диагностика условнопатогенной и нормофлоры (23 группы микроорганизмов)
Количественная оценка общей бактериальной массы
Количественная оценка лактобактерий (нормофлоры)
Контроль взятия биологического материала
Оценка эффективности проведенного лечения
Подробный мониторинг восстановления нормоценоза
ПЦР - это ДНК-Технология
22 сентября 2014 г.
Назначение комплектов
реагентов (2)
Фемофлор 4
Диагностика наиболее распространенных микроорганизмов
условно-патогенной флоры – 5 групп микроорганизмов
Количественная оценка общей бактериальной массы и
лактобактерий
Контроль взятия биологического материала
Контроль проведенного лечения
Фемофлор 8
Расширенная диагностика микроорганизмов условнопатогенной флоры (9 групп микроорганизмов)
Количественная оценка общей бактериальной массы и
лактобактерий
Контроль взятия биологического материала
Контроль проведенного лечения
22
ПЦР - это ДНК-Технология
22 сентября 2014 г.
Количественное исследование
В случае исследования биоценозов урогенитального тракта у
женщин определяется количество микроорганизмов в транспортной
среде, пропорциональное общей обсемененности
соответствующего биотопа.
Для исключения ложноотрицательных результатов предусмотрен
контроль взятия материала.
Интерпретации подлежат результаты со значением контроля взятия
материала более 104 (4 Log).
При КВМ менее 104 (4 Log) необходимо связаться с врачом для
выяснения состояния пациента или дополнительно взять материал.
23
ПЦР - это ДНК-Технология
22 сентября 2014 г.
Общая бактериальная масса (Log)
Контроль взятия материала
10
Зависимость количества
9
взятого материала от врача
8
Синими и красными ромбами
7
обозначены образцы,
6
взятые разными врачами
5
4
3
2
1
0
0
1
2
3
4
5
6
7
8
КВМ (контроль взятия материала)
24
ПЦР - это ДНК-Технология
22 сентября 2014 г.
Возможности настройки
системы выдачи результатов
1. Изменение уровня
отсечки ( Log)
2. Возможность
анализировать
результаты по
отдельным группам
организмов, выставляя
индивидуальный уровень
отсечки для каждого из
них
25
ПЦР - это ДНК-Технология
22 сентября 2014 г.
Инновационность
предлагаемого подхода (1):
26
Чувствительный «инструмент» с возможностью настройки под
решаемую задачу, обследуемую группу пациентов, конкретного
врача
Возможность количественной оценки различных групп
микроорганизмов и выявление соотношений между ними
Выявление труднокультивируемых облигатно-анаэробных
грамположительных бактерий (Atopobium vaginae), облигатноанаэробных грамотрицательных бактерий (Prevotella, Veilonella
spp, Porphyromonas spp, Fusobacterium spp, Eubacterium spp,
Sneathia, Leptotrichia, Megasphaera, Dialister, Lachnobacterium)
Выявление групп микроорганизмов, диагностика которых
методом ПЦР до сих пор не была представлена
Возможность проведения динамических наблюдений
Возможность проведения научных исследований (в том числе и
популяционных)
ПЦР - это ДНК-Технология
22 сентября 2014 г.
Инновационность
предлагаемого подхода (2):
25 параметров анализа (для Фемофлор 16)
Контроль взятия материала
Исследование нормофлоры
Количественное исследование всех параметров
Программное обеспечение, максимально облегчающее
работу врача лаборанта:
27
отчет о проведенном исследовании выдается программой в
доступной для анализа врача-клинициста форме
готовый файл загрузки (Фемофлор.ini) с программой
амплификации, что существенно экономит время и исключает
ошибки ручного программирования прибора (ДТ-96)
определение положения стрипа в термоблоке, позволяющее
исправить допущенные ошибки при установке стрипов
ПЦР - это ДНК-Технология
22 сентября 2014 г.
Оборудование и
программное обеспечение
Детектирующий
термоциклер ДТ-96,
«ДНК-Технология»
28
ПЦР - это ДНК-Технология
22 сентября 2014 г.
Апробация реагентов прошла
в следующих лабораториях:
1. НИИ Акушерства и гинекологии им. Отта (СПБ)
2. ЦНИИА и Г им. Кулакова (Москва)
3. Центр новых мед технологий (Новосибирск)
4. ДНК-Диагностика (Барнаул)
5. ДЦ (Бийск)
6. Ассоциация независимых клинико-диагностических
лабораторий «Ситилаб» (Казань)
7. УРНИИ Дерматовенерологии (Екатеринбург)
8. ДЦ Гармония (Екатеринбург)
29
ПЦР - это ДНК-Технология
22 сентября 2014 г.
Дополнительные
лабораторные исследования:
Исследование мазка на
лейкоциты
Качественный ПЦР анализ
на безусловные патогены
(хламидия, гонорея,
трихомонас)
Medicus Amicus #2, 2006,
http://www.medicusamicus.com/index.php?umonth=9&action=1x856-2-4a-5a-13gx2
30
ПЦР - это ДНК-Технология
22 сентября 2014 г.
Исследование популяционной
выборки (ПЦР, посев, мазок).
Показатель
Выявляемость разных
групп микроорганизмов (%).
Фемофлор
Мазок
Посев
100
81
74
нормофлора – Lactobacillus spp.
67
55
32
Enterobacterium spp.
8
не выявлено
10
Streptococcus spp.
12
не выявлено
13
Staphylococcus spp.
19
не выявлено
43
Gardnerella vaginalis/Prevotella bivia/Porphyromonas spp.
46
не выявлено
3
Eubacterium spp.
47
не выявлено
не выявлено
Sneathia spp./Leptotrihia spp./Fusobacterium spp.
12
не выявлено
не выявлено
Megasphaera spp./Veilonella spp./Dialister spp.
30
не выявлено
не выявлено
Lachnobacterium spp./Clostridium spp.
15
не выявлено
не выявлено
Mobiluncus spp./Corynebacterium spp.
17
1
30
Peptostreptococcus spp.
26
не выявлено
не выявлено
Atopobium vaginae
18
не выявлено
не выявлено
Mycoplasma spp.
3
не выявлено
Ureaplasma spp.
28
не выявлено
Candida spp.
3
не выявлено
Бактериальная масса
Всего образцов:
31
ПЦР - это ДНК-Технология
4
100% образцов
22 сентября 2014 г.
Отзывы клиентов:
«У пациенток с жалобами на выделения из влагалища целесообразно проводить
скрининговое исследование состояния урогенитального биоценоза методом
количественной Real-Time PCR «ФЕМОФЛОР 16»
«С помощью методов генодиагностики возможно выявление труднокультивируемых
облигатно-анаэробных грамположительных бактерий (Atopobium vaginae),
облигатно-анаэробных грамотрицательных бактерий (Prevotella, Veilonella spp,
Porphyromonas spp, Fusobacterium spp, Eubacterium spp, Sneathia, Leptotrichia,
Megasphera, Dialister, Lachnobacterium), мониторинг эффективности лечения»
УРНИИДВ (Екатеринбург)
«Тест-система Фемофлор-16 является чувствительным инструментом для
исследования биоценоза влагалища беременных женщин, позволяя выявлять как
выраженные отклонения от нормы, так и только намечающиеся.» ДЦ Гармония
(Екатеринбург)
32
ПЦР - это ДНК-Технология
22 сентября 2014 г.
Примеры результатов
проведенных исследований (1)
Нормоценоз
Состояние нормоценоза характеризуется следующими
показателями:
Контроль взятия материала (КВМ) >104 (4 Log)
Общая бакмасса от 106 до 109 (6-9 Log)
Нормофлора от 106 до 109 (6-9 Log) относительно
ОБМ – от 0-до 0,5 – нормальный уровень
Аэробная и анаэробная условно-патогенная
флора относительно ОБМ меньше 3 –
нормальный уровень
Микоплазмы: Mycoplasma (hominis + genitalium) –
отсутствуют;
Уреаплазмы: больше 104 диагностически значимый
уровень
Грибы рода Candida. Менее 103 (<3 Log).
диагностически незначимый уровень
Нормальный биоценоз обладает свойствами
устойчивости и саморегуляции.
для женщин репродуктивного возраста.
33
ПЦР - это ДНК-Технология
22 сентября 2014 г.
Примеры результатов
проведенных исследований (2)
Умеренный дисбаланс
Состояние умеренного дисбаланса
характеризуется следующими
показателями:
Контроль взятия материала (КВМ) >104 (4
Log)
Общая бакмасса от 106 до 109 (6-9 Log)
Нормофлора (Lactobacillus spp.) 0-0,5
относительно ОБМ – нормальный
уровень
Аэробная и анаэробная условнопатогенная флора Больше -1 –
значительно увеличенный уровень.
Микоплазмы: отсутствуют;
Уреаплазмы: Ureaplasma (urealiticum +
parvum) больше 104 - диагностически
значимый уровень.
Грибы рода Candida. Менее 103 (<3 Log).
Диагностически незначимый уровень
34
ПЦР - это ДНК-Технология
22 сентября 2014 г.
Примеры результатов
проведенных исследований (3)
Выраженный дисбаланс
Состояние выраженного дисбаланса характеризуется
следующими показателями:
Контроль взятия материала (КВМ) >104 (4 Log)
Общая бакмасса может иметь нормальный,
повышенный или пониженный уровень.
Нормофлора (Lactobacillus spp.) – относительно ОБМ
- значительно сниженный уровень
Аэробная и анаэробная условно-патогенная
флора отличается разнообразием
микроорганизмов. Доля большей части
представителей условно-патогенной
микрофлоры превышает долю лактобактерий в
общей бактериальной массе. Значительно
повышенный уровень.
Микоплазмы: Mycoplasma (hominis + genitalium) –
могут присутствовать в диагностически
значимых количествах.
Уреаплазмы: Ureaplasma (urealiticum + parvum) могут
присутствовать в диагностически значимых
количествах.
Грибы рода Candida. присутствие более 103 (>3 Log)
– диагностически значимый уровень.
35
ПЦР - это ДНК-Технология
22 сентября 2014 г.
Оценка состояния биоценоза
(примеры)
36
37 лет,
27 лет,
23 года,
жалоб нет, здорова
жалобы, пенистые
выделения
прием оральных контрацептивов,
жалоб нет, по мнению врача здорова
22 сентября 2014 г.
ПЦР - это ДНК-Технология
Возникающие в процессе работы вопросы
Выдача результатов 1
Процентное соотношение микроорганизмов в исследуемом биоценозе.
Lactobacillus spp.
3%
Enterobacteriaceae
Streptococcus spp.
Staphylococcus spp.
Gardnerella vaginalis/Prevotella bivia/Porphyromonas
spp.
Eubacterium spp.
Sneathia spp./Leptotrihia spp./Fusobacterium spp.
Megasphaera spp./Veilonella spp/Dialister spp.
Lachnobacterium spp./Clostridium spp.
Mobiluncus spp./Corynebacterium spp.
Peptostreptococcus spp.
Atopobium vaginae
Mycoplasma (hominis + genitalium)
97%
Ureaplasma (urealyticum + parvum)
Candida spp.
38
ПЦР - это ДНК-Технология
22 сентября 2014 г.
Выдача результатов 2
Процентное соотношение микроорганизмов в исследуемом биоценозе.
1%
1%
Lactobacillus spp.
3%
Enterobacteriaceae
Streptococcus spp.
Staphylococcus spp.
Gardnerella vaginalis/Prevotella bivia/Porphyromonas
spp.
Eubacterium spp.
Sneathia spp./Leptotrihia spp./Fusobacterium spp.
Megasphaera spp./Veilonella spp/Dialister spp.
Lachnobacterium spp./Clostridium spp.
Mobiluncus spp./Corynebacterium spp.
Peptostreptococcus spp.
Atopobium vaginae
Mycoplasma (hominis + genitalium)
95%
Ureaplasma (urealyticum + parvum)
Candida spp.
39
ПЦР - это ДНК-Технология
22 сентября 2014 г.
Выдача результатов 3
Процентное соотношение микроорганизмов в исследуемом биоценозе.
Lactobacillus spp.
2%
Enterobacteriaceae
11%
Streptococcus spp.
Staphylococcus spp.
Gardnerella vaginalis/Prevotella bivia/Porphyromonas
spp.
Eubacterium spp.
Sneathia spp./Leptotrihia spp./Fusobacterium spp.
Megasphaera spp./Veilonella spp/Dialister spp.
Lachnobacterium spp./Clostridium spp.
Mobiluncus spp./Corynebacterium spp.
Peptostreptococcus spp.
Atopobium vaginae
Mycoplasma (hominis + genitalium)
87%
Ureaplasma (urealyticum + parvum)
Candida spp.
40
ПЦР - это ДНК-Технология
22 сентября 2014 г.
Что такое логарифмы?
число
41
lg
100
2
1 000
3
10 000
4
10 0000
5
1 000 000
6
10 000 000
7
100 000 000
8
ПЦР - это ДНК-Технология
22 сентября 2014 г.
Что такое логарифмы? 2
42
Число
lg
100
2
126
2,1
158
2,2
200
2,3
251
2,4
316
2,5
398
2,6
501
2,7
631
2,8
794
2,9
1 000
3
ПЦР - это ДНК-Технология
22 сентября 2014 г.
Что нам с этим делать?
1. Думать
2. Еще раз думать
3. Грамотно брать материал
4. Проводить дополнительные анализы
5. Работать в тесном контакте с клиницистами
6. http://www.dnatech.ru/information/fordoctors/diagnosticsippp/
43
ПЦР - это ДНК-Технология
22 сентября 2014 г.
Что с этим делают другие?
Исследования биоценозов урогенитального тракта женщин
репродуктивного возраста
Жалобы без клинических проявлений (U,V,C)
Случаи несовпадения клиники и лабораторных
исследований
Повторные обращения после лечения
Оценка эффективности ЭКО
Оценка эффективности проведенного лечения
Оценка восстановления нормофлоры
Проблемы с невынашиванием беременности
Исследования биоценозов беременных женщин
Оценка объема предполагаемой терапии
Исследования биоценозов женщин в менопаузе
44
ПЦР - это ДНК-Технология
22 сентября 2014 г.
Группы обследованных
женщин
Не беременные женщины репродуктивного возраста (67
пациенток в возрасте от 19 до 49 лет, 32 года)
Клинически здоровые
Патологические проявления
Воспалительные процессы
Женщины в менопаузе ( 33 пациентки в возрасте от 41 до
73 лет, 53,3 года)
Физиологическая норма
Сухость слизистой
45
ПЦР - это ДНК-Технология
22 сентября 2014 г.
Общая бактериальная масса в
подгруппах женщин в менопаузе по
сравнению с реподуктивной нормой
Общая бактериальная масса, ГЭ
50 000 000
5 000 000
500 000
2а – менопауза,
норма
50 000
2a
2b
Норма
Медиана
25%-75%
1%-99%
аномальные значения
2б – менопауза,
сухость
Группа пациенток
46
ПЦР - это ДНК-Технология
22 сентября 2014 г.
Лактобактерии в подгруппах женщин в
менопаузе по сравнению с
реподуктивной нормой
5 000 000
Лактобациллы, ГЭ
500 000
50 000
5 000
500
2а – менопауза,
норма
50
5
1
2a
2b
Норма
Медиана
25%-75%
1%-99%
Аномальные значения
2б – менопауза,
сухость
Группа пациенток
47
ПЦР - это ДНК-Технология
22 сентября 2014 г.
Группа женщин
репродуктивного возраста
«Норма»
«Патология»
Общая бак.масса 106,5 (105,7106,8 ) ГЭ
Общая бак.масса 107,2 (106,6-107,6)
ГЭ
Лактобациллы 106,1 (105,4- 106,6)
ГЭ
Лактобациллы 104,3 (102,0-106,6)
ГЭ
Доля лактобацилл 78 (50-79)%
Доля лактобацилл 0,8% ((0-37,6))
Доля Gardnerella 0,1 (0-6,3)%
Доля Gardnerella 15,8% (9,0-29,9)
Eubacterium spp. (p=0,000091),
Megasphaera spp./Veillonella
spp./Dialister spp. (p=0,000018),
Peptostreptococcus spp. (p=0,0008),
Atopobium vaginae (p=0,003).
48
ПЦР - это ДНК-Технология
22 сентября 2014 г.
Группа женщин в менопаузе
«Норма»
«Патология» (сухость слизистой)
Общая бак.масса 106,5 (105,6107,1 ) ГЭ
Общая бак.масса 105,0 (104,3-105,3 )
ГЭ
Лактобациллы 104,4 (101,1- 106,5)
ГЭ
Лактобациллы 102,6 (100,0- 105,3) ГЭ
Доля лактобацилл 3 (0-56)%
Доля Gardnerella 18 (0-32)%
49
ПЦР - это ДНК-Технология
Доля лактобацилл 7 (0-12)%
Доля Gardnerella 12 (3-30)%
22 сентября 2014 г.
Выводы:
С помощью реагентов Фемофлор был количественно
охарактеризован биоценоз влагалища женщин репродуктивного
возраста и женщин в менопаузе.
В группе женщин репродуктивного возраста показаны
достоверные различия в количестве общей бактериальной
массы между пациентками с дисбиозом влагалища и
клинически здоровыми. Кроме того, показан выраженный рост
общей бактериальной массы на фоне снижения доли
лактобацилл и увеличения доли анаэробных микроорганизмов
при развитии дисбиотических нарушений.
Для женщин в менопаузе было продемонстрировано, что
снижение общей бактериальной массы и доли лактобацилл, повидимому, является физиологически нормальным процессом
для этой группы.
50
ПЦР - это ДНК-Технология
22 сентября 2014 г.
Спасибо за внимание!
Справочно:
Описание:
Комплектация:
Фемофлор 16 – 12 тестов (по 2 стрипа каждый) в упаковке
Фемофлор 8 – 24 теста (по 1 стрипу на тест) в упаковке
Фемофлор 4 – 48 тестов (2 теста на стрип)в упаковке
Рекомендуемые системы выделения (в комплект поставки не входят):
«Проба НК»
«Проба ГС»
Срок хранения – 6 месяцев
Температура хранения +2 +8ºС
Условия транспортировки 72 часа при температуре от +18 до +25ºС
53
ПЦР - это ДНК-Технология
22 сентября 2014 г.
Что предлагаемый анализ дает
врачу:
54
Оценка биоценоза в целом
Современные методы диагностики
Данный анализ более информативен, т.к. позволяет
проводить сравнение количества бактериальной массы с
лактобактериями – определение объема назначаемой
терапии
Данный анализ выявляет многие микроорганизмы, которые
не видны в микроскоп или не растут на питательных средах
– определение этиологии инфекционного процесса
Возможность проведения динамических наблюдений
По сравнению с посевом на питательные среды (срок
исполнения 5 дней) этот анализ гораздо быстрее результаты могут быть получены в течение суток
ПЦР - это ДНК-Технология
22 сентября 2014 г.
Немного цифр
Время,
дни
Анализы
1- 5 дней
Стандартная
схема
лечения
7 дней
Анализы
1-5 дней
Схема
лечения
Деньги, руб.
400 - 800 руб.
Трихопол
300 - 400 руб.
Нео-Пенатран
Дополнительн 7 дней
ая схема
лечения
400 – 800 руб.
Орнидазол
600 - 800 руб.
Бетадин
Микосист
Итого:
55
16 –24 дней
ПЦР - это ДНК-Технология
1700 –
2800 руб.
22 сентября 2014 г.
Что анализ дает пациенту
Полная и информативная диагностика за 1 визит
к врачу
Данный анализ позволит пациенту избежать
избыточного лечения (гиперпрагмазии)
Индивидуально подобранная терапия для
каждого пациента
Возможность контролировать проведенное
лечение и восстановление нормальной флоры
Стоимость количественного определения каждого
из показателей сопоставима (или даже меньше),
чем стоимость неинформативного в данном
случае качественного анализа методом ПЦР
56
ПЦР - это ДНК-Технология
22 сентября 2014 г.
Проблемы диагностики заболеваний,
связанных с условными патогенами
Существующие в настоящее время подходы к диагностике условнопатогенной флоры не всегда информативны для врача, т.к.
57
Не дают представления о соотношении микроорганизмов,
составляющих биоценоз, между собой
Выявляют ограниченный спектр микроорганизмов
Не дают количественной оценки
ПЦР - это ДНК-Технология
22 сентября 2014 г.
Дополнительно:
58
Выявление Atopobium vaginae регламентировано
приказом МЗ РФ N 64 от 21 февраля 2000 г.
Раздел микробиологические исследования
условно-патогенные облигатные анаэробные
микроорганизмы.
ПЦР - это ДНК-Технология
22 сентября 2014 г.
Сравнение методов
1. Врачам достаточно того, что есть сейчас – микроскопии
окрашенного мазка и посева на питательные среды
Каждый 7 бак.посев не вырастает
Каждый 12 мазок не информативен
19 из 23 показателей выявляются неадекватно или вообще
не выявляются при помощи мазка или посева
Количественная оценка по данным мазка или посева
проводится очень приблизительно
Результат мазка зависит от квалификации врача-лаборанта
Результат посева – от качества используемых сред,
работы лаборатории, квалификации врача-лаборанта
В процессе роста микроорганизмов на среде теряется
соотношение между ними
59
ПЦР - это ДНК-Технология
22 сентября 2014 г.
Сравнение методов (2)
2. На рынке уже есть реагенты для выявления условных патогенов
методом ПЦР
В большинстве случаев эти реагенты позволяют проводить
только качественный анализ, который не может быть
информативен для врача (важно знать не только
качественный, но и количественный состав микробиоты)
Нет реагентов, позволяющих проводить сравнение
количеств условно-патогенных микроорганизмов с
лактобактериями
Нет реагентов, которые позволяли бы проводить
количественную оценку такого числа (23 группы) условнопатогенных микроорганизмов урогенитального тракта
60
ПЦР - это ДНК-Технология
22 сентября 2014 г.
Как выглядит К+?
61
ПЦР - это ДНК-Технология
22 сентября 2014 г.
Как выглядит К-?
62
ПЦР - это ДНК-Технология
22 сентября 2014 г.
Артефакты
63
ПЦР - это ДНК-Технология
22 сентября 2014 г.
Артефакты 2
64
ПЦР - это ДНК-Технология
22 сентября 2014 г.
Литература по теме (1)
Анкирская А.С., Муравьева В.В. Опыт микробиологической диагностики
оппортунистических инфекций влагалища. Клиническая микробиология и
антимикробная химиотерпия., 2001, т.3, №2, с.190-194.
Бодяжина В.И., Сметник В.П., Тумилович Л.Г. Неоперативная гинекология:
Руководство для врачей. – М.: Медицина, 1990. – 540с.
Василевская Л.Н., Грищенко В.И., Кобзева Н.В., Юровская В.П. Гинекология:
учебник, - М., Медицина, 1985.
Дмитриев Г.А. Лабораторная диагностика бактериальных урогенитальных инфекций.
– М.:Медицинская книга; Н.Новгород: Издательство НГМА, 2003. – 336с.
Кира Е.Ф. 1994. Клиника и диагностика бактериального вагиноза // Акушерство и
гинекология, № 2, С. 32-35.
Кисина В.И., Клинико-диагностические аспекты и лечение вагинальных инфекций //
Венерические болезни.- 2004.- Том 6. - № 3. – С. 202-204.
Коршунов В. М., Володин Н. Н., Ефимов Б. А., Саркисов С. Э. и др. Микроэкология
влагалища. Коррекция микрофлоры при вагинальных дисбактериозах, Москва.
– 1999. – 80с.
65
ПЦР - это ДНК-Технология
22 сентября 2014 г.
Литература по теме (2)
Кубанова А. А., Аковбян В. А., Федоров С. М., Бакалова Л. А., Халатов А. О.
Состояние проблемы бактериального вагиноза // Вестник дермат. и венерол.—
1996.— № 3.— С. 22–26.
Методическиe указания МУ 1.3.1888-04. Организация работы при исследованиях
методом ПЦР материала, инфицированного патогенными биологическими
агентами III-IV групп патогенности, Москва. – 2004.
Об унификации микробиологических (бактериологических) методов исследования,
применяемых в клинико-диагностических лабораториях лечебнопрофилактических учреждений. Приказ МЗ СССР №535 от 22.04.1985.
Brotman RM, Erbelding EJ, Jamshidi RM, et al. Findings associated with recurrence of
bacterial vaginosis among adolescents attending sexually transmitted diseases
clinics. J Pediatr Adolesc Gynecol. 2007 Aug;20(4):225-31
Ferris MJ, Masztal A, Aldridge KE. et al. Association of Atopobium vaginae, a recently
described metronidazole resistant anaerobe, with bacterial vaginosis. BMC Infect
Dis. 2004 Feb 13;4:5.
French JI, McGregor JA, Draper D et al. Gestational bleeding, bacterial vaginosis, and
common reproductive tract infections: risk for preterm birth and benefit of treatment.
Obstet Gynecol. 1999 May;93(5 Pt 1):715-24
Hager WD, McDaniel PS Treatment of serious obstetric and gynecologic infections with
cefoxitin. J Reprod Med. 1983 May;28(5):337-40.
66
ПЦР - это ДНК-Технология
22 сентября 2014 г.
Литература по теме (3)
Hashemi FB, Ghassemi M, Roebuck KA, Spear GT Activation of human immunodeficiency
virus type 1 expression by Gardnerella vaginalis. J Infect Dis. 1999 Apr;179(4):92430
Klebanoff M.A., Schwebke JR, Zhang J et al. Vulvovaginal symptoms in women with
bacterial vaginosis. Obstet Gynecol, 2004; 104:267-272.
Larsson PG, Carlsson B. Does pre- and postoperative metronidazole treatment lower
vaginal cuff infection rate after abdominal hysterectomy among women with bacterial
vaginosis? Infect Dis Obstet Gynecol. 2002;10(3):133-40.
Leitich H, Bodner-Adler B, Brunbauer M, Kaider A, Egarter C, Husslein P. Bacterial
vaginosis as a risk factor for preterm delivery: a meta-analysis. Am J Obstet Gynecol.
2003 Jul;189(1):139-47
Mead P. B. Epidemiology of bacterial vaginosis // Am. J. Obstet. Gynecol.- 1993.- Vol.169,
N.2, pt.2. – P.446-449.
Mullis KB. Target amplification for DNA analysis by the polymerase chain reaction. Ann
Biol Clin (Paris). 1990;48(8):579-82
Nugent RP, Krohn MA, Hillier SL Reliability of diagnosing bacterial vaginosis is improved
by a standardized method of gram stain interpretation. J Clin Microbiol. 1991
Feb;29(2):297-301
67
ПЦР - это ДНК-Технология
22 сентября 2014 г.
Использованная литература
(4)
Paneth NS.The problem of low birth weight.. Future Child. 1995 Spring;5(1):19-34.
Schwiertz A, Taras D, Rusch K, Rusch V. Throwing the dice for the diagnosis of vaginal
complaints? Ann Clin Microbiol Antimicrob. 2006 Feb 17;5:4, 1-7
Sewankambo N, Gray RH, Wawer MJ et al,.HIV-1 infection associated with abnormal
vaginal flora morphology and bacterial vaginosis. Lancet. 1997 Aug
23;350(9077):546-50
Sha BE, Zariffard MR, Wang QJ et al. Female genital-tract HIV load correlates inversely
with Lactobacillus species but positively with bacterial vaginosis and Mycoplasma
hominis. J Infect Dis. 2005 Jan 1;191(1):25-32. Epub 2004 Dec 2
Wiesenfeld HC.;Hillier, Sharon L.;et al. Bacterial vaginosis is a strong predictor of
Neisseria gonorrhoeae and Chlamydia trachomatis infection. Clin Infect Dis. 2003
Mar 1;36(5):663–66
Zhou X, Bent SJ, Schneider MG et aal Characterization of vaginal microbial communities
in adult healthy women using cultivation-independent methods. Microbiology. 2004
Aug;150(Pt 8):2565-73.
68
ПЦР - это ДНК-Технология
22 сентября 2014 г.
Документ
Категория
Презентации
Просмотров
32
Размер файла
3 025 Кб
Теги
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа