close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Раздел 8. Группоспецифическая химическая модификация

код для вставкиСкачать
CH3
N
Физическая химия биополимеров
Лаврик О.И.
НГУ-2012
O
8. Группоспецифическая химическая
модификация. Применение для
исследования структуры и функции
активных центров ферментов
Методы изучения структуры и функций
биополимеров и активных центров ферментов
Рентгеноструктурный анализ (РСА) –
основной на сегодняшний день метод
исследования структуры ферментов,
Сайт-направленный мутагенез,
Химическая модификация и ее более
специфический тип – аффинная
модификация,
Методы, основанные на применении
флуоресцентных и спиновых меток.
Подбор химических модифицирующих агентов
1. Высказывается предположение об аминокислотных
остатках, находящихся в активном центре фермента
или интересующем сайте,
2. Осуществляется подбор реагентов, специфичных к
определенным аминокислотам,
3. Исследуется ковалентное присоединение реагента к
белку и стехиометрия присоединения,
4. Определяется уровень инактивации фермента, как
следствие химического воздействия.
R
R
Схема химической модификации. Х – модифицируемый остаток
аминокислоты в активном центре, R – химический реагент.
Недостаток метода
Y
R
R
R Y
R
После реакции модификации:
• Входит ли модифицированный
аминокислотный остаток в активный
центр фермента?
• Важен ли он для активности фермента?
После реакции модификации:
Анализ образовавшихся продуктов
Гидролиз с помощью протеаз
Идентификация модифицированного остатка:
(разделение полученной смеси пептидов с помощью
электрофореза или хроматографических методов)
Двумерный электрофорез:
анализируемый пептид
вырезали из геля и
секвенировали по Эдману
Масс-спектрометрический
метод MALDI и его
различные разновидности
Влияние рК функциональных групп
биополимеров на их реакционную способность
Изменение рК боковых радикалов
аминокислотных остатков вследствие
их окружения в составе белков
является одним из главных факторов,
определяющих их реакционную
способность.
Например, большинство аминокислот
реагируют в непротонированной
форме, а значения рК для
фyнкциональных групп одинакового
строения, в зависимости от их
окружения в молекуле белка, могут
отличаться на 2 единицы.
Модификация остатка серина протеаз, R=-СН2ОН
Для модификации гистидина в активном центре протеаз:
BrCH2C(O)NH2
BrCH2COOH
ICH2COOH
Br-ацетамид
Br-уксусная кислота I-уксусная кислота
При рН 6-7 модификации подвергался остаток Ser, хотя при
таких значениях рН –ОН группы серина почти не гидролизуются.
Cерин изначально проявляет слабую нуклеофильность.
В растворе такая реакция не пойдет, а в активном центре
нуклеофильность серина существенно повышается при помощи
гистидина, оттягивающего на себя протон в паре Ser-His
Модификация остатка цистеина
I-уксусная кислота
Модификация остатка лизина
1-фтор-2,4-динитробензол
пиридоксаль-5’-фосфат
Модификация остатка аргинина
с помощью фенилглиоксаля
Модификация остатка тирозина
N-бромсукцинимид
Модификация остатка гистидина
диэтилпирокарбонат
Модификация биополимеров
бифункциональными реагентами
Реагенты, содержащие две модифицирующие группировки,
способны присоединяться к двум сближенным группам в
составе одного белка или молекулы нуклеиновой кислоты или
образовывать ковалентные связи с двумя молекулами
биополимеров.
Расстояние между функциональными группами,
подвергающимися модификации одной молекулой реагента,
ограничено его длиной. Поэтому исследование модификации с
помощью бифyнкциональных реагентов различной длины
позволяет получить информацию о взаимном расположении
различных функциональных групп в составе биополимеров,
макромолекул в сложных комплексах (рибосомы, хроматин) или
в клеточных структурах (например, белки в мембранах) или
даже об организации ферментных комплексов внутри живой
клетки.
Бифyнкциональные реагенты
Содержат две одинаковые
реакционноспособные группы
Модификация осуществляется
простой обработкой исследуемого
биополимера или
макромолекулярного комплекса
с помощью реагента
Гетерофункциональные
содержат две реакционноспособные
группы различной специфичности
Модификация осуществляется
последовательно
Реагент может быть
сначала присоединен к одной
из макромолекул. Затем
после помещения биополимера
в какие-то новые условия
проводится модификация
второй функциональной группой
Примеры бифункциональных реагентов
диимидоэфиры
1,5-дифтор-2,4-динитро-бензол
Пример гетерофункциональных реагентов
Реагенты содержат азидогруппы и группы,
специфично модифицирующие аминогруппы или SH-гpyппы
Первоначально можно присоединить эти реагенты к определенным
точкам в структуре белка за счет светонезависимых специфичных
реакций. Затем может быть проведена активация азидогрyпп
реагента. При этом будут происходить реакции в окрестности
модифицированной аминогрyппы или SH –группы.
Расщепляемые бифyнкциональные реагенты
Содержат между реакционноспособными группами специальную
структуру, которая позволяет расщепить реагент на две части после
проведения модификации. В качестве таких структур используют,
например, дисульфидную связь, которая может быть разрушена
окислением или восстановлением:
Или цис-гликольную группировку, которую можно разрушить
окислением перйодатом. При модификации диэпоксибутаном цисгликольная группировка возникает в реакции:
Документ
Категория
Презентации по химии
Просмотров
9
Размер файла
942 Кб
Теги
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа