close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Орехов

код для вставкиСкачать
ДНК-идентификация
животных
Экспертное исследование ДНК нечеловеческого
происхождения
Орехов В.А.
ООО “ГОРДИЗ”
31 января 2013 г.
г. Звенигород
«Нечеловеческая» ДНК в экспертной
практике
Применяется с середины 90-х годов.
В последнее время повышенный интерес,
публикации, монографии:
- Типирование нечеловеческой ДНК (Coyle, 2008)
- Судебная микробиология (Budowle, 2011)
- Рекомендации ISFG (2011)
Домашние животные:
свидетели, нарушители, жертвы
Россия занимает 2 место в мире после США по
числу домашних животных на душу населения:
33% семей содержат кошек (25-30 млн. кошек),
20% семей содержат собак (20 млн. собак).
При проникновении в помещение с домашним
животным неизбежна «контаминация» шерстью
(D’Andrea, 1998) -> возможность привязки к
месту преступления либо хозяину животного
(мтДНК, реже STR).
Животные-нарушители: нападения на людей ->
доказательство виновности или невиновности
(Австралия: 4 миллиона собак, ~ 100 000 нападений
на людей, большинство не раскрыто)
Животные-жертвы: случаи жестокого обращения с
животными
Домашние животные: собаки
Охарактеризовано > 30 кандидатных STR-маркеров
(три-, тетра-, пента- гекса-, Tom 2010; Berger, 2008; van Asch 2008).
Опубликованы мультиплексы:
DogFiler – 16 локусов (Wictum, 2013)
Mini-DogFiler 3 мультиплекса с мини STR(Kun, 2013)
Работают на волках, лисах, койотах
Иерусалим - c 2012 база данных
Генотипирование экскрементов
Штраф > 100 USD
Премия – упаковка корма
Ранее в Петах-Тикве.
Домашние животные: кошки
Охарактеризовано 49 кандидатных STR-маркеров (Menotti-Raymond, 1999, 2005)
Предложена стандартная панель из 11 локусов.
Реализовано – MeowPlex (Butler, 2002).
MewPlex: 11 STR + SRY
PD = 5,5 X 107 - 3,3 X 1013
Судебная ботаника
1. Связь с подозреваемого или жертвы с местом
преступления через следы растений. Возможно
при условии уникального видового состава
растительности.
1993 год – два семени дерева Parkinsonia aculeata
с места преступления в багажнике пикапа
подозреваемого – доказательство вины. (Yoon,
1993)
2. Географическое происхождение наркотиков (марихуана)
Возможность отследить связь пользователя с дилером и
производителем. Типирование высокополиморфных STRмаркеров позволяет различить даже инбредные линии.
Возможен анализ смесей. (Hsieh, 2003).
Возможно создание базы данных.
Судебная ботаника
Шалфей предсказателей
Salvia divinorum
15 STR multiplex PCR - Cannabis species
Австралия, база данных (Howard, 2008)
Судебная микробиология и энтомология
Идентификация биологических следов. Бактерии Lactobacillus crispatus и
Lactobacillus gasseri специфичны для вагинальных секретов– возможность
идентификации вагинальных выделений. Менструальное происхождение крови.
Streptococcus – обнаруживаются только в ротовой полости человека – слюна,
отличить кровь из ротовой полости от другой крови (Donaldson, 2010)
Видовой состав бактерий и грибов почвы, найденной на одежде или обуви
может дать привязку к конкретной местности.
Биотероризм. Октябрь 2001 –атака на правительственные учреждения США.
22 почтовых конверта с сибирской язвой -> 5 человек погибло.
125 000 конвертов были протестированы на отсутствие сибирской язвы.
ФБР – рабочая гурппа по судебной микробиологии (Budowle)
Личинки насекомых Diptera – привязка трупа к месту преступления.
Определение давности трупа по стадии развития личинок.
Анализ видовой принадлежности
животных
1. Идентификация останков неизвестного происхождения (фрагменты костей).
Человек или животное?
2. Незаконная торговля редкими и исчизающими видами (годовой оборот 20
млрд.$ в год).
3. Агрессия диких животных (нападение на людей, домашних животных).
4. Случаи незаконной охоты на диких животных.
Этапы анализа видовой принадлежности
1. Секвенирование участка мтДНК
мтДНК - Контрольный регион – не пригоден,
высокая внутривидовая изменчивость
мтДНК ген Цитохрома b - наиболее удобен
для идентификации видов позвоночных
(Parson, 2000), позволяет дискриминировать
даже близкие виды
мтДНК – ген 12S рРНК – слишком
консервативен. Информативно ~150 bp
мтДНК – ген COI – консервативен, выбран
проектом Barcode of life 648 bp
2. Анализ последовательности мтДНК:
- Сравнение с референсными образцами;
- Поиск гомологии в GeneBank;
- Сравнение с референсной базой данных (Barcode of life)
Сравнение с референсными образцами
Рекомендация ISFG – параллельно с исследуемыми образцами
анализировать референсные образцы из надежного источника.
Последовательности выравниваются
Проводится филогенетический анализ
Поиск гомологии в GeneBank
Последовательности загружаются в Blast: http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/
Поиск максимальной гомологии в базе GeneBank
GeneBank - Нереферируемая база данных, может содержать ошибки
Фрагментрый анализ мтДНК
определение видовой принадлежности
Мишень: участок контрольного региона мтДНК –> высокий межвидовой
полиморфизм по длине.
Высокая чувствительность. Универсальный набор для всех млекопитающих.
Применение: анализ неопознанных останков, преступления против дикой
природы, смешанные образцы
Человек
Собака
Бурый медведь
Nakamura et al. Int J Legal Med (2009) 123:177–184
Сравнение с референсной базой BOLD
3. Автоматизированный анализ в специализированных базах данных.
BOLD - Barcode Of Life Database - http://www.boldsystems.org/
Задача проекта – создание наиболее полного каталога всех видов планеты.
Используется участок 648 bp гена COI.
Собрано видов (2012):
животных: 114 098
растений: 39 730
грибов и др. 2 366
Идентификация лососевых –
микросателлитные маркеры
8 тетрануклеотидных маркеров
для идентификации 10 видов
лососевых
Локус
Структура повтора
OtsG68 (Williamson et al. 2002)
(TAGA)n
Ots102 (R J Nelson, T D Beacham 1998)
(GCCT)n(GTCT)n
One103 (Olsen et al. 2000)
(ATCT)nNn(ATCT)n
One109 (Olsen et al. 2000)
(TAGA)n
OMM1037 (Rexroad lll et al. 2002)
(GAAA)n
OMM1050 (Rexroad lll et al. 2002)
(GATA)nNn(GATA)nNn
(GATA)n
Oki10 (Smith et al. 1998)
(CTGT)n
Ssa197 (O’Reilly et al 1996)
(TG)n(TGAG)n
Животовский Л.А., Шайхаев Е.Г., Шитова М.В.
2013, Биология моря
(Курильский ЛРЗ, 2011г.)
Кета Гибриды
Горбуша
Таймень
Голец
Кунджа
Микижа
Сима
Чавыча
Кижуч
Нерка
Горбуша
Кета
Гибриды кеты и горбуши
Длины
аллелей
OMM1050 – идентификация гибридов
лососевых
139
—
1
—
—
—
—
—
—
—
—
144
—
—
—
—
—
—
—
1
1
—
152
—
—
1
—
1
—
—
—
—
—
155
1
—
—
—
—
—
—
—
—
1
160
—
—
—
0,167
—
—
—
—
—
—
161
—
—
—
—
—
—
0,291
—
—
—
164
—
—
—
0,833
—
—
—
—
—
—
169-173
—
—
—
—
—
—
0,547
—
—
—
177
—
—
—
—
—
0,025
0,128
—
—
—
185
—
—
—
—
—
—
0,035
—
—
—
205-317
—
—
—
—
—
0,975
—
—
—
—
Кижуч
М - Маркер молекулярной массы
1, 2 – Горбуша , 139 п.н.
3, 4 – Кета, 155 п.н.
5, 6 – Гибрид горбуши и кеты, 139, 155 п.н.
7, 8 – Кижуч, 160,164 п.н.
ДНК- идентификация животных
Методы, используемые для анализа ДНК человека:
Метод
Преимущества
Недостатки
Секвенирование мтДНК
Высокая чувствительность
Универсальные праймеры
Трудоемко, низкая
информативность,
проблемы со смесями
STR
Высокий
дискриминирующий
потенциал
Необходимы нулеотидные
последовательности
маркеров, информация о
уровне полиморфизма
RAPD
Низкая стоимость
Низкая воспроизводимость
RFLP
Низкая стоимость
Низкий дискриминирующий
потенциал
Оптимальная схема анализа:
1) Определение видовой принадлежности с помощью секвенирования мтДНК
2) Идентификация особи с использованием STR-маркеров.
Если нет информации о последовательностях – секвенирование мтДНК.
Случай незаконной охоты на диких
животных
Дело по факту незаконной охоты на диких животных (п. а ч.1 ст. 258 УК РФ):
326 образцов:
- 283 образца мышечной ткани;
- 4 образца волос с луковицами;
- 3 образца шкур (один лось, два бурых медведя);
- 36 образцов, собранных с вещественных доказательств (перчатки, топор,
смывы с вездехода и т.д.)
Задача:
1. Определить видовую принадлежность образцов, изъятых при осмотрах мест
происшествий;
2. Определить количество особей, которым принадлежат изъятые образцы;
3. Сравнить генотипы особей с генотипами на вещественных доказательствах
Работа проводилась совместно с
ООО «Центр Молекулярной Генетики», МГНЦ РАМН
Стратегия исследования и выбор
маркеров
Контрольные референсные образцы
в соответствии с рекомендациями ISFG:
10 образцов бурого медведя (Ursus arctos)
10 образцов лося (Alces alces)
предоставлены Институтом проблем экологии и эволюции им. А.Н. Северцова
РАН
Определение видовой принадлежности:
- анализ нуклеотидной последовательности участка гена цитохрома b мтДНК
позиции 1 - 402 п.н.;
- филогенетический анализ полученных последовательностей с привлечением
референсных образцов;
- поиск гомологии в GeneBank для образцов, не кластеризующихся с
референсными образцами.
Результаты анализа видовой
принадлежности
При анализе нуклеотидных последовательностей гена цитохрома b
выявлены гаплотипы следующих видов:
- лось (Alces alces) - 274 образца ;
- бурый медведь (Ursus arctos) - 18 образцов;
В кластерах с
референсными
образцами
- дикий кабан или домашняя свинья (Sus scrofa) - 1 образец ;
Определялись
через Blast
- корова (Bos taurus) – 3 образца;
- человек (Homo sapiens) – 6 образцов
Сиквенс
Выравнивание
Дерево
Sus scrofa
дикий кабан или домашняя свинья
- Один вид (Sus scrofa);
- Неразличимы на основе нуклеотидных последовательностей мтДНК гена
цитохром b;
Animaltype Pig – 11 STR + маркер пола
Бурый медведь (Ursus arctos)
выбор маркеров
Нуклеотидная последовательность генома
неизвестна.
Описаны только динуклеотидные маркеры.
Создан мультиплекс из 7 маркеров:
Маркер
Описание
Диапазон длин
амплифицированных
фрагментов (п.н.)
Mu10
STR-маркер, 2 bp
120-160
Mu50
STR-маркер, 2 bp
95-115
Mu59
STR-маркер, 2 bp
96-135
Mu23
STR-маркер, 2 bp
145-190
Mu51
STR-маркер, 2 bp
105-135
G10L
STR-маркер, 2 bp
150-200
SRY
пол-специфичный маркер
88
Andreassen et al., 2012, 13 динуклеотидных
маркеров
Лось (Alces alces) - выбор маркеров
Полиморфизм вида Alces alces в России
исследован слабо.
Обычно адаптируются маркеры, описанные
для коровы Bos taurus (разные семейства) ->
низкополиморфные маркеры.
Создан мультиплекс:
4 высокополиморфных динуклеотидных
STR-маркера и маркер пола,
Cervid 1 оказался мономорфным
Маркер
Описание
Диапазон длин
амплифицированных
фрагментов (п.н.)
BM6438
STR-маркер, 2 bp
250-300
Cervid1
STR-маркер, 2 bp
120-200
CSSM43
STR-маркер, 2 bp
240-300
BM1225
STR-маркер, 2 bp
220-280
SE
пол-специфичный маркер
225
Результаты STR-типирования
Бурый медведь (Ursus arctos)
- 10 разных генотипов в 10 референсных образцах:
мультиплекс пригоден для идентификации;
-в исследованных 18 образцах выявлено 2 генотипа (т.е.
минимум 2 особи);
- в связи с отсутствием популяционных данных невозможно
оценить вероятность случайного совпадения.
лось (Alces alces)
- 10 разных генотипов в 10 референсных образцах:
мультиплекс пригоден для идентификации;
- в исследованных 268 образцах выявлено 9 генотипов (т.е.
минимум 9 особей);
- в связи с отсутствием популяционных данных
невозможно оценить вероятность случайного совпадения.
Спасибо за внимание!
Владимир Орехов
ООО “ГОРДИЗ”
orekhov@gordiz.ru
моб: +7 (495) 799-38-72
офис: +7(495) 988-02-94
www.gordiz.ru
Документ
Категория
Презентации
Просмотров
9
Размер файла
4 470 Кб
Теги
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа