close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Лекция 14 - knome.ru

код для вставкиСкачать
Лекция 14.
Современные методы для изучения
регуляции метаболических реакций в
клетке.
Геномика и транскрипционный анализ. Проблема ИНФО. Современные
возможности определения структуры и функции нуклеиновых кислот. Геномные
манипуляции и технологии искусственного синтеза геномов. Матричный и
безматричный синтез ДНК. Методы геномной трансплантации.
Секвенирование
I
Выделение
геномной ДНК
и создание
библиотеки
фрагментов.
II
III
Сборка
Аннотация
и анализ
Достижения
Фрагмент ДНК
Многократная случайная
фрагментация (Shotgun)
Создание библиотеки
www.themegallery.com
Создание библиотеки
Фрагмент ДНК
Многократная случайная
фрагментация (Shotgun)
~500 нп
~500 нп
Sanger Method: Generating Read
1. Start at primer
(restriction site)
2. Grow DNA chain
3. Include ddNTPs
4. Stops reaction at
all possible points
5. Separate products
by length, using
gel electrophoresis
Automatic
DNA
sequencing
Electrophoresis Diagrams
Использованные
программы
Phred (http://www.phrap.org) - обработка хроматограмм
LUCY (http://www.tigr.org/software/) – удаление концов вектора,
оценка качества прочтений
TIGR (http://www.tigr.org/software/) - сборка
BAMBUS (http://www.tigr.org/software/) - взаимная ориентация
контигов (построение скаффолдов)
Информационные проблемы
• 1 запуск до 100 гбп нуклеотидов – 10 терра байт данных – стоимость
хранения до 10 тыс руб. – скорость передачи от 10-20 часов
• При увеличении скорости оборудования на порядок –
мы приближаемся к предельной скорости передачи данных и
критической стоимости обработки информации
• Обработка данных 1 запуска сиквенатора – зачастую требует
до 10-20 запусков алгоритмов расчета.
• Стоимость вычислительных мощностей приближается к стоимости
оборудования (но реактивы отсутствуют для компьютеров)
Молекулярные колонии
Системы второго поколения
Genome sequencer 20/FLX
Solexa 1G
SOLiD system
Polonator G.007
www.themegallery.com
Системы третьего поколения
без амплификационные
(Single-molecular sequencing
• Методы второго поколения,
использующие ПЦР, могут выдавать
ошибки, вызванные
амплификацией.
• SMS (Single-molecular sequencing) –
новое поколение методов.
454 пиросеквенирование
• Амплификация в водно-масляной эмульсии
• Детекция во время синтеза – флуоресценция при
отщеплении пирофосфата
454 пиросеквенирование –
подготовка библиотеки
Фрагментация геномной ДНК
Получение тупых концов
Пришивка адаптеров
Получение одноцепочечной
ДНК
454 пиросеквенирование –
амплификация
Библиотека фрагментов ДНК
Приготовление водномасляной эмульсии
Иммобилизация на бусинах
ПЦР в эмульсии
Получение одноцепочечной
ДНК
454 пиросеквенирование –
считывание
454 пиросеквенирование –
считывание
SOLiD & Polonator
• Амплификация в водно-масляной эмульсии
• Детекция путём лигирования
SOLiD – подготовка библиотеки
SOLiD – амплификация
SOLiD – считывание
SOLiD – считывание
Зонды
Матрица
Второй нуклеотид
Первый нуклеотид
SOLiD – считывание
1. Праймирование и
лигирование
Лигаза
Сиквенсовый праймер
Адаптер
2. Детекция
3. Кэпирование
Возбуждение
Матрица
Эмиссия
SOLiD – считывание
4. Отщепление
флуоресцентной метки
5. Повторение цикла
6. Денатурация и отжиг
нового праймера
циклов
SOLiD – считывание
7. Повторение стадий 1-5 с
новым праймером
8. Повторение цикла с
последовательными праймерами
Праймерный цикл
Позиция
Праймер
Праймер
Праймер
Праймер
Праймер
Праймер
Вставка
Вставка
Вставка
Тестируемые позиции
Цикл лигирования
Illumina SOLEXA
• Амплификация на твёрдой подложке
• Детекция во время синтеза – обратимые
терминаторы с флуоресцентной меткой
• Четыре вида флуоресцентных меток
• Все нуклеотиды присутствуют одновременно
Illumina SOLEXA – подготовка
библиотеки
Фрагменты ДНК
Адаптеры
Illumina SOLEXA – амплификация
Адаптер
Фрагмент ДНК
Праймеры
Адаптер
Пришитые концы
Свободные
концы
Молекулярные
колонии
Считывание
Пришитые концы
Illumina SOLEXA – считывание
Первый цикл
считывания
Следующий цикл
считывания
Illumina SOLEXA
HeliScope
• Нет стадии амплификации – секвенирование
индивидуальных молекул
• Детекция во время синтеза – обратимые
терминаторы с флуоресцентной меткой
• Один вид флуоресцентной метки
• Последовательная промывка образца нуклеотидами
HeliScope
Поли-А адаптер
Секвенируемый фрагмент
Поли-Т адаптер
Подложка
Детекция включения нуклеотидов
HeliScope
Детекция флуоресценции
Промывка dNTP
A
G
C
T
Подложка
Новые методы секвенирования
Метод
амплификации
Метод
считывания
454
ПЦР в эмульсии
Синтез
SOLiD &
Polonator
ПЦР в эмульсии
Лигирование
SOLEXA
ПЦР на твёрдом
субстрате
Синтез
HeliScope
Нет
Синтез
Методы нанопорового
секвенирования
Методы нанопорового
секвенирования
Методы нанопорового
секвенирования
Методы нанопорового
секвенирования
Методы нанопорового
секвенирования
RNA-seq
"Reads"
454
Illumina
Sequencing
SOLiD
Paired end
separation
3 kb
3 kb
Read length
(update)
250 bp (400) 35, 75 and 100
bp
35 and 50 bp
Cost per Mb
$ 84.39
$ 5.97
$ 5.81
Time per paired
end run
7 hours
4 days
5 days
up to 10kb
Квантификация экспресии
Оборудование нового поколения для секвенирования ДНК в России
Название учреждения
Платформа
РНЦ «Курчатовский институт», Москва
Illumina GA IIx (×3)
Applied Biosystems
SOLiD 4 (×2)
НИИ химической биологии и фундаментальной
медицины СО РАН, Новосибирск
Applied Biosystems
SOLiD 4
454/Roche FLX
Titanium
Инновационно-технологический центр «Биологически
активные соединения и их применение» РАН, Москва
llumina GA IIx
Институт общей генетики им Н. И. Вавилова, Москва
Applied Biosystems
SOLiD 4
llumina HiSeq 2000
Институт молекулярной биологии им.
В. А. Энгельгардта РАН, Москва
llumina GA IIx
Генаналитика, Москва
Applied Biosystems
SOLiD 4
Секретная станция переливания крови, Киров
454/Roche FLX
Titanium
Лимнологический институт СО РАН, Иркутск
454/Roche FLX
Titanium
Центр «Биоинженерия» РАН, Москва
454/Roche FLX
Titanium
НИИ физико-химической медицины, Москва
Applied
Biosystems SOLiD
4
Биологический факультет МГУ им. М. В. Ломоносова,
Москва
Applied Biosystems
SOLiD 4
Синтез генома de novo
Синтез генома de novo
Химический синтез генома
Creating Bacterial Strains from Genomes That Have Been Cloned
and Engineered in Yeast
Создание бактерии с химически-синтезированным
геномом
Клетка — элементарная единица строения и
жизнедеятельности всех живых организмов
•Самостоятельное существование
•Самовоспроизведение
•Развитие
•Обмен веществ и энергии
Бактерии с химически синтезированным геномом быстро
размножаются и внешне практически не отличаются от
«диких» бактерий Mycoplasma mycoides.
Creation of a Bacterial Cell Controlled by a
Chemically Synthesized Genome
Daniel G. Gibson, et al. Science 329, 52 (2010)
Metabolic reconstruction of a minimal cell
New paradigm in genomic and
proteomic research
Sequencing
Annotation
Proteomics
Proteogenomics
Library generation
Sequencing
Assembly and
Annotation
Draft
genome
Variety of MS/MS
Complete
genome
Reannotation
Документ
Категория
Презентации
Просмотров
19
Размер файла
9 028 Кб
Теги
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа